Name: Intrazelluläre Phosphoflow-Zytometrie von Xenotransplantaten bei akuter myeloischer Leukämie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T15:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Lernen Sie die Phosphoflow-Zytometrie zur Analyse von Signalwegen in akuter myeloischer Leukämie. Diese Methode ermöglicht die hochsensitive Messung phosphorylierter Proteine in Xenotransplantaten.

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<ol><li>Ferrara, F., Schiffer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myeloid+leukaemia+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Acute myeloid leukaemia in adults.</a> Lancet. 381 (9865), 484-495 (2013).</li>
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<li>Sung, P. J., Sugita, M., Koblish, H., Perl, A. E., Carroll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+cytokines+mediate+resistance+to+targeted+therapy+in+FLT3-ITD+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic cytokines mediate resistance to targeted therapy in FLT3-ITD acute myeloid leukemia.</a> Blood Adv. 3 (7), 1061-1072 (2019).</li>
<li>Song, P., Yang, F., Jin, H., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+protein+translation+and+its+implications+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">The regulation of protein translation and its implications for cancer.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 68(2021).</li>
<li>This Standard Operating Procedure (SOP) describes methods for anesthetizing mice. , McGill University. 
 <a target="_blank" href="https://www.mcgill.ca/research/files/research/110-mouse_anesthesia-2024-06-17.pdf">https://www.mcgill.ca/research/files/research/110-mouse_anesthesia-2024-06-17.pdf</a> (2024).</li>
<li>Tech Team Tips: Preparing a Sample with AO/PI. , DeNovix. 
 <a target="_blank" href="https://www.denovix.com/webinars/tech-team-tips-preparing-a-sample-with-ao-pi">https://www.denovix.com/webinars/tech-team-tips-preparing-a-sample-with-ao-pi</a> (2021).</li>
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<li>Krutzik, P. O., Irish, J. M., Nolan, G. P., Perez, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+phosphorylation+and+cellular+signaling+events+by+flow+cytometry%3A+techniques+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein phosphorylation and cellular signaling events by flow cytometry: techniques and clinical applications.</a> Clin Immunol. 110 (3), 206-221 (2004).</li>
<li>Chen, W., Luu, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+by+multiparameter+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping by multiparameter flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1633, 51-73 (2017).</li>
<li>Perez, O. D., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-proteomic+immune+analysis+by+flow+cytometry%3A+From+mechanism+to+translational+medicine+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Phospho-proteomic immune analysis by flow cytometry: From mechanism to translational medicine at the single-cell level.</a> Immunol Rev. 210, 208-228 (2006).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 mL Spritzen 25G x 5/8 TW&nbsp;</td><td>BD Biowissenschaften</td><td>#309626</td><td>Spritzen für die Knochenmarkabsaugung</td></tr><tr><td>1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>FroggaBio</td><td>#LMCT1,7 Mrd.</td><td>Aliquotierung der durch Knochenmarkaspiration gewonnenen Zellen</td></tr><tr><td>BD Horizon Brilliant Fleckenpuffer</td><td>BD Biowissenschaften</td><td>#563794</td><td>Für Färbeprozesse</td></tr><tr><td>Buprenorphin</td><td>Fidelis Tiergesundheit</td><td>Ethiqa XR</td><td>Analgesie für Mäuse</td></tr><tr><td>CellDrop FL Unbegrenzt</td><td>FroggaBio</td><td>#CellDrop FL- UNLTD</td><td>Für die Zellzahl</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Wisent Inc.</td><td>#311-425-CL</td><td>Medien für Zellen, die durch Knochenmarkaspiration gewonnen werden</td></tr><tr><td>Eppendorf Zentrifuge 5427 R</td><td>Millipore Sigma</td><td>#EP5429000260</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum Hitzeinaktiviert Premium CA</td><td>Wisent Inc.</td><td>#090-450</td><td>Für Färbeprozesse</td></tr><tr><td>Formaldehyd-Lösung</td><td>Millipore Sigma</td><td>#F1635</td><td>Permeabilisierung der Zellen</td></tr><tr><td>humanCD45 [HI30] Antikörper&nbsp;</td><td>BD Biowissenschaften</td><td>#563792</td><td>Antikörper gekoppelt mit BUV395</td></tr><tr><td>ID7000 Spektraler Zellanalysator</td><td>Sony</td><td></td><td>Spektraler Durchflusszytometer-Analysator</td></tr><tr><td>Isofluran 99,9% flüssig</td><td>Mckesson</td><td>#803250</td><td>Anästhesie für Mäuse</td></tr><tr><td>Isospire (Isofluran) Inhalations-Anästhetikum</td><td>Dechra</td><td></td><td>Anästhesie für Mäuse</td></tr><tr><td>Lebende/tote AO/PI</td><td>FroggaBio</td><td>CD-AO/PI-1.5</td><td>Für die Zellzahl</td></tr><tr><td>Lebende/tote Zombie-NIR</td><td>BioLegend+B6:C12</td><td>#423106</td><td>Für die spektrale Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Methanol-Lösung</td><td>Millipore Sigma</td><td>#179957</td><td>Fixierung der Zellen</td></tr><tr><td>P-4EBP1 (Thr37/46) [236B4] Antikörper</td><td>Zell-Signaltechnik</td><td>#2846</td><td>Antikörper gekoppelt mit Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>p-Erk1/2 (Thr202/Tyr204) [197G2]-Antikörper</td><td>Zell-Signaltechnik</td><td>#13148</td><td>Antikörper gekoppelt mit Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>p-RPS6 (Ser240/244) [D68F8] Antikörper</td><td>Zell-Signaltechnik</td><td>#9468</td><td>Antikörper gekoppelt mit Alexa Fluor 594</td></tr><tr><td>p-STAT5 (Tyr694) [D47E7] Antikörper</td><td>Zell-Signaltechnik</td><td>#14603</td><td>Antikörper gekoppelt mit PE</td></tr><tr><td>Kaninchen-IgG-Steuerung [DA1E]</td><td>Zell-Signaltechnik</td><td>#2975</td><td>Antikörper gekoppelt mit Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Kaninchen-IgG-Steuerung [DA1E]</td><td>Zell-Signaltechnik</td><td>#2985</td><td>Antikörper gekoppelt mit Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>Kaninchen-IgG-Steuerung [DA1E]</td><td>Zell-Signaltechnik</td><td>#8760</td><td>Antikörper gekoppelt mit Alexa Fluor 594</td></tr><tr><td>Kaninchen-IgG-Steuerung [DA1E]</td><td>Zell-Signaltechnik</td><td>#5742S</td><td>Antikörper gekoppelt mit PE</td></tr><tr><td>Desinfektionstücher</td><td>Vereinigtes Kanada</td><td>#UCDWPR-9022</td><td>Desinfektion bei Knochenmarkpunktion</td></tr></tbody></table>

intrazelluläre phosphoflow-zytometrie von xenotransplantaten bei akuter myeloischer leukämie

Intracellular Phosphoflow Cytometry of Acute Myeloid Leukemia Patient-Derived Xenotransplants

Das Versuchsdesign zielt darauf ab, den Phosphorylierungszustand ausgewählter Proteine von Interesse zu verschiedenen Zeitpunkten zu überwachen, z. B. 1 Tag vor Beginn der Behandlung und 15 Tage nach Beginn der Behandlung. Diese Baseline dient als kritische Kontrolle, um die Richtigkeit nachfolgender Veränderungen in der Aktivierung des Signalwegs nach der Behandlung zu überprüfen. Nach fünfzehn Tagen Behandlung wird ein zweiter Vergleich durchgeführt, um die Signalwegmodulation bei behandelten Mäusen im Vergleich zu Vehikel-behandelten Kontrollen zu bewerten (Abbildung 4). Dieser zweistufige Ansatz ermöglicht die Unterscheidung von behandlungsinduzierten Effekten von der Variabilität der Ausgangswerte.
Für diese Studie wurde ein AML-PDX-Mausmodell verwendet. Den Mäusen wurden patienteneigene AML-Zellen transplantiert, die durch die folgenden Mutationen gekennzeichnet waren: DNMT3AMR882H mit einer varianten Allelfraktion (VAF) von 48 %, NPM1W288fs VAF 36 %, FLT3ITD VAF 10 % und IDH2R140Q VAF 44 %. Nach der Transplantation wurden drei Wochen Zeit für das Tumorwachstum eingeräumt, bevor mit der Behandlung begonnen wurde. Die mit FLT3-Mutanten transplantierten PDX-Mäuse wurden fünfzehn Tage lang mit einem von drei Schemata behandelt: Placebo, Golderitinib (15 mg/kg täglich) oder eine Kombination aus Venetoclax (50 mg/kg täglich), 5-Azacitidin (2,5 mg/kg täglich) und Cedarizudin (3 mg/kg täglich) (Abbildung 4A).
In Bezug auf die erzielten Ergebnisse ist es erwähnenswert, dass die Behandlung mit einem Venetoclax-basierten Schema zu einer signifikant erhöhten STAT5- und RPS6-Phosphorylierung führte, was darauf hindeutet, dass diese Signalwege zur Therapieresistenz beitragen (Abbildung 4E). Im Gegensatz dazu reduzierte gilteritinib, ein Medikament, das auf FLT3 abzielt, den Phosphorylierungsstatus mutierter FLT3-Effektoren nicht. Es ist möglich, dass in der getesteten AML-Probe das Vorhandensein zusätzlicher sekundärer Mutationen neben FLT3-ITD (z. B. IDH2) zur Aktivierung dieser Signalwege beiträgt oder dass die medikamentöse Behandlung über zwei Wochen zu einer selektiven Eliminierung von AML-Zellen mit verminderter Signalübertragung führt. Da alle analysierten Phosphoproteine aus der gleichen Zellpopulation stammen, ist es möglich, die Phosphoproteinaktivierung zu vergleichen. In diesem Experiment scheint die stärkste Korrelation bei der Phosphoproteinfärbung zwischen p-STAT5 und p-RPS6 zu bestehen (Ergänzende Abbildung 1A), die beide in dieser Versuchsgruppe nach der Behandlung hochreguliert sind (Abbildung 4E). Es scheint eine geringere Beziehung zwischen p-STAT5 und p-ERK zu geben (Ergänzende Abbildung 1B). Wichtig ist, dass die Zellgröße (gemessen mit FSC-A) keinen wesentlichen Beitrag zur Gesamtpositivität von p-STAT5 leistet, was unterstreicht, dass die Positivität der Färbung nicht nur ein Produkt der Zellgröße ist (Ergänzende Abbildung 1C). Dieser experimentelle Rahmen ermöglicht eine umfassende Bewertung der Auswirkungen dieser Behandlungen auf die Modulation des Signalwegs.