Name: Enzymatische Modifikation und Durchflusszytometrie-Bewertung von Proteinen, die auf der Hefeoberfläche angezeigt werden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Erfahren Sie enzymatische Modifikation und Durchflusszytometrie-Bewertung von Proteinen auf der Hefeoberfläche. Diese Methode ermöglicht kinetische Analysen von Dephosphorylierung durch Tyrosinphosphatase SHP-2.

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1. Zellwachstum von Hefe, die Plasmide beherbergt, und Induktion der Proteinexpression
<ol>
	<li>Bereiten Sie nach dem in Tabelle 1 beschriebenen Rezept die Medien vor, die für das Wachstum von nicht-plasmidhaltiger Hefe (YPD), plasmidhaltiger Hefezellwachstum (SD-CAA) und die Induktion der Proteinexpression (SRG-CAA) sowie SD-CAA-Platten erforderlich sind.</li>
	<li>Transformieren Sie Hefe-Display-Plasmid-DNA, die das Kinase-Substrat-Paar enthält, in EBY-100-Hefezellen durch die auf Lithiumkationen basierende Methode30,31, die üblicherweise für die Verwendung in Hefetransformationskits einer Vielzahl von Herstellern verwendet wird. HINWEIS: Die Elektroporation32 oder andere bevorzugte Hefeplasmid-Transformationstechniken können je nach Plasmidkonstrukt, das transformiert wird, verwendet werden.</li>
	<li>Bereiten Sie ein 14-ml-Kulturröhrchen mit 10 mL YPD-Medien vor. Beimpfen Sie EBY-100-Zellen und züchten Sie sie in einem Schüttelinkubator bei 30 °C und 300 U/min, bis die Kultur eine optische Dichte (OD600 nm) von 0,8-1,0 (8 x 106- 1 x 107 Zellen/ml) erreicht. HINWEIS: OD600 nm wird gemessen, indem 3 ml-Probenküvetten mit 1:10-Verdünnungen von Hefekulturen in ihrem jeweiligen Medium und 3-ml-Blankoküvetten mit dem für die Probenverdünnung verwendeten Medium hergestellt werden. Das OD600-nm-Programm auf dem Spektralphotometer wird verwendet, um zuerst die leere Küvette und dann jede Probenküvette zu messen, indem die entsprechende Verdünnung für jede Probe eingestellt wird. 1 OD600nm entspricht 1 × 107 Hefe/ml.</li>
	<li>Ernten Sie die Zellen, indem Sie die Kultur 3 Minuten lang bei 1.000 x g zentrifugieren und mit der 1. Waschlösung im Hefetransformationskit oder TE (10 mM Tris-HCl und 1,0 mM EDTA)31 waschen.</li>
	<li>Pelletieren Sie die Zellen erneut bei 1.000 x g für 3 Minuten und resuspendieren Sie in 1 ml des im Hefetransformationskit enthaltenen Transformationspuffers oder in sterilem Wasser. Die Zellen sollten in 50 μL Aliquots aliquotiert werden und können bis zu 6 Monate bei -80 °C gelagert werden.</li>
	<li>Für die Plasmidtransformation wird ein Aliquot pro Plasmid hergestellt und auf Eis aufgetaut, dann werden 0,5-1,5 μg Plasmid-DNA, die das Hefe-Display-Konstrukt enthält, direkt in die Zellen gegeben. 0,5 ml der im Hefetransformationskit bereitgestellten Transformationslösung werden zugegeben, oder 0,5 ml eines sterilen 50%igen Polyethylenglykols und 0,1 M LiOAc-Lösung31. Kombinieren Sie die Mischung aus Zellen, Plasmid-DNA und Transformationslösung gründlich durch Pipettieren.</li>
	<li>Transformationsgemisch statisch für 30-60 min bei 30 °C inkubieren, Wirbelgemisch in Abständen von 15 min. Ernte der Zellen durch Zentrifugieren bei 1.000 × g für 3 min.</li>
	<li>Bereiten Sie ein 14-ml-Kulturröhrchen mit 4,5 mL SD-CAA-Medien vor. Resuspendieren Sie die Zellen, die das gewünschte Plasmid in 500 μl SD-CAA enthalten, und inokulieren Sie die vorbereiteten 4,5 mL.</li>
	<li>Achten Sie darauf, den Agar nicht zu durchstechen, verteilen Sie 50 μl der 5 ml der inokulierten Kultur auf eine SD-CAA-Platte und inkubieren Sie statisch bei 30 °C für 48 Stunden, um die Transformationseffizienz zu bestimmen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die 5 ml SD-CAA-Zellkultur in einem Schüttelinkubator bei 30 °C und 300 U/min für mindestens 18 Stunden. Überwachen Sie die optische Dichte (OD600nm) nach 16 h und 20 h. Sobald die Probe auf eine ausreichende optische Dichte von nicht mehr als 6 angewachsen ist, wird die Kultur 3 Minuten lang bei 2.500 × g zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Hefepellet zu stören.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Hefepellet in SRG-CAA auf einen End-ODvon 600 nm weniger als 1 (&lt;1 × 107 Hefe/ml).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Hefekultur in einem Schüttelbrutschrank bei 30 °C und 300 U/min für mindestens 8 h, jedoch nicht länger als 24 h. ANMERKUNG: Die Induktion der Proteinexpression in Hefezellen kann zwischen 20 und 37 °C variiert werden. 30 °C ist für die Synthese von Kinase/Substrat-Paarengeeignet 29,33, kann aber angepasst werden, wenn dies für die zu untersuchenden spezifischen Proteine als notwendig erachtet wird.</li>
	<li>Messen Sie OD600 nm , um die Zelldichte zu bestimmen. HINWEIS: Das Protokoll kann an dieser Stelle gestoppt werden, indem die Hefekulturen bei 4 °C gelagert werden.</li>
</ol>
2. Biotinylierung des 4G10-Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers
<ol>
	<li>Eine Durchstechflasche mit 2 mg PEG4-NHS-Biotin wird durch Zugabe von 680 μl sterilem PBS auf eine Endkonzentration von 5 mM resuspendiert. HINWEIS: Die Resuspension von PEG4-NHS-Biotin sollte unmittelbar vor der Biotinylierungsreaktion frisch erfolgen. NHS hydrolysiert in wässriger Lösung. Die Verwendung von sterilem PBS und Fläschchen ist wichtig für die Vorbereitung von Reagenzien für die Langzeitlagerung und für die Verwendung in zellbasierten Assays, um mögliche Auswirkungen von Kontaminanten auf die Lebensfähigkeit der Reagenzien oder die durchgeführten empfindlichen Assays zu mildern.</li>
	<li>Basierend auf der 4G10-Antikörperkonzentration 100 μg Antikörper in ein steriles 1,7-ml-Fläschchen geben.</li>
	<li>1 μl des vorbereiteten 5 mM PEG4-NHS-Biotin aus Schritt 2.1 in das Fläschchen mit den 100 μg 4G10-Antikörper geben, um ein molares Verhältnis von Biotin zu Antikörper von 7,5:1 zu erreichen. Pipettieren Sie die Mischung vorsichtig, um die Reaktion zu homogenisieren.</li>
	<li>Die Reaktion wird bei Raumtemperatur mit konstanter Rotation mindestens 2 h lang inkubiert.</li>
	<li>Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers für 0,5-ml-Spin-Entsalzungssäulen, um den Puffer vom biotinylierten 4G10 (B-4G10) in PBS auszutauschen. HINWEIS: Entsalzungssäulen mit einem Molekulargewichts-Cutoff (MWCO) von 7 kDa werden häufig für die Biotinylierung von Antikörpern verwendet, um die Entfernung von nicht umgesetztem Biotin und anderen kleinen Molekülen zu ermöglichen, während der größere Antikörper erhalten bleibt.</li>
	<li>Verdünnen Sie den B-4G10-Antikörper auf eine Endkonzentration von 1 μM in PBSA (PBS mit 1 g/l Rinderserumalbumin). Aliquotieren Sie den B-4G10-Antikörper in kleinere Volumina, um wiederholte Gefrier-/Auftauzyklen zu verhindern. HINWEIS: Biotinylierte Antikörper können bis zu 3 Monate lang bei 4 °C für den täglichen Gebrauch gelagert werden, ohne dass die Wirksamkeit wesentlich beeinträchtigt wird. Die restlichen Aliquote, die nicht verwendet werden, werden maximal 2 Jahre lang bei -20 °C gelagert.</li>
</ol>
