Identifizierung von Mycobacterium-Spezies mittels DNA-Microarray-Chip-Methode

[Erzähler] Der Schwerpunkt dieser Forschung liegt auf der molekularen Diagnostik in der klinischen Mikrobiologie. Im Vergleich zu herkömmlichen Nachweismethoden ist die DNA-Microarray-Chip-Methode zur Identifizierung von Mykobakterienarten hochsensitiv, spezifisch und schnell, was eine wichtige Hilfe für die Frühdiagnose klinischer Patienten sein kann. Derzeit sind Schnellidentifizierungsmethoden für nicht-tuberkulöse Mykobakterien in vielen Basislabors begrenzt, was sich direkt auf die klinische Diagnose und Behandlung der Patienten auswirkt. Stellen Sie zu Beginn die Temperatur des Wasserbads mit konstanter Temperatur auf 50 Grad Celsius ein und heizen Sie es vor. Um die Chips vorzubereiten, geben Sie 200 Mikroliter destilliertes Wasser auf den Boden der Gen-Microarray-Chip-Hybridisierungsbox. Platzieren Sie die Halterung zwischen den beiden Positionierungssäulen im Inneren des Kastens. Platzieren Sie den Chip vorsichtig mit der Vorderseite nach oben auf der Halterung und decken Sie ihn mit dem Deckglas ab, so dass die vier Naben nach unten zeigen, wobei Sie sicherstellen, dass das Ende des Deckglases mit dem Etikett am Ende des Chips ausgerichtet ist. Bereiten Sie anschließend 200-Mikroliter-Zentrifugenröhrchen oder acht Well-Streifen entsprechend der Anzahl der Proben vor und beschriften Sie sie ordnungsgemäß. Erhitzen Sie den Hybridisierungspuffer aus dem Kit auf 50 Grad Celsius, bis er vollständig geschmolzen ist. Nach gründlichem Mischen in einer Mikrozentrifuge schnell zentrifugieren. Aliquotieren Sie neun Mikroliter Hybridisierungspuffer in jedes vorbereitete Röhrchen oder jeden Streifen. Geben Sie sechs Mikroliter des entsprechenden PCR-Produkts in jedes Röhrchen, so dass ein Endvolumen von 15 Mikrolitern pro Reaktionsgemisch entsteht. Erhitzen Sie das Gemisch der Hybridisierungsreaktion fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius, um es mit einem PCR-Instrument oder einem Wasserbad zu denaturieren. Tauchen Sie die Mischung nach der Denaturierungsbehandlung sofort in eine Eiswassermischung und inkubieren Sie sie drei Minuten lang. Nehmen Sie das Hybridisierungsreaktionsgemisch aus dem Eisbad und mischen Sie es, indem Sie es zweimal auf und ab pipettieren. Wenn kein weißer Flockungsniederschlag mehr übrig ist, werden 13,5 Mikroliter des Reaktionsgemisches durch das Ladeloch des Deckglases zugegeben. Decken Sie die Hybridisierungsbox schnell ab und versiegeln Sie sie und notieren Sie die Chipnummer, die Microarray-Position und die Probennummer. Legen Sie nun die verschlossenen Hybridisierungsboxen waagerecht in das auf 50 Grad Celsius vorgeheizte Wasserbad mit konstanter Temperatur. Nachdem Sie alle Boxen hineingelegt haben, starten Sie den Timer für 120 Minuten. Nachdem die Hybridisierungsreaktion abgeschlossen ist, nehmen Sie die Hybridisierungsboxen horizontal heraus, zerlegen Sie sie und holen Sie die Chips heraus. Legen Sie die Chips sofort auf den Schieber in einen Behälter, der mit Chip Washing Solution I gefüllt ist, der auf Raumtemperatur ausgeglichen wurde, und waschen Sie sie bei 80 bis 100 U/min auf einem Schüttler mit konstanter Temperatur für drei Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Chips erneut mit Chip Washing Solution II auf dem auf 80 bis 100 U/min eingestellten Shaker für drei Minuten bei Raumtemperatur. Nun die Chips in eine Zentrifuge geben und bei 100 g fünf Minuten bei Zimmertemperatur schleudern. Schalten Sie den Scanner ein. Öffnen Sie dann die entsprechende Software. Klicken Sie auf die Schaltfläche Lasersteuerung, um es 10 Minuten lang vorheizen zu lassen. Geben Sie probenbezogene Informationen in die Software ein. Nachdem der Scanner mit dem Vorheizen fertig ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Auswerfen. Legen Sie den getrockneten Span gleichmäßig auf das kleine Halterungsstück. Schieben Sie den Chip vorsichtig und horizontal in das Scannerfach und klicken Sie auf die Schaltfläche Laden. Geben Sie nun die Chipnummer in die Software ein und klicken Sie, um den Erfassungsbereich Microarray 1 bis 4 auszuwählen. Klicken Sie auf Probe auswählen, um die entsprechenden Proben für jeden Microarray auszuwählen. Klicken Sie dann auf Erkennung starten, um den Chip-Scan zu starten. Die Scanergebnisse werden auf dem Bildschirm angezeigt und automatisch gespeichert. Verwenden Sie die Seite für Datenabfragen, um Datenabfragen und Druckvorgänge durchzuführen. Nachdem Sie alle Vorgänge abgeschlossen haben, schalten Sie den Laser aus, beenden Sie die Software und schalten Sie schließlich den Scanner aus. Die Validität der Versuchsergebnisse wird durch die Qualitätskontrolle bestätigt, wobei die Positivkontrolle ein Nachweisergebnis des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes und die Negativkontrolle kein Mycobacterium ergibt. Die Interpretation von Testproben beginnt mit Fällen, in denen alle Sonden, einschließlich der Sonde mit dem höchsten Signalwert, negativ sind, was zu einem Bericht über kein Mykobakterium führt. In Proben, bei denen nur die Sonde des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes ein starkes Signal zeigt, wird das Ergebnis für diese Artengruppe als positiv identifiziert. Wenn die Sonde, die Mycobacterium avium entspricht, die einzige mit einem starken Signal ist, wird die Probe als positiv für Mycobacterium avium identifiziert. Wenn nur die interne Kontrollsonde positiv und alle anderen negativ sind, wird das Ergebnis als unbestimmt gemeldet, was auf das Vorhandensein einer Mycobacterium-Spezies hinweist, die nicht im Nachweiskit enthalten ist.