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Visualisierung der Zielsignalwege und der Strategie zu deren Analyse. (A) Überblick über die Signalwege, an denen p-STAT5 (Tyr694), p-4EBP1 (Thr37/46), p-RPS6 (Ser240/244) und p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) beteiligt sind. Im p-STAT5-Signalweg durchläuft JAK eine Autophosphorylierung, die seine katalytische Aktivität erhöht, dann phosphoryliert es spezifische Tyrosinreste und schafft Andockstellen für STAT-Proteine. Phosphoryliertes STAT5 (Tyr694) homodimerisiert und transloziert in den Zellkern, wo es an spezifische STAT-responsive Elemente in den Promotorregionen der Zielgene bindet. In der RAS-RAF-MEK-ERK-Kaskade führt die Autophosphorylierung des FLT3-Rezeptors oder anderer Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTKs) bei der Ligandenbindung zum Austausch von GDP gegen GTP auf RAS, wodurch RAS aktiviert wird. Aktiviertes RAS-GTP rekrutiert RAF an die Plasmamembran, wo RAF eine Konformationsänderung durchläuft und aktiv wird. RAF phosphoryliert und aktiviert dann MEK1/2, eine Kinase mit doppelter Spezifität, die wiederum ERK an Thr202/Tyr204-Resten phosphoryliert. Aktiviertes ERK1/2 transloziert in den Zellkern, wo es spezifische Transkriptionsfaktoren phosphoryliert. ERK1/2 ist auch in der Lage, über intermediäre Signalwege die mTORC1-Aktivität zu erhöhen und eIF4E an bestimmten Stellen zu phosphorylieren, um die Translationsaktivität zu erhöhen. mTORC1 wird durch Nährstoffe und Wachstumsfaktoren durch FLT3 und andere RTKs aktiviert und phosphoryliert nachgeschaltete Ziele wie S6K1 und 4E-BP1. S6K1 wiederum phosphoryliert RPS6, was die Ribosomenfunktion verbessert und die Translation aktiviert. Die Hyperphosphorylierung von 4E-BP1 setzt eIF4E frei, was die Assemblierung des Translationsinitiationskomplexes eIF4F und die Aktivierung der cap-abhängigen Translation ermöglicht. Alle diese Signalwege sind stark an der AML beteiligt und tragen zu erworbenen Anpassungen bei, indem sie die Zellproliferation, den Stoffwechsel und die Resistenz gegen apoptotische Signale erhöhen. (B) stellt die Hauptschritte des gekoppelten Protokolls für Knochenmarkaspiration und intrazelluläre Phosphoflow-Färbung vor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Visualisierung kritischer Schritte während der Knochenmarkaspiration . Das Operationsgebiet und die notwendigen Materialien werden unter einer Laminar-Flow-Haube eingerichtet. Nach der Anästhesie durch Isofluran-Inhalation (A) wird die Femurgelenkfläche für die Aspiration vorbereitet (B,C). Der Oberschenkelknochen wird mit einer ersten Spritze punktiert, die in der Mitte des Oberschenkelknochens (D) ausgerichtet ist. Es ist wichtig, keinen starken Druck auf die Nadel auszuüben und stattdessen eine rotatorische Bohrbewegung auszuführen. Dies reicht in der Regel aus, damit die Nadel die Oberfläche des Knochens perforiert und dem Weg der Oberschenkelhöhle folgt. Anschließend wird das Knochenmark mit einer zweiten Spritze durch die Einstichstelle (I,J) aspiriert. Nach dem Transfer des Knochenmarkaspirats in ein Mikrozentrifugenröhrchen (K) wird sanfter Druck ausgeübt, um die Blutung im Bereich (L) zu stoppen, und die Maus wird zur Genesung in einen warmen und sauberen Käfig gelegt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Arbeitsablauf für die Analyse der Gating-Strategie, einschließlich Isotypsteuerungen. (A) stellt Gating-Strategien für lebende Zellen, den Ausschluss von Dubletten und hCD45-positiven AML-Zellen dar. (B) zeigt Signale für jedes Phosphoprotein in Braun und Isotyp-Kontrollen in Schwarz (zwei biologische Replikate). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Arbeitsablauf für den Nachweis und die Analyse intrazellulärer Phosphoproteine nach Immunstatisierung lebensfähiger AML-Zellen im Knochenmark. (A) NSG-SGM3-Mäuse, die mit von Patienten gespendeten AML-Zellen transplantiert wurden, wurden mit Vehikel (Kontrolle) oder Venetoclax, 5-Azacytidin und Cedazuridin (vene/aza/CDZ) oder gilteritinib behandelt. Nach 15 Tagen wurden Knochenmarkaspirate (BM) aufbereitet. (B) stellt die Gating-Strategie für die Analyse lebensfähiger AML-Zellen (z. B. hCD45/Zombie-NIR-positiv) 15 Tage nach der Behandlung dar. (C,D) stellen die Normalisierung des Signals für jeden der Phosphoantikörper dar, wie angegeben, in 10.000 AML-Zellen, die von Mäusen isoliert wurden, die mit Venetoclax/5-Azacytidin/Cedazuridin oder Vehikel (B) oder Gilteritinib oder Vehikel (C) behandelt wurden. Die Spuren repräsentieren die Signale in AML-Zellen, die von der Kontrollmaus isoliert wurden, die mit Vehikel (hellblau), vene/aza/CDZ (rot) oder Gilteritinib (violett) behandelt wurde. (E) Das Histogramm stellt die mittleren Wertänderungen der Färbeintensitäten für jedes Phosphoprotein dar, das an lebenden menschlichen AML-CD45+ -Zellen von drei Mäusen und SD getestet wurde. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Die Sternchen weisen auf signifikante Unterschiede in den Färbeintensitäten hin, die durch die ANOVA mit p-Werten unter 0,05 (*) und 0,01 (**) beurteilt wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antikörper</td>
			<td>Fluorochrom</td>
			<td>Verdünnung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-RPS6 (Ser240/244)</td>
			<td>Nr. AF594</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-4EBP1 (Thr37/46)</td>
			<td>Nr. AF488</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-STAT5 (Tyr694)</td>
			<td>PE</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)</td>
			<td>Nr. AF647</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaninchen-IgG-Kontrolle</td>
			<td>Nr. AF594</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaninchen-IgG-Kontrolle</td>
			<td>Nr. AF488</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaninchen-IgG-Kontrolle</td>
			<td>PE</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaninchen-IgG-Kontrolle</td>
			<td>Nr. AF647</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Liste der optimierten Verdünnungen für Antikörper.
Ergänzende Abbildung 1: Vergleich von p-STAT5, p-RPS6, p-ERK1/2 und FSC-A in einer repräsentativen AML-PDX-Probe. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel für die Beziehung zwischen p-STAT5, p-ERK und p-RPS6 bei Maus "E9" am Tag 15 der Behandlung mit Venetoclax/5-Azacitidin/Cedazuridin (Ergebnis aus Abbildung 4C). In dieser Probe scheint die stärkste Korrelation bei der Phosphoproteinfärbung zwischen p-STAT5 und p-RPS6 (A) zu bestehen, die beide in dieser Versuchsgruppe nach der Behandlung hochreguliert sind (Abbildung 4E). Es scheint eine geringere Beziehung zwischen p-STAT5 und p-ERK (B) zu geben. Wichtig ist, dass die Zellgröße (gemessen mit FSC-A) keinen wesentlichen Beitrag zur Gesamtpositivität von p-STAT5 leistet, was unterstreicht, dass die Positivität der Färbung nicht nur ein Produkt der Zellgröße (C) ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/Figure%20S1%20jove.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Intrazelluläre Phosphoflow-Zytometrie von Xenotransplantaten bei akuter myeloischer Leukämie

To adapt and resist approved treatments, acute myeloid leukemia (AML) cells activate specific molecular pathways that lead to changes in gene expression, ...

Unsere Forschung zielt darauf ab, zu verstehen, wie akute myeloische Leukämie Resistenzen gegen zugelassene Therapien entwickelt. Basierend auf der Hypothese, dass der Stoffwechsel eine Schlüsselrolle spielt. Das ultimative Ziel ist es, eine Strategie zu finden, die diesen Widerstand effektiv überwinden kann. Die Durchflusszytometrie, die in der Leukämieforschung weit verbreitet ist, ist ideal für die Analyse von Suspensionszellen wie Leukämiezellen. Seine Anpassungsfähigkeit macht es zu einem leistungsstarken Werkzeug für molekulare Datenmechanismen. Die größte experimentelle Herausforderung in der AML-Forschung besteht darin, ein optimales In-vivo-Protokoll für die molekulare Wiederbelebung zu entwickeln, d. h. Zellen für eine genaue Modellierung, um den Mechanismus zu verstehen, der der Resistenz von Therapeutika zugrunde liegt.[Erzähler] Beugen Sie zunächst das Knie der Maus und verwenden Sie die nicht dominante Hand, um das Bein zu immobilisieren, um die Gelenkfläche des Femurs freizulegen, wo sich die Einstichseite befindet. Lege den Daumen auf das Schienbein, den Zeigefinger auf den Oberschenkelknochen und den Mittelfinger auf die Außenseite der Knochen, um sie zu stabilisieren. Während die Ruhigstellung aufrechterhalten wird, desinfizieren Sie den Kniebereich mit Isopropylalkohol, um verbleibende Haare zur Seite zu entfernen und die Visualisierung der Knochenstruktur zu verbessern. Positionieren Sie die Nadel mit der ersten trockenen 25-Gauge-Spritze in der Mitte des Femurgelenks und drehen Sie sie vorsichtig, um ein Loch in der Femurgelenksoberfläche zu erzeugen, ohne Kraft auszuüben. Sobald die Nadel in das Knochenmark eindringt, ziehen Sie die Spritze allmählich zurück, während Sie sie drehen. Führen Sie die zweite gespülte Spritze in das Loch ein, das durch die erste Nadel entstanden ist. Üben Sie ein Vakuum auf die zweite Spritze aus, die in den Oberschenkelknochen eingeführt wird, während Sie sie sanft drehen und allmählich zurückziehen. Übertragen Sie das extrahierte Knochenmark, indem Sie den Spritzeninhalt in ein gekühltes Mikrozentrifugenröhrchen spülen, das 500 Mikroliter PBS enthält. Bewahren Sie die Probe auf Eis auf. Üben Sie mit einem Isopropanol-Tupfer 30 Sekunden lang sanften Druck auf die Einstichstelle aus, um Blutungen zu stoppen. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 g bei vier Grad Celsius. Mit einem Vakuum-Absaugsystem wird der Überstand vorsichtig abgesaugt und entsorgt. Fügen Sie 200 Mikroliter pro Probe fluoreszierender Zellfärbelösung hinzu. Verdünnt eins auf 100 in PBS, um die abgestorbenen Zellen zu markieren. Suspendieren Sie die Zellen vorsichtig wieder mit einer Pipette. Anschließend werden die Zellen 10 Minuten lang lichtgeschützt auf Eis inkubiert. Nach 10 Minuten zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 g bei vier Grad Celsius. Aspirieren und verwerfen Sie den Überstand mit einem Vakuumsystem, fügen Sie 100 Mikroliter HCD 45 Brilliant ultraviolet 395 Antikörper pro Probe hinzu, verdünnt auf eins bis 100 in PBS mit 2 % fötalem Rinderserum, um menschliche hämatopoetische Zellen zu markieren. Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang auf Eis und stellen Sie sicher, dass sie vor Licht geschützt sind. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 g bei vier Grad Celsius. Der Überstand wird mit einem Vakuumsystem abgesaugt und entsorgt. Suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter 1,6%igem Formaldehyd in PBS-Lösung. 10 Minuten bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubieren. Nach 10 Minuten zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 g bei vier Grad Celsius. Der Überstand wird mit einem Vakuumsystem abgesaugt und entsorgt. Geben Sie nun einen Milliliter 100% Methanol, vorgekühlt bei minus 20 Grad Celsius, direkt in die beiden. Inkubieren Sie die Proben bei minus 20 Grad Celsius für 30 Minuten lichtgeschützt. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 g bei vier Grad Celsius. Den Überstand mit einem Vakuumsystem ansaugen und entsorgen. Geben Sie 50 Mikroliter Antikörper-Mischlösung oder Isotyp-Kontroll-Mischlösung zu jeder Probe. Suspendieren Sie die Zellen vorsichtig mit einer Pipette und inkubieren Sie alle Proben über Nacht bei vier Grad Celsius, um sicherzustellen, dass sie vor Licht geschützt sind. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 G bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, waschen Sie die Zellen mit 1000 Mikrolitern PBS, indem Sie sie vorsichtig mit einer Pipette wieder suspendieren. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut bei 500 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, führen Sie eine zweite Wäsche mit 1000 Mikrolitern PBS durch und suspendieren Sie die Zellen vorsichtig wieder mit einer Pipette, bevor Sie die Zellen erneut bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach dem Aspirieren des Überstands werden die endgültigen Proben in 200 Mikrolitern PBS erneut suspendiert. Diese Abbildung veranschaulicht den Arbeitsablauf, die Gating-Strategie und die Normalisierung intrazellulärer Phosphoproteinsignale in Knochenmarkzellen von Xenotransplantatmäusen mit akuter myeloischer Leukämie, die 15 Tage lang mit einer Venetoclax-basierten Therapie behandelt wurden. Die Gating-Strategie identifizierte erfolgreich lebensfähige humane akute myeloische Leukämie oder AML-Zellen auf der Grundlage von Vorwärts- und Seitenstreuprofilen und CD45-Positivität, was eine konsistente Analyse über alle Behandlungsgruppen hinweg ermöglichte. Die Behandlung mit Venetoclax 5-Azacitidin und CDZ Uridin führte zu einer erhöhten Phosphorylierung von STAT5 und RPS6 in AML-Zellen, was auf eine Aktivierung der mit Resistenz verbundenen Überlebenswege hindeutet. Interessanterweise reduzierte die Behandlung der Mäuse bei der Behandlung mit Gilteritinib die Phosphorylierung der FLT3-Signalwegproteine nicht signifikant, was darauf hindeutet, dass die Signalübertragung trotz gezielter Therapie bestehen blieb. Phosphoryliertes STAT5 und phosphoryliertes RPS6 zeigten den stärksten Anstieg der Korrelation der Expressionsniveaus nach einer Venetoclax-basierten Therapie, was auf eine Koaktivierung dieser Signalwege hinweist.

