Enzymatische Modifikation und Durchflusszytometrie-Bewertung von Proteinen, die auf der Hefeoberfläche angezeigt werden

Diese Forschung konzentriert sich auf die Untersuchung der chemischen Modifikationen von Proteinen, die bestimmen, wie sich Zellen verhalten. In diesem Fall geht es darum, die Präferenzen und die Kinetik von Enzymen zu verstehen, die eine Vielzahl von Substraten modifizieren.

Die Fähigkeit, ein Substratmolekül, das auf der Oberfläche von Hefe angezeigt wird, zu dephosphorylieren, wurde zum ersten Mal demonstriert. Diese Erkenntnis eröffnet Möglichkeiten für eine verallgemeinerbare kinetische Kartierung enzymatischer Modifikationen, die bisher nicht zugänglich waren. Diese Forschung befasst sich mit den Herausforderungen, die mit dem Verständnis von Enzymsubstratinteraktionen verbunden sind. In der Regel werden für diese Art der Bewertung Zelllysate oder kundenspezifische Peptide benötigt. Hier wird eine FasL-Alternative durch die Verwendung von Hefesubstraten bereitgestellt.

Dieses Protokoll verbessert die traditionelle Darstellung von Hefeoberflächen in Richtung der Analyse von normalerweise intrazellulären enzymatischen Reaktionen im extrazellulären Raum und ermöglicht die FasL-Analyse dieser normalerweise schwer zu beurteilenden Interaktionen.

Dieses Protokoll ermöglicht es, die Substratpräferenzen einer Vielzahl von Enzymen durch Hochdurchsatzmethoden abzufragen und kinetische Studien mit einem einfachen Auslesen durchzuführen.