3. Dephosphorylierung von Substraten, die auf der Oberfläche der Hefezellen exprimiert werden
<ol>
	<li>Bereiten Sie die 2x Arbeitspufferlösung vor, wie zuvor in der Literaturbeschrieben 34. HINWEIS: 2x wird empfohlen, um die Messung der benötigten Inhaltsstoffe zu erleichtern.</li>
	<li>Bereiten Sie den Arbeitspuffer für die Proben in einem 1,7-ml-Fläschchen vor, indem Sie die in Schritt 3.1 hergestellte 2x-Pufferlösung 1:2 in deionisiertem Wasser verdünnen. HINWEIS: Das Gesamtreaktionsvolumen für jede Probe beträgt 20 μl, und jede Probe benötigt zwischen 10 μl und 18 μl Arbeitspuffer. Bereiten Sie genügend Arbeitspuffer für alle Proben oder Kontrollen vor.</li>
	<li>Gemäß der in Tabelle 2 beschriebenen empfohlenen Probenvorbereitung beschriften Sie 1,7-ml-Fläschchen mit dem entsprechenden Kontroll- oder Probennamen.</li>
	<li>Auf der Grundlage des in Schritt 1.9 gemessenen OD600 nm ist das Kulturvolumen zu berechnen, das erforderlich ist, um für jede Probe zwei Millionen (2 × 106) Hefezellen aus der entsprechenden Hefekultur zu gewinnen.</li>
	<li>Geben Sie das im vorherigen Schritt berechnete Volumen der Hefekultur für jede Probe in das 1,7-ml-Fläschchen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Fläschchen 1 Minute lang bei 4.500 × g. Überstand vorsichtig mit einer Mikropipette entfernen und als biologisch gefährlichen Abfall entsorgen.</li>
	<li>Die pelletierten Zellen werden in 1 ml PBSA resuspendiert und Schritt 3.6 wiederholt. HINWEIS: Es ist wichtig, so viel Überstand wie möglich zu entfernen, ohne die pelletierten Zellen zu stören.</li>
	<li>Berechnen Sie auf der Grundlage seiner Stammkonzentration das Volumen des rekombinanten humanen SHP-2, das erforderlich ist, um eine Endkonzentration von 1.000 nM in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl zu erreichen. HINWEIS: Rekombinantes SHP-2 sollte in kleinen Volumina aliquotiert werden, so dass kein Protein, das in jedem Assay verwendet wird, mehr als zwei Gefrier-Auftau-Zyklen durchlaufen hat. Alle SHP-2-Reste eines Aliquots, nachdem alle Proben für einen Assay vorbereitet wurden, sollten verworfen werden. Die Stammkonzentrationen rekombinanter Enzyme können je nach Chargennummer variieren. Rekombinantes SHP-2 wird üblicherweise in einer Stammkonzentration von 0,2-0,4 mg/ml formuliert. Bei einer Stammkonzentration von 0,324 mg/mL SHP-2 entspricht dies einer Stammkonzentration von 4,696 μM (SHP-2 hat ein Molekulargewicht von 69 kDa). 4,26 μl des SHP-2-Stammes in einer 20-μl-Reaktion führen zu einer endgültigen Reaktionskonzentration von 1.000 nM SHP-2.</li>
	<li>7,7 mg DTT in 10 mL deionisiertes Wasser geben, das in einem konischen 15-ml-Wasser hergestellt wurde, um eine 5 mM DTT-Lösung herzustellen. Wenn das Wiegen von Milligramm aufgrund von Geräteeinschränkungen schwierig ist, fügen Sie 0,77 g DVB-T zu 10 ml deionisiertem Wasser hinzu und führen Sie dann eine 100-fache Verdünnung durch, um die für den Assay verwendete 5-mM-DVB-T-Lösung herzustellen. HINWEIS: Die DVB-T-Lösung kann in Stammlösungen mit höherer Konzentration hergestellt werden, um auf 5 mM verdünnt zu werden, wenn es mit den verfügbaren Geräten nicht möglich ist, Mengen im Milligramm-Maßstab zu messen. Die DTT-Lösung muss frisch vor der Resuspension der Zellen in einem Arbeitspuffer hergestellt werden, da sie zur Hydrolyse neigt und bei Verdünnung in Wasser über lange Zeiträume instabil ist.</li>
	<li>Die pelletierten Zellen werden in dem in Schritt 3.2 hergestellten Arbeitspuffer resuspendiert, so dass das endgültige Reaktionsvolumen in jeder Probe oder Kontrolle 20 μl beträgt. HINWEIS: Die Menge des zugegebenen Arbeitspuffers sollte auf der Grundlage der Menge an DTT (2 μl) und SHP-2 (berechnet in Schritt 3.8) berechnet werden, die in jeder Probe enthalten ist.</li>
	<li>2 μl der in Schritt 3.9 hergestellten 5 mM DTT-Lösung werden zu jeder Probe oder Kontrolle für eine endgültige Reaktionskonzentration von 0,5 mM DTT gegeben.</li>
	<li>Das in Schritt 3.8 berechnete SHP-2-Volumen wird zu jeder Probe hinzugefügt, um ein Endvolumen von 20 μl zu erhalten, und mit einer Mikropipette vorsichtig gemischt.</li>
	<li>Wickeln Sie die Deckel der Probenfläschchen in Parafilm ein, um ein Auslaufen oder Kreuzkontamination zu verhindern.</li>
	<li>Die Proben werden bei 37 °C für 2 h auf einem Rotor bei konstanter Drehzahl inkubiert.</li>
	<li>Entnehmen Sie die Proben aus dem Rotor und stoppen Sie die Reaktion, indem Sie jeder Probe 1 ml PBSA hinzufügen.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 3.6.</li>
</ol>
4. Zellmarkierung und durchflusszytometrische Analyse von dephosphorylierten Substraten
<ol>
	<li>Proben aus Schritt 3.16 werden in einer 20-μl-Mischung der entsprechenden Primärreagenzien resuspendiert, wie in Tabelle 2 beschrieben. Inkubieren Sie die Proben 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. HINWEIS: Alle verwendeten Reagenzkonzentrationen wurden so berechnet, dass sie in Bezug auf die Anzahl der Proteine, die auf der Oberfläche von Hefezellen exprimiert werden, über dem Niveau liegen. Die Berechnung geht von der Expression von 10.000 Proteinen/Zelle aus allen 2 x 106 Hefen in einer Probe35 aus, während dies routinemäßig nur ~50% von ihnen der Fall ist. Tabelle 3 zeigt das überschüssige Markierungsreagenzienverhältnis für jedes der in Tabelle 2 ausgedrückten Reagenzien, berechnet wie folgt: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68208/68208eq1v3.jpg" style="margin: auto;"></li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 4.500 × g für 1 min und entsorgen Sie den Überstand als biologisch gefährlichen Abfall.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen einmal, indem Sie sie in 1 ml PBSA resuspendieren. Wiederholen Sie Schritt 4.2.</li>
	<li>Die Proben werden in einer 20-μl-Mischung der entsprechenden Sekundärreagenzien resuspendiert, wie in Tabelle 2 beschrieben. Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang unter Lichteinfall.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 4.2.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 4.3.</li>
	<li>Die gewaschenen Proben werden in 300-500 μl PBSA resuspendiert und in 5 mL Polystyrolröhrchen überführt, um sie sofort mit einem geeigneten Durchflusszytometer zu analysieren. HINWEIS: Wenn Proben transportiert werden müssen, bewahren Sie sie auf nassem Eis auf. Es wird nicht empfohlen, aber die Proben können bei 4 °C für maximal 2 h als Nasspellets gelagert werden.</li>
	<li>Nachdem Sie den erforderlichen Start und die Vorbereitung des Zytometers für ein neues Experiment durchgeführt haben, klicken Sie im Menü Datei auf die Schaltfläche Neues Experiment, benennen Sie das Experiment und klicken Sie auf Speichern, um sicherzustellen, dass die erfassten Daten im gewünschten Dateipfad gespeichert werden.</li>
	<li>Wählen Sie das Punktdiagramm-Symbol in der oberen Symbolleiste aus, um zwei oder mehr Punktdiagramme für jedes auszuführende Muster zu erstellen. Wählen Sie für eines der Punktdiagramme den Namen der X-Achse aus, um den FSC-A-Kanal anzuzeigen, und den Namen der Y-Achse, um den SSC-A-Kanal anzuzeigen. Dieses Diagramm zeigt die Side Scatter - Area im Vergleich zur Forward Scatter - Area und wird verwendet, um Hefezellen für die weitere Analyse zu gaten.</li>