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Research

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt die Bewertung der Stromazytokin-induzierten intrazellulären Phosphorylierung von Proteinen in Leukämiezellen. Diese intrazellulären phosphorylierten Proteine werden mit der Phospho-Durchflusszytometrie-Technik quantifiziert.

Bewertung der Stromazytokin-induzierten intrazellulären Proteinphosphorylierung mittels Phospho-Durchflusszytometrie

Wir skizzieren ein Protokoll zur gleichzeitigen Ausdruck der Leukämie Stammzell-Marker auf primäre akute myeloische Leukämie-Zellen durch Durchflusszytometrie zu erkennen. Wir zeigen, wie Sie drei Vorläuferzellen Populationen und eine vermeintliche LSC Bevölkerung mit zunehmendem Grad der Reifung zu quantifizieren. Wir bestätigte das Vorhandensein dieser Populationen in entsprechenden Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate.

Flow Cytometry um Leukämie-Stammzellen in primäre akute myeloische Leukämie und Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate bei Diagnose und folgen bis zu schätzen

Die Versuchsdurchführung auf die Immunphänotypisierung der murinen orthotopen PDAC Homografts bezweckt die Profilierung der Tumor Immuno-Mikroumgebung. Tumoren sind Orthotopically über Operation implantiert. Tumoren von 200 – 600 mm3 in der Größe wurden geerntet und distanzierte um einzellige Suspensionen, gefolgt von Multi-immun FACS Markeranalyse mit verschiedenen fluoreszent-markierten Antikörpern vorzubereiten.

