Name: Mit der Tröpfchentransfer-Methode lassen sich riesige unilamellare Vesikel zuverlässig präparieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-19T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Lernen Sie die Tröpfchentransfer-Methode zur Herstellung riesiger unilamellarer Vesikel mit hoher Kapselungseffizienz für synthetische Biologie und Mikrorobotik. Dieses Protokoll ermöglicht Forschern die Entwicklung zellähnlicher Mikroroboter für gezielte Therapien.

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Unter Implementierung einer zuvor beschriebenen Technik zur Herstellung von Liposomen1 etablierten Pautot et al. ein Protokoll zur Herstellung von Lipidvesikeln mit Durchmessern von 0,1 bis 1 μm Durchmesser2. Die Tröpfchentransfermethode hat sich schnell als effektiv bei der Herstellung noch größerer Vesikel (Durchmesser über 1 μm)3 erwiesen und gewinnt aufgrund der einfachen Ausführung und der hohen Verkapselungseffizienz zunehmend an Popularität. Tatsächlich reduziert dieses Protokoll im Vergleich zu Quellmethoden (wie Gelquellung oder Elektroformation) das Volumen der Frachtlösung, die zur Bildung einer vergleichbaren Anzahl von Vesikeln erforderