In vitro Kultur für H5N1-spezifische Enten-T-Zellen und Nachweis von Immunantworten mittels intrazellulärer Zytokin-Färbemethode

Unser Ziel ist es, ein in vitro Protokoll zur Kultivierung von H5N1-spezifischen Enten-T-Zellen zu etablieren und die IFN-γ-Sekretion durch intrazelluläre Zytokinfärbung zu quantifizieren. Jüngste Studien unterstreichen die Bedeutung der T-Zell-Immunität von Vögeln bei der Kontrolle von Virusinfektionen, aber für Enten fehlen noch standardisierte Kultivierungsmethoden. Wir haben erfolgreich H5N1-spezifische Enten-T-Zellen kultiviert und ein neuartiges, auf Flow-Segmenten basierendes ICS-Protokoll zum Nachweis der IFN-γ-Expression von Enten entwickelt. Wir werden antigenspezifische T-Zell-Antworten in anderen Geflügelarten untersuchen und immunologische Werkzeuge für die Impfstoffbewertung und die antivirale Forschung entwickeln.

[Erzähler] Zu Beginn isolieren Sie mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) von Enten, die 28 Tage zuvor mit dem H5N1-Virus infiziert wurden, und passen Sie die Konzentration der isolierten Zellen auf 3 mal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter an. Geben Sie nun 1 Milliliter des Mediums in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte. Fügen Sie dann das H5N1-Vogelgrippevirus zu den PBMCs bei einer Infektionsmehrheit von 5 hinzu, um die Zellen zu koinfizieren, und inkubieren Sie die Co-Kultur eine Stunde lang bei 37° Celsius. Schütteln Sie die Platte alle 15 Minuten vorsichtig mit der Hand, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Waschen Sie die PBMCs nach einer Stunde Infektion zweimal mit PBS, um ungebundene Viruspartikel zu entfernen. Die gewaschenen PBMCs werden in 1 Milliliter T-Zell-Kulturmedium resuspendiert und die Suspension fünf Stunden lang bei 37° Celsius inkubiert. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen bei 440 x g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie die pelletierten antigenpräsentierenden Zellen (APCs) in 100 Mikrolitern T-Zell-Kulturmedium und fügen Sie die resuspendierten APCs den Effektorzellen im Verhältnis 1 zu 5 hinzu. Inkubieren Sie nun die Co-Kultur 14 Tage lang in einer 5%igen Kohlendioxidatmosphäre bei 37° Celsius. Entfernen Sie alle zwei Tage die Hälfte des Überstands mit einer Pipette. Entsorgen Sie das gebrauchte Medium, das Zellen enthält, und fügen Sie das gleiche Volumen frisches T-Zellmedium hinzu. Beobachten Sie die Zellen am siebten Tag unter einem optischen Mikroskop bei 100x. Behandeln Sie einen separaten Satz von Gedächtnis-APCs mit PBS und verwenden Sie diese als unstimulierte Kontrollgruppe. Nehmen Sie am siebten Tag die Kulturen der H5N1-spezifischen T-Zellen aus dem Inkubator und ernten Sie alle Zellen aus jeder Vertiefung in einem Röhrchen. Geben Sie nun die inkubierten APCs und Brefeldin A in einer Verdünnung von 1 bis 1000 in die Effektorzellen und inkubieren Sie sechs Stunden lang in einem 39° Celsius Inkubator. Übertragen Sie dann die Zellen in ein sauberes Zentrifugenröhrchen und drehen Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 440 x g. Nach dem Zentrifugieren ist der Überstand zu verwerfen. Geben Sie 100 Mikroliter des Antikörpercocktails mit dem Maus-Anti-Enten-CD8-Antikörper in die Zellen und inkubieren Sie 30 Minuten lang im Dunkeln bei 4° Celsius. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 Milliliter PBS. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 x g für fünf Minuten bei 4° Celsius. Nach dem Verwerfen des Überstands wird FITC-konjugierter Ziegen-Anti-Maus-IgG2b-Antikörper hinzugefügt und 30 Minuten lang im Dunkeln bei 4° Celsius inkubiert. Dann drehen Sie die Zellen erneut bei 400 x g für fünf Minuten bei 4° Celsius. Nach dem Verwerfen des Überstands werden die Zellen in 100 Mikrolitern Fixierungspuffer resuspendiert und die Mischung 20 bis 25 Minuten lang im Dunkeln bei 4° Celsius inkubiert. Waschen Sie dann die Zellen zweimal mit 1 Milliliter 1x Permeabilisierungspuffer, wie zuvor gezeigt. Verwerfen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern Permeabilisierungspuffer. Inkubieren Sie die Zellen mit Maus-Anti-Enten-IFN-γ-Antikörper, verdünnt 1 bis 10 für 30 Minuten im Dunkeln bei 4° Celsius. Nach dem Waschen der Zellen 100 Mikroliter PE-konjugierter Ziegen-Anti-Maus-IgG3-Antikörper in einer Verdünnung von 1 bis 250 zugeben und 30 Minuten im Dunkeln bei 4° Celsius inkubieren. Analysieren Sie abschließend die verarbeiteten Proben mit der FlowJo-Software. Nach der Co-Kultur mit Antigen-präsentierenden Zellen zeigten virusspezifische T-Zellen ein Clusterwachstum, was auf eine erfolgreiche Proliferation hinweist. Die Markierung von Carboxyfluorescein-Succinimidylester zeigte mehrere Peaks der Zellteilung in stimulierten Proben, was eine umfangreiche Proliferation von Entengedächtnis-T-Zellen bestätigt. Der Anteil von CD4+- und CD8+-T-Zellen war in H5N1-stimulierten Kulturen nach 14 Tagen signifikant höher als in unstimulierten Kontrollen. Proliferierende T-Zellen zeigten am siebten Tag der Kultur eine erhöhte Expression von zytotoxischen assoziierten Genen wie Granzym A und Interferon-gamma, was auf einen zytotoxischen Phänotyp hinweist. Die Durchflusszytometrie zeigte einen signifikanten Anstieg des Anteils von Interferon-gamma-positiven Zellen sowohl in CD8-High- als auch in CD8-Low-T-Zellpopulationen nach Antigenstimulation.