Die Immunphänotypisierung der Orthotopen Homograft (Phänomen) der murinen primäre KPC duktales Pankreaskarzinom durch Durchflusszytometrie

Wir beschreiben eine Methode zur Verwendung von Multiparameter-Durchflusszytometrie zum Nachweis von mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in murinen gesunden hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und Leukämiezellen aus einem Mausmodell akuter myeloischer Leukämie (AML), das von MLL-AF9.

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Wir präsentieren zwei verschiedene Färbeprotokolle für den Nachweis von NKG2D-Liganden (NKG2DL) in Humanproben mit primärer akuter myeloischer Leukämie (AML). Der erste Ansatz basiert auf einem Fusionsprotein, das in der Lage ist, alle bekannten und möglicherweise noch unbekannten Liganden zu erkennen, während das zweite Protokoll auf der Zugabe mehrerer Anti-NKG2DL-Antikörper beruht.

Zwei durchflusszytometrische Ansätze der NKG2D-Ligandenoberflächendetektion zur Unterscheidung von Stammzellen von Massensubpopulationen bei akuter myeloischer Leukämie

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll, in dem ein von Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie abgeleitetes Xenograft-Modell als Strategie zur Bewertung und Überwachung von CD19-gerichteten chimären Antigenrezeptor-T-Zell-assoziierten Toxizitäten verwendet wird.

Bewertung der chimären Antigenrezeptor-T-Zell-assoziierten Toxizität unter Verwendung eines Xenograft-Mausmodells für Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie

Wir verwendeten die Zellproliferationsfärbung, um ruhende Zellen im Zebrafisch-T-Modell für akute lymphatische Leukämie zu identifizieren. Die Färbung wird in nicht teilenden Zellen zurückgehalten und während der Zellproliferation reduziert, was die Selektion ruhender Zellen für die weitere Befragung ermöglicht. Dieses Protokoll bietet ein funktionales Werkzeug, um die Selbsterneuerung im Kontext der zellulären Ruhe zu untersuchen.

Identifizierung ruhender Zellen in einem Zebrafisch-T-Zell-Modell für akute lymphatische Leukämie mittels Zellproliferationsfärbung 

Dieses Protokoll enthält Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Generierung und Fehlerbehebung von Xenotransplantaten der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) beim Menschen aus Zelllinien und frischem Patientenmaterial in transient immunsupprimierten Zebrafischembryonen sowie Richtlinien für die Beurteilung des Ansprechens auf das Arzneimittel mittels Durchflusszytometrie. Die experimentelle Pipeline kann auch für solide Tumore angepasst werden.

Schnelle in vivo Vorhersage des Ansprechens auf Medikamente mit Hilfe von Leukämiezelltransplantaten in Zebrafischembryonen

Dieses Protokoll beschreibt die In-Ovo-Xenotransplantation von patienteneigenen B- und T-Zellen der akuten lymphatischen Leukämie (ALL), die 4 Tage nach der Injektion erfolgt.

In Ovo Xenotransplantation von patienteneigenen Zellen der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) (PDX-ALL)

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Unterscheidung myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark der Maus. Isolierung von Maus Schienbein und Oberschenkelknochen, und die Verarbeitung von Knochenmark nachgewiesen. Bilder zeigen Zellmorphologie vor und nach der Differenzierung und Figurengruppen Zellphänotyp und IL-12 Produktion nach der Reifung mit CpG gezeigt.

Kultur myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark Vorstufen

Lernen Sie die Phosphoflow-Zytometrie zur Analyse von Signalwegen in akuter myeloischer Leukämie. Diese Methode ermöglicht die hochsensitive Messung phosphorylierter Proteine in Xenotransplantaten.

Intrazelluläre Phosphoflow-Zytometrie von Xenotransplantaten bei akuter myeloischer Leukämie

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