Synthese von zusammengesetzten Riesen-Unilamellenvesikeln: Ein biomimetisches Modell von Keimzellen

In diesem Artikel wird ein Verfahren zur Herstellung von zusammengesetzten Riesen-Unilamellären Vesikeln (cGUVs) mit einer Vesikel-in-Vesikel-Struktur mit angepasster elektrischer Leitfähigkeit im inneren, ringförmigen und äußeren Bereich vorgestellt. Bei der Elektroformation werden einfache GUVs synthetisiert, die durch osmotischen Schock in Stomatozyten und cGUVs umgewandelt werden, was ein wertvolles Modell für die Untersuchung der Biophysik kernhaltiger Zellen darstellt.

Wir haben eine aufwendige Studie über die Synthese und Elektrohydrodynamik von zusammengesetzten riesigen unilamellären Vesikeln durchgeführt, um sie als biomagnetische Äquivalente eukaryotischer Zellen zu etablieren. Der Versuch besteht darin, Technologien zu verstehen, die die Anwendung eines elektrischen Feldes auf biologische Zellen beinhalten, wie z. B. die Zellelektroporation und die Zellelektrodeformation.

Eine Kombination aus Fluoreszenz- und Lichtmikroskopie, elektrischen Behandlungen mit Nanosekundenpulsen, Oszilloskop und Stromquellen sowie innovativen Synthesemethoden wird eingesetzt, um die Forschung in diesem Bereich voranzutreiben. Die Herausforderung bei der Synthese von wohlgeformten Verbindungs-GUVs liegt in der Empfindlichkeit eines Verfahrens gegenüber einer Temperatur, der Art der Lipide und der verwendeten Zusammensetzung. In dieser Arbeit zeigen wir dies für ein DMPC- und Cholesterinsystem, aber die Verallgemeinerung bleibt eine Herausforderung. Einfache GUVs, die eine Nukleinzelle nachahmen, wurden in der Literatur synthetisiert. Wir synthetisieren das zusammengesetzte Riesenvesikel, um eine kernhaltige Zelle mit der Klappenabwehrstruktur zu emulieren, die ein inneres Vesikel umschließt, das etwa halb so groß ist wie das äußere Vesikel.

Wir werden uns auf die Untersuchung der Wirkung von Mikro- und Nanosekundenpulsen auf das innere Vesikel konzentrieren, das im Rahmen der Elektroporation eine Nachahmung des Zellkerns einer biologischen Zelle darstellt.