	<li>Wählen Sie in einem anderen Punktdiagramm den Namen der X-Achse aus, um den Kanal anzuzeigen, in dem das sekundäre Reagenz, das auf den primären Anti-Epitop-Tag-Antikörper abzielt, fluoresziert. Wählen Sie den Namen der Y-Achse aus, um den Kanal anzuzeigen, in dem das Sekundärreagenz von Streptavidin fluoresziert. Dieses Diagramm zeigt nur die Ereignisse, die von der Seite nach vorne als Hefezellen gesteuert werden, und wird verwendet, um die Tyrosinphosphorylierung auf der Y-Achse und die Expression der Substratoberfläche auf der X-Achse anzuzeigen. HINWEIS: In diesem Beispiel fluoresziert das Sekundärreagenz, das auf den primären Anti-Epitop-Tag-Antikörper abzielt, im FITC-Kanal (AF-488), und das Sekundärreagenz von Streptavidin fluoresziert im AF-647-Kanal. Die verwendeten Kanäle können je nach den primären und sekundären Reagenzien, die während der Markierung verwendet werden, variieren.</li>
	<li>Setzen Sie jedes Probenröhrchen in den Röhrchenhalter des Zytometers ein und wählen Sie Ausführen für das Zytometer, um mit dem Laden der Probe und der Datenerfassung zu beginnen. Passen Sie die anzuzeigenden Ereignisse, die aufzuzeichnenden Ereignisse, die aufzuzeichnende Zeit und die Abtastdurchflussrate nach Bedarf an.</li>
	<li>Definieren Sie ein Tor, das die gesunden Hefezellen im Diagramm SSC-A vs. FSC-A umgibt, das in Schritt 4.9 erstellt wurde. Abbildung 1 veranschaulicht eine beschreibende Darstellung der anzuwendenden Gating-Strategie. HINWEIS: Auf dem SSC-A- und FSC-A-Diagramm sind 100.000 anzuzeigende Ereignisse und 50.000 aufzuzeichnende Ereignisse innerhalb des definierten Hefegatters eine gute Richtlinie, um ausreichende Daten für die weitere Analyse zu visualisieren und zu sammeln. Strengere Gating-Strategien zur Selektion von Singulett-Hefe können auf der Grundlage eines Diagramms von Forward Scatter-Height versus Forward Scatter-Area angewendet werden, wie kürzlich berichtetwurde 36. Die in Abbildung 1 gezeigte Gating-Strategie entspricht einem weniger stringenten Ansatz, der Singulett- und etwas Dublett-Hefe durch Scatter-Gating umfasst.</li>
	<li>Aufzeichnung der Fluoreszenz aller Kontrollproben mit einem Durchflusszytometrie-Analysator. Zuerst werden routinemäßig Kontrollproben entnommen, um eine Gating-Strategie zu definieren, wie unten in Schritt 4.14 beschrieben.</li>
	<li>Definieren Sie eine Gating-Strategie für Ihre in Schritt 4.10 erstellte Parzelle vor der Analyse der behandelten Proben. Abbildung 1 veranschaulicht eine beschreibende Darstellung der anzuwendenden Gating-Strategie.</li>
	<li>Aufzeichnung der Fluoreszenz von dephosphorylierten Proben mit dem Durchflusszytometer und der in den Schritten 4.12 und 4.14 definierten Gating-Strategie.</li>
	<li>Analysieren Sie Durchflusszytometriedaten, die mit einer Durchflusszytometrie-Analysesoftware erfasst wurden.</li>
	<li>Bewertung der Dephosphorylierung durch Messung und Vergleich des Medians der Y-Achse von Zellen, die Proteine auf ihrer Oberfläche exprimieren, und der Phosphorylierung zu Studienbeginn, die von nicht anzeigenden Zellen zwischen Proben und Kontrollen bereitgestellt wird. Berechnen Sie die prozentuale mediane Phosphorylierungsdifferenz wie folgt: 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68208/68208eq2v5.jpg" style="margin: auto;"></li>
</ol>