[Dozent] Tauen Sie zu Beginn ein Aliquot der vorbereiteten Hefezellen auf Eis auf. Geben Sie 0,5 bis 1,5 Mikrogramm Plasmid-DNA, die das Hefedisplay-Konstrukt enthält, direkt in die Zellen. Fügen Sie dann 0,5 Milliliter entweder der Transformationslösung oder eines sterilen 50%igen Polyethylenglykols und einer 0,1 molaren Lithiumacetatlösung hinzu. Kombinieren Sie die Mischung aus Zellen, Plasmid-DNA und Transformationslösung durch Pipettieren. Inkubieren Sie das Transformationsgemisch 30 bis 60 Minuten lang statisch bei 30 Grad Celsius und wirbeln Sie das Gemisch in Abständen von 15 Minuten vortexen. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 1000 g. Bereiten Sie ein 14-Milliliter-Kulturröhrchen mit 4,5 Millilitern plasmidhaltigem Hefezellwachstum oder SDCAA-Medium vor. Die Zellen, die das gewünschte Plasmid enthalten, werden in 500 Mikrolitern SDCAA resuspendiert und die vorbereiteten 4,5 Milliliter Medium inokuliert. Verteilen Sie 50 Mikroliter der fünf Milliliter der inokulierten Kultur vorsichtig auf eine SDCAA-Platte, ohne die Schnecke zu durchstechen. 48 Stunden lang statisch bei 30 Grad Celsius inkubieren, um die Transformationseffizienz zu bestimmen. Inkubieren Sie nun die fünf Milliliter SDCAA-Zellkultur in einem Schüttelinkubator bei 30 Grad Celsius und 300 U/min für mindestens 18 Stunden. Überwachen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern nach 16 Stunden und wiederholen Sie den Vorgang nach 20 Stunden. Sobald die Probe eine optische Dichte von nicht mehr als sechs erreicht hat, wird die Kultur drei Minuten lang bei 2500 g zentrifugiert und der Überstand verworfen, ohne das Hefepellet zu stören. Suspendieren Sie das Hefepellet in der Induktion der Proteinexpression (SRGCAA-Medien) wieder auf eine endgültige optische Dichte von 600 Nanometern kleiner als eins. Inkubieren Sie die Hefekultur in einem Schüttelbrutator bei 30 Grad Celsius und 300 U/min für mindestens acht Stunden, jedoch nicht länger als 24 Stunden. Messen Sie dann die optische Dichte bei 600 Nanometern, um die Zelldichte zu bestimmen. Bereiten Sie den Arbeitspuffer für die Proben vor, indem Sie die 2-fache Arbeitspufferlösung im Verhältnis eins zu zwei mit deionisiertem Wasser in einem 1,7-Milliliter-Fläschchen verdünnen. Geben Sie für jede Probe das entsprechende Volumen der Hefekultur, das zur Rückgewinnung von zwei Millionen Hefezellen erforderlich ist, in das 1,7-Milliliter-Fläschchen. Zentrifugieren Sie das Fläschchen eine Minute lang bei 4500 g und entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Mikropipette und entsorgen Sie ihn als biologisch gefährlichen Abfall. Die pelletierten Zellen werden erneut in einem Milliliter PBSA suspendiert, bevor die Zentrifugation und die Entfernung des Überstands wiederholt werden. Lassen Sie es beiseite. Bereiten Sie die rekombinante humane SHP-2-Lösung in einer Endkonzentration von 1.000 Nanomol in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 Mikrolitern vor. Als nächstes fügen Sie 7,7 Milligramm DTT in 10 Milliliter deionisiertes Wasser in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen hinzu, um eine fünf Millimolare DTT-Lösung herzustellen. Nehmen Sie nun die pelletierten Zellen und suspendieren Sie sie wieder im Arbeitspuffer, so dass das endgültige Reaktionsvolumen 20 Mikroliter pro Probe beträgt. Jede Probe wird mit zwei Mikrolitern der fünf-millimolaren DTT-Lösung auf eine Endkonzentration von 0,5 Millimolar versorgt. Geben Sie das vorbereitete Volumen SHP-2 zu jeder Probe, um ein Endvolumen von 20 Mikrolitern zu erreichen, und mischen Sie vorsichtig mit einer Mikropipette. Umwickeln Sie die Deckel der Probenfläschchen mit Parafilm, um Leckagen oder Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Inkubieren Sie die Proben zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius auf einem Rotor bei konstanter Drehzahl. Nachdem Sie die Proben aus dem Rotor entnommen haben, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie jeder Probe einen Milliliter PBSA hinzufügen, bevor Sie sie erneut eine Minute lang zentrifugieren. Entsorgen Sie dann den Überstand. Die pelletierten Proben werden in einer 20-Mikroliter-Mischung der entsprechenden Primärreagenzien erneut suspendiert und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 20 Minuten zentrifugieren Sie die Proben eine Minute lang bei 4500 g und entsorgen Sie den Überstand als biologisch gefährlichen Abfall. Waschen Sie die Zellen einmal, indem Sie sie in einem Milliliter PBSA resuspendieren, bevor Sie die Zellen erneut zentrifugieren. Suspendieren Sie nun die Proben erneut in einer 20-Mikroliter-Mischung der entsprechenden Sekundärreagenzien und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang im Dunkeln. Nach dem Zentrifugieren der Proben und dem Verwerfen des Überstands werden die Zellen erneut mit PBSA gewaschen, bevor sie erneut zentrifugiert werden. Als nächstes werden die gewaschenen Proben in 300 bis 500 Mikrolitern PBSA resuspendiert und für die Durchflusszytometrie-Analyse in Fünf-Milliliter-Polystyrolröhrchen überführt. Nachdem Sie das Zytometer vorbereitet haben, klicken Sie auf Datei, gefolgt von der Schaltfläche Neues Experiment, benennen Sie das Experiment und klicken Sie auf Speichern, um sicherzustellen, dass die erfassten Daten im gewünschten Dateipfad gespeichert werden. Wählen Sie das Punktdiagramm-Symbol in der oberen Symbolleiste aus, um zwei oder mehr Punktdiagramme für jedes Beispiel zu erstellen. Stellen Sie für eines der Punktdiagramme sicher, dass der Name der X-Achse den FSCA-Kanal und der Name der Y-Achse den SSCA-Kanal anzeigt. Wählen Sie für ein weiteres Diagramm den Namen der x-Achse aus, um den Kanal anzuzeigen, in dem das sekundäre Reagenz, das auf den primären Anti-Epitop-Tag-Antikörper abzielt, fluoresziert, und den Namen der y-Achse, um den Kanal anzuzeigen, in dem das sekundäre Reagenz von Streptavidin fluoresziert. Geben Sie einen aussagekräftigen Namen für die Probe ein, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Röhrchen klicken, Name bearbeiten auswählen und den Probennamen eingeben. Setzen Sie jedes Probenröhrchen in die Halterung des Zytometers ein und klicken Sie auf Ausführen, um mit dem Laden der Probe und der Datenerfassung zu beginnen. Passen Sie Ereignisse, Zeit und Durchflussrate nach Bedarf an. Definieren Sie ein Tor, das die gesunden Hefezellen im Diagramm SSCA versus FSCA umgibt. Erfassen Sie dann die Fluoreszenz aller Kontrollproben. Definieren Sie eine Gating-Strategie für den erstellten Plot, bevor Sie die behandelten Proben analysieren. Zeichnen Sie die Fluoreszenz von dephosphorylierten Proben mit dem Zytometer und der Gating-Strategie auf, bevor Sie die Daten mit einer Durchflusszytometrie-Software analysieren. Bewerten Sie die Phosphorylierung durch Messung und Vergleich des Medians der Y-Achse von Zellen, die Protein auf ihrer Oberfläche exprimieren, und der Ausgangsphosphorylierung von nicht spielenden Zellen zwischen Proben und Kontrollen. Berechnen Sie abschließend die prozentuale mediane Phosphorylierungsdifferenz mit der bereitgestellten Formel. Die Wirkung unterschiedlicher SHP-2-Phosphatase-Konzentrationen und Inkubationszeiten auf den medianen Phosphorylierungsunterschied in Substraten auf der Hefeoberfläche ist in dieser Abbildung dargestellt. Die prozentuale mediane Phosphorylierungsdifferenz nahm im Laufe der Zeit über alle SHP-2-Konzentrationen hinweg ab, wobei die höchste Dephosphorylierung bei einer SHP-2-Konzentration von 1.000 nanomolaren nach vier Stunden beobachtet wurde. Nach zweistündiger Inkubation führte 1.000 nanomolare SHP-2 zu einem medianen Phosphorylierungsunterschied von etwa 48,8 %, was deutlich niedriger ist als die 750 nanomolare Bedingung zum gleichen Zeitpunkt. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der medianen Phosphorylierungsdifferenz beobachtet, wenn die Inkubation bei 500-nanomolaren, 750-nanomolaren und 1.000-nanomolaren SHP-2-Konzentrationen von zwei auf drei Stunden verlängert wurde.