[Erzähler] Reinigen Sie zunächst die Indiumzinnoxid- oder ITO-beschichteten Objektträger gründlich mit einer Spülmittellösung und spülen Sie sie mit entionisiertem Wasser mit einer Leitfähigkeit von 0,055 Mikrosiemens pro Zentimeter ab. Reinigen Sie dann die Objektträger mit einer 100%igen Ethanollösung erneut und spülen Sie sie mit entionisiertem Wasser ab. Trocknen Sie die Objektträger in einem auf 85 Grad Celsius eingestellten Ofen. Identifizieren Sie die leitfähige Seite jedes ITO-beschichteten Objektträgers mit einer Stromzange. Befestigen Sie den sauberen Objektträger mit einem Vakuum auf dem Spin-Coder-Tisch und stellen Sie sicher, dass die leitfähige Seite nach oben zeigt. Tragen Sie 25 Mikroliter der Lipidlösung, eines davon vier Tröpfchen, auf die leitfähige Seite eines ITO-Objektträgers auf. Nehmen Sie einen weiteren Objektträger und tragen Sie 25 Mikroliter der Lipidlösung auf, zwei auf die gleiche Weise. Trocknen Sie beide lipidbeschichteten Objektträger mindestens zwei Stunden lang in einem Exsikkator, der im Dunkeln gelagert wird. Ordnen Sie dann einen lipidbeschichteten ITO-Objektträger mit einem Lipidobjektträger parallel zu einem sauberen Objektträger an, wobei Sie darauf achten, dass die leitfähigen Seiten zueinander liegen, und platzieren Sie einen drei Millimeter dicken Silikonkautschuk-Abstandshalter dazwischen. Versiegeln Sie die Einrichtung mit einer Klemme, um eine Elektroformationskammer zu erstellen. Füllen Sie nun die Kammer mit einer Zwei-Milliliter-Spritze mit 100-millimolarer Saccharoselösung. Verbinden Sie das Ausgangskabel des Funktionsgenerators mit den ITO-beschichteten Dias mit dem Funktionsgenerator. Stellen Sie beide Elektroformationskammern in einen Inkubator, der zwischen 38 und 40 Grad Celsius gehalten wird. Anlegen eines elektrischen Wechselstromfelds von fünf Volt Spitze-Spitze bei einer Frequenz von 10 Hertz mit einem Zweikanal-Funktionsgenerator für vier Stunden Trennen Sie nach der Inkubation die Elektroformierkammern vom Funktionsgenerator. Nehmen Sie sie aus dem Inkubator und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen. Ernten Sie mit einer Spritze die synthetisierten riesigen unilamellären Vesikel aus jeder Kammer und überführen Sie sie in separate Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Inkubieren Sie die Röhrchen eine Stunde lang bei Raumtemperatur zwischen 25 und 27 Grad Celsius, bevor Sie mit dem osmotischen Schock fortfahren. Übertragen Sie 200 Mikroliter einfacher riesiger unilamellärer Vesikel oder sGUVs, die in hydratisierenden Medien mit 100-millimolarer Saccharoselösung suspendiert sind, in die Beobachtungskammer und führen Sie 125 Mikroliter 300-millimolare Glukoselösung ein, um einen osmotischen Schock zu induzieren und Formübergänge zu initiieren. Lassen Sie die sGUVs, die sich nun einem osmotischen Schock unterziehen, eine Stunde lang in der Beobachtungskammer auf dem Mikroskopietisch ruhen. Führen Sie Differenzinterferenz-, Kontrast- und Epifluoreszenzmikroskopie mit einem inversen Mikroskop durch, das mit einer monochromatischen Kamera ausgestattet ist. Verwenden Sie Plan Fluor Objektive mit extra langem Arbeitsabstand von 20X x 0,45 und 40X x 0,60, um Formübergänge in den sGUVs zu beobachten. Verwenden Sie für die Epifluoreszenz ein Grünfilterset mit Anregung bei 510 bis 560 Nanometern, einen dichroitischen Spiegel bei 575 Nanometern und einen Barrierefilter bei 590 Nanometern für Niall-Rot-gefärbte Doppelschichten. Überwachen Sie Formübergänge innerhalb der Beobachtungskammer mit differentieller Interferenzkontrast- und Epifluoreszenzmikroskopie mit Plan Fluor Objektiven. Beobachten Sie die Bildung von stomatozytären Vesikeln während des Formübergangs. Beobachte, wie sich zuerst die größeren Vesikel absetzen, gefolgt von einer Zunahme der Anzahl kleinerer Vesikel im Laufe der Zeit. Fügen Sie als Nächstes Salzlösung hinzu, um die Leitfähigkeit in verschiedenen Bereichen der cGUVs einzustellen, bevor Sie einen osmotischen Schock auslösen. Um beispielsweise eine höhere Leitfähigkeit im äußeren und inneren Bereich als im ringförmigen Bereich zu erzeugen, werden 200 Mikroliter Saccharoselösung in die Elektroschweisskammer überführt. Geben Sie 20 Mikroliter 7,5-Millimolar-Salzlösung in die Kammer und induzieren Sie einen osmotischen Schock mit 125 Mikrolitern 300-Millimolar-Glukoselösung. Lassen Sie die osmotischen Schock-sGUVs drei bis vier Stunden in der Kammer ruhen. Bestätigen Sie, dass die resultierenden cGUVs im äußeren und inneren Bereich eine höhere Leitfähigkeit aufweisen als im ringförmigen Bereich. Um die Elektrodeformation der cGUVs durchzuführen, platzieren Sie die Drahtelektroden in einem Abstand von 500 Mikrometern und legen Sie mit einem Funktionsgenerator ein elektrisches Wechselstrompotential von 7,5 Volt Spitze-Spitze bei 100 Kilohertz an. Nachdem das elektrische Feld angelegt wurde, nehmen Sie ein Video mit 10 Bildern pro Sekunde auf und beobachten Sie die abgeflachte Verformung der äußeren Vesikel und die prolate Verformung der inneren Vesikel. Laden Sie dann das cGUV-Gemisch in einen Hohlraumschieber und verschließen Sie es mit einem Deckglas, um ein Verrutschen zu verhindern. Verwenden Sie ein konfokales Laserscanning-Mikroskop, um die cGUV-Morphologie durch Z-Achsen-Scannen mit einer Schrittweite von einem Mikrometer zu analysieren. Verwenden Sie für die Bildgebung ein Plan Apochromat 40X x 1,3 Öl DIC-Objektiv. Verwenden Sie einen roten Einkanalmodus mit 561 Nanometern Anregung und 561 bis 695 Nanometern Emission, um cGUV abzubilden, das mit Niallrot oder Rhodamin PE gefärbt ist. Ändern und extrahieren Sie die . CZI Bilddatei mit der mikroskopisch verknüpften Software. Fügen Sie Grafiken wie Maßstabsleisten ein und aktivieren Sie 2D- und 3D-Ansichten. Gehen Sie dann zu Verarbeitungsmethode und Parameter, um die gewünschten Einstellungen anzupassen. Klicken Sie dann auf Übernehmen, um das Bild im JPG-Format zu exportieren. Öffnen Sie abschließend die Datei in der ImageJ-Software. Um eine Maßstabsleiste einzufügen, gehen Sie zu Analyse, gefolgt von Maßstab auf Kalibrierung festlegen, und wählen Sie dann Analysieren gefolgt von Tools und Maßstabsleiste aus, um sie anzuwenden. Die konfokale Z-Stapel-Bildgebung bestätigte, dass die inneren Vesikel vollständig von den äußeren Vesikeln getrennt und in der Z-Ebene aufgrund der geringeren Dichte der inneren Lösung erhöht waren. Der intermediäre Stomatozytenzustand zeigte einen schmalen Hals, der die inneren und äußeren Vesikel verband, bevor er vollständig getrennt wurde. Sechs Stunden nach dem osmotischen Schock wurde eine vielfältige Population von vesikulären Formen beobachtet, darunter mehrere innere Vesikel, sternförmige Körper und röhrenförmige Strukturen. Eine hohe Abundanz an cGUVs wurde unter Verwendung eines Lipidgemisches aus 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin und Cholesterin in einem molaren Verhältnis von 63 bis 37 gebildet. Unter einem elektrischen Wechselstromfeld zeigten cGUVs eine Verformung, wobei das äußere Vesikel eine abgeflachte Form und das innere Vesikel eine prolate Form bildete.