Intrazelluläre Phosphoflow-Zytometrie von Xenotransplantaten bei akuter myeloischer Leukämie

Unsere Forschung zielt darauf ab, zu verstehen, wie akute myeloische Leukämie Resistenzen gegen zugelassene Therapien entwickelt. Basierend auf der Hypothese, dass der Stoffwechsel eine Schlüsselrolle spielt. Das ultimative Ziel ist es, eine Strategie zu finden, die diesen Widerstand effektiv überwinden kann. Die Durchflusszytometrie, die in der Leukämieforschung weit verbreitet ist, ist ideal für die Analyse von Suspensionszellen wie Leukämiezellen. Seine Anpassungsfähigkeit macht es zu einem leistungsstarken Werkzeug für molekulare Datenmechanismen. Die größte experimentelle Herausforderung in der AML-Forschung besteht darin, ein optimales In-vivo-Protokoll für die molekulare Wiederbelebung zu entwickeln, d. h. Zellen für eine genaue Modellierung, um den Mechanismus zu verstehen, der der Resistenz von Therapeutika zugrunde liegt.

[Erzähler] Beugen Sie zunächst das Knie der Maus und verwenden Sie die nicht dominante Hand, um das Bein zu immobilisieren, um die Gelenkfläche des Femurs freizulegen, wo sich die Einstichseite befindet. Lege den Daumen auf das Schienbein, den Zeigefinger auf den Oberschenkelknochen und den Mittelfinger auf die Außenseite der Knochen, um sie zu stabilisieren. Während die Ruhigstellung aufrechterhalten wird, desinfizieren Sie den Kniebereich mit Isopropylalkohol, um verbleibende Haare zur Seite zu entfernen und die Visualisierung der Knochenstruktur zu verbessern. Positionieren Sie die Nadel mit der ersten trockenen 25-Gauge-Spritze in der Mitte des Femurgelenks und drehen Sie sie vorsichtig, um ein Loch in der Femurgelenksoberfläche zu erzeugen, ohne Kraft auszuüben. Sobald die Nadel in das Knochenmark eindringt, ziehen Sie die Spritze allmählich zurück, während Sie sie drehen. Führen Sie die zweite gespülte Spritze in das Loch ein, das durch die erste Nadel entstanden ist. Üben Sie ein Vakuum auf die zweite Spritze aus, die in den Oberschenkelknochen eingeführt wird, während Sie sie sanft drehen und allmählich zurückziehen. Übertragen Sie das extrahierte Knochenmark, indem Sie den Spritzeninhalt in ein gekühltes Mikrozentrifugenröhrchen spülen, das 500 Mikroliter PBS enthält. Bewahren Sie die Probe auf Eis auf. Üben Sie mit einem Isopropanol-Tupfer 30 Sekunden lang sanften Druck auf die Einstichstelle aus, um Blutungen zu stoppen. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 g bei vier Grad Celsius. Mit einem Vakuum-Absaugsystem wird der Überstand vorsichtig abgesaugt und entsorgt. Fügen Sie 200 Mikroliter pro Probe fluoreszierender Zellfärbelösung hinzu. Verdünnt eins auf 100 in PBS, um die abgestorbenen Zellen zu markieren. Suspendieren Sie die Zellen vorsichtig wieder mit einer Pipette. Anschließend werden die Zellen 10 Minuten lang lichtgeschützt auf Eis inkubiert. Nach 10 Minuten zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 g bei vier Grad Celsius. Aspirieren und verwerfen Sie den Überstand mit einem Vakuumsystem, fügen Sie 100 Mikroliter HCD 45 Brilliant ultraviolet 395 Antikörper pro Probe hinzu, verdünnt auf eins bis 100 in PBS mit 2 % fötalem Rinderserum, um menschliche hämatopoetische Zellen zu markieren. Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang auf Eis und stellen Sie sicher, dass sie vor Licht geschützt sind. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 g bei vier Grad Celsius. Der Überstand wird mit einem Vakuumsystem abgesaugt und entsorgt. Suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter 1,6%igem Formaldehyd in PBS-Lösung. 10 Minuten bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubieren. Nach 10 Minuten zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 g bei vier Grad Celsius. Der Überstand wird mit einem Vakuumsystem abgesaugt und entsorgt. Geben Sie nun einen Milliliter 100% Methanol, vorgekühlt bei minus 20 Grad Celsius, direkt in die beiden. Inkubieren Sie die Proben bei minus 20 Grad Celsius für 30 Minuten lichtgeschützt. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 g bei vier Grad Celsius. Den Überstand mit einem Vakuumsystem ansaugen und entsorgen. Geben Sie 50 Mikroliter Antikörper-Mischlösung oder Isotyp-Kontroll-Mischlösung zu jeder Probe. Suspendieren Sie die Zellen vorsichtig mit einer Pipette und inkubieren Sie alle Proben über Nacht bei vier Grad Celsius, um sicherzustellen, dass sie vor Licht geschützt sind. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 G bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, waschen Sie die Zellen mit 1000 Mikrolitern PBS, indem Sie sie vorsichtig mit einer Pipette wieder suspendieren. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut bei 500 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, führen Sie eine zweite Wäsche mit 1000 Mikrolitern PBS durch und suspendieren Sie die Zellen vorsichtig wieder mit einer Pipette, bevor Sie die Zellen erneut bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach dem Aspirieren des Überstands werden die endgültigen Proben in 200 Mikrolitern PBS erneut suspendiert. Diese Abbildung veranschaulicht den Arbeitsablauf, die Gating-Strategie und die Normalisierung intrazellulärer Phosphoproteinsignale in Knochenmarkzellen von Xenotransplantatmäusen mit akuter myeloischer Leukämie, die 15 Tage lang mit einer Venetoclax-basierten Therapie behandelt wurden. Die Gating-Strategie identifizierte erfolgreich lebensfähige humane akute myeloische Leukämie oder AML-Zellen auf der Grundlage von Vorwärts- und Seitenstreuprofilen und CD45-Positivität, was eine konsistente Analyse über alle Behandlungsgruppen hinweg ermöglichte. Die Behandlung mit Venetoclax 5-Azacitidin und CDZ Uridin führte zu einer erhöhten Phosphorylierung von STAT5 und RPS6 in AML-Zellen, was auf eine Aktivierung der mit Resistenz verbundenen Überlebenswege hindeutet. Interessanterweise reduzierte die Behandlung der Mäuse bei der Behandlung mit Gilteritinib die Phosphorylierung der FLT3-Signalwegproteine nicht signifikant, was darauf hindeutet, dass die Signalübertragung trotz gezielter Therapie bestehen blieb. Phosphoryliertes STAT5 und phosphoryliertes RPS6 zeigten den stärksten Anstieg der Korrelation der Expressionsniveaus nach einer Venetoclax-basierten Therapie, was auf eine Koaktivierung dieser Signalwege hinweist.