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<li>Denard, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YESS+2.0%2C+a+tunable+platform+for+enzyme+evolution%2C+yields+highly+active+TEV+protease+variants%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">YESS 2.0, a tunable platform for enzyme evolution, yields highly active TEV protease variants.</a> ACS Synth Biol. 10 (1), 63-71 (2021).</li>
<li>Lim, S., Glasgow, J. E., Filsinger Interrante, M., Storm, E. M., Cochran, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+display+of+proteins+on+the+yeast+cell+surface+simplifies+quantification+of+binding+interactions+and+enzymatic+bioconjugation+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Dual display of proteins on the yeast cell surface simplifies quantification of binding interactions and enzymatic bioconjugation reactions.</a> Biotechnol J. 12 (5), (2017).</li>
<li>Yi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+TEV+protease+variants+by+yeast+ER+sequestration+screening+%28YESS%29+of+combinatorial+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (18), 7229-7234 (2013).</li>
<li>Yi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+endoplasmic+reticulum+sequestration+screening+for+the+engineering+of+proteases+from+libraries+expressed+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Yeast endoplasmic reticulum sequestration screening for the engineering of proteases from libraries expressed in yeast.</a> Methods Mol Biol. 1319, 81-93 (2015).</li>
<li>Semenza, J. C., Hardwick, K. G., Dean, N., Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERD2%2C+a+yeast+gene+required+for+the+receptor-mediated+retrieval+of+luminal+ER+proteins+from+the+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ERD2, a yeast gene required for the receptor-mediated retrieval of luminal ER proteins from the secretory pathway.</a> Cell. 61 (7), 1349-1357 (1990).</li>
<li>Mei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+aromatic+residue-controlled+protein+retention+in+the+endoplasmic+reticulum+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of aromatic residue-controlled protein retention in the endoplasmic reticulum of Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 292 (50), 20707-20719 (2017).</li>
<li>Ezagui, J., Russell, B., Mairena, Y., Stern, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+sequestration+empowers+phosphorylation+profiling+on+the+yeast+surface%5BTitle%5D)+AND+%22AIChE+J%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum sequestration empowers phosphorylation profiling on the yeast surface.</a> AIChE J. 68 (12), e17931(2022).</li>
<li>Kawai, S., Murata, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKawai%2C+S+%22Genetic+Transformation+Systems+in+Fungi%22">Genetic Transformation Systems in Fungi</a>. van den Berg, M. A., Maruthachalam, K. 1, Springer International Publishing. 187-192 (2015).</li>
<li>Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+other+fungi%3A+methods+and+possible+underlying+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism.</a> Bioeng Bugs. 1 (6), 395-403 (2010).</li>
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<li>Yarnall, M. T. N., Kim, S. H., Korntner, S., Bishop, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+the+SHP2+and+SHP1+protein+tyrosine+phosphatase+domains+by+a+non-conserved+%E2%80%9Cbackdoor%E2%80%9D+cysteine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Destabilization of the SHP2 and SHP1 protein tyrosine phosphatase domains by a non-conserved “backdoor” cysteine.</a> Biochem Biophys Rep. 32, 101370(2022).</li>
<li>Dustin, C. M., Heppner, D. E., Lin, M. J., van der Vliet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+tyrosine+kinase+signalling%3A+more+than+meets+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of tyrosine kinase signalling: more than meets the eye.</a> J Biochem. 167 (2), 151-163 (2020).</li>
<li>Stern, L. A., Csizmar, C. M., Woldring, D. R., Wagner, C. R., Hackel, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titratable+avidity+reduction+enhances+affinity+discrimination+in+mammalian+cellular+selections+of+yeast-displayed+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb+Sci%22%5BJournal%5D)">Titratable avidity reduction enhances affinity discrimination in mammalian cellular selections of yeast-displayed ligands.</a> ACS Comb Sci. 19 (5), 315-323 (2017).</li>
<li>Waldman, A. C., Rao, B. M., Keung, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+residue+specificities+of+epigenome+enzymes+by+yeast+surface+display%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping the residue specificities of epigenome enzymes by yeast surface display.</a> Cell Chem Biol. 28 (12), 1772-1779.e4 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 L Medienflaschen&nbsp;</td><td>Corning</td><td>06-414-1D</td><td></td></tr><tr><td>1,7/2,0 mL Mikroröhrchen</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>10 & Mikro; L SureOne Pipettenspitzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-438</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L SureOne Pipettenspitzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-408</td><td></td></tr><tr><td>12 mL Polystyrol-Rundbodenröhrchen</td><td>Greiner</td><td>07-000-212</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Kunststoffküvetten</td><td>MARKE</td><td>759076D</td><td></td></tr><tr><td>300 & micro; L SureOne Pipettenspitzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-411</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Serologische Pipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>Saures Kasein (Casaminosäuren)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1424-500</td><td></td></tr><tr><td>Analysenwaage&nbsp;</td><td>Mettler Toledo</td><td>30243397</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriologische Petrischale&nbsp;</td><td>Corning</td><td>Falcon 351008</td><td></td></tr><tr><td>Biosicherheitswerkbänke</td><td>Labconco</td><td>Logic Class II, Type A2&nbsp; 302310102</td><td></td></tr><tr><td>Biospektrometer</td><td>Eppendorf</td><td>Kinetic 6136000010</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Fisher Bioreagenzien</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>A940-500</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX Durchflusszytometrie Analysator&nbsp;</td><td>Beckam Coulter</td><td>Cytoflex C09745</td><td>CytExpert Software</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Fisher Bioreagenzien</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Ziegen FITC</td><td>Invitrogen</td><td>A16000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Alfa Aesar</td><td>H56165.30</td><td></td></tr><tr><td>Ez-Link PEG4-NHS-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39259</td><td></td></tr><tr><td>Frozen-EZ Hefetransformation II Kit&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>T2001</td><td></td></tr><tr><td>Galaktose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP656-500</td><td></td></tr><tr><td>Allzweck-Kühlschrank</td><td>Marvel Scientific</td><td>MS24RAS4RW</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Myc-Tag-Antikörper&nbsp;</td><td>Bethyl</td><td>A190-104A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroröhren-Zentrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5425 R 5406000313</td><td></td></tr><tr><td>Mini Niedertemperatur-Kühlbrutator</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-015-2632</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Phosphotyrosin-Antikörper 4G10</td><td>BioXcell</td><td>BE0194</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>M PM999</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Fisher Bioreagenzien</td><td>BP399-500</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten-Controller&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>easypet 3 4430000018</td><td></td></tr><tr><td>Raffinose</td><td>Thermo Scientific</td><td>J21060-36</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes aktives SHP-2 Protein</td><td>R& D Systems</td><td>1894-SH</td><td></td></tr><tr><td>Kühlzentrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5910 R</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae Hefe Oberflächendisplay Stamm EBY 100</td><td>ATCC</td><td>MYA-4941</td><td></td></tr><tr><td>Shaker Incubator</td><td>Eppendorf</td><td>M1335-0002 New Brunswick Innova 42&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Einkanal-Pipetten-Set&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>05-403-151</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat-Dihydrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisches Heptahydrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisches Monohydrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S468-500</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357</td><td></td></tr><tr><td>Top Loading Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris hydrochloride</td><td>EMD Millipore</td><td>648317-100GM</td><td></td></tr><tr><td>Tube Revolver Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-676-341</td><td></td></tr><tr><td>Wägepapier&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-898-12B</td><td></td></tr><tr><td>Hefe-Stickstoff-Basis</td><td>BD Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin-Entsalzungskolonnen&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>89883</td><td></td></tr></tbody></table>

enzymatische modifikation und durchflusszytometrie-bewertung von proteinen, die auf der hefeoberfläche angezeigt werden

Enzymatic Modification and Flow Cytometry Assessment of Yeast Surface Displayed Proteins

Die durchflusszytometrische Analyse eines einzelnen Replikats unseres Modellsystems, das 2 Stunden lang ohne (Abbildung 1A) und mit (Abbildung 1B) 1.000 nM SHP-2 inkubiert wurde, zeigt eine mediane Phosphorylierungsdifferenz von 63,6 %, die definiert ist als das Verhältnis des Medians der Y-Achse (Phosphorylierung) von allen an der Oberfläche angezeigten Ereignissen abzüglich des Phosphorylierungssignals zu Studienbeginn, definiert als der Median der Y-Achse der...

Enzymatische Modifikation und Durchflusszytometrie-Bewertung von Proteinen, die auf der Hefeoberfläche angezeigt werden

Yeast surface display is a genotype-phenotype linkage strategy that empowers high-throughput screening of protein function. Traditionally, yeast surface ...

enzymatic-modification-flow-cytometry-assessment-yeast-surface

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Ein robustes Konzept für die Lieferung von Organellen in den sauren Lumen der Hefe Vakuole für den Abbau und Recycling-Monitor beschrieben. Die Methode beruht auf der spezifischen Markierung von Zielorganellen mit einem genetisch kodierten Dual-Emissions-Fluoreszenz-pH-Biosensor und Visualisierung von einzelnen Zellen mittels Fluoreszenz-Mikroskopie.

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Zwei komplementäre Verfahren basierend auf Durchflusszytometrie und Mikroskopie vorgestellt, die die Quantifizierung auf der Ebene einer einzelnen Zelle, die Dynamik der Genexpression durch die Aktivierung eines MAPK-Weg in Hefe induziert ermöglichen.

Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen

Dieser Artikel beschreibt einen auf Hefewachstum basierenden Assay zur Bestimmung der genetischen Anforderungen für den Proteinabbau. Es demonstriert auch eine Methode zur schnellen Extraktion von Hefeproteinen, die sich für Western Blotting eignet, um die Abbauanforderungen biochemisch zu bestätigen. Diese Techniken können angepasst werden, um den Abbau einer Vielzahl von Proteinen zu überwachen.

Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Eine genaue Quantifizierung vesikulärer Transportereignisse liefert oft wichtige Einblicke in die Rolle bestimmter Proteine und die Auswirkungen von Mutationen. In diesem Artikel werden Methoden zur Verwendung von superekliptikem pHluorin, einer pH-sensitiven GFP-Variante, als Werkzeug zur Quantifizierung endozytärer Ereignisse in lebenden Zellen mittels quantitativer Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie vorgestellt.

Anwendungen von pHluorin für Quantitative, Kinetic und Hochdurchsatz-Analyse von Endozytose in Bäckerhefe

Proteinaggregation entlockt zellulären oxidativen Stress. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Überwachung der intrazellulären Staaten von Amyloidogenic Proteinen und den oxidativen Stress zugeordnet werden, mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Der Ansatz dient zur Untersuchung des Verhaltens von löslichen und Aggregation neigende Varianten des β-Amyloid Peptids.

Bewertung der Auswirkungen der Proteinaggregation auf zellulären oxidativen Stress in der Hefe

Dieser Artikel beschreibt ein FRET-basiertes Flow-Zytometrie-Protokoll zur Quantifizierung der Protein-Selbstmontage in s. cerevisiae- und HEK293T-Zellen.

Erkennung und Charakterisierung der Protein-Selbstmontage in Vivo durch Durchflusszytometrie

Dieses Protokoll beschreibt die wesentlichen Schritte für die Durchführung von Auswahlkampagnen für Hefeoberflächendisplays zur Anreicherung von Proteinvarianten, die an ein Antigen von Interesse binden.

Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay

Hier stellen wir ein Protokoll zur Quantifizierung des Post-Stress-Überlebens in Hefeproben vor. Der Assay verwendet zwei Fluoreszenzfarbstoffe, SYTO 9 und Propidiumiodid (PI), um die Integrität der Plasmamembran zu quantifizieren. Es verwendet Durchflusszytometrie, um quantitative und reproduzierbare Schätzungen der lebenden, toten und geschädigten Zellfraktionen für Proben mit postoxidativem Stress zu liefern.

Ein optimierter LIVE/DEAD-Assay in Verbindung mit Durchflusszytometrie zur Quantifizierung des Post-Stress-Überlebens in Hefezellen

In diesem Artikel beschreiben wir ein Verfahren unter Verwendung von Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie, um die Internalisierung von Polyanhydrid Nanopartikel oder Bakterien durch RAW 264.7-Zellen zu quantifizieren.

Die Analyse der zellulären Internalisierung Nanopartikel und Bakterien durch Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie

Erfahren Sie enzymatische Modifikation und Durchflusszytometrie-Bewertung von Proteinen auf der Hefeoberfläche. Diese Methode ermöglicht kinetische Analysen von Dephosphorylierung durch Tyrosinphosphatase SHP-2.

Enzymatische Modifikation und Durchflusszytometrie-Bewertung von Proteinen, die auf der Hefeoberfläche angezeigt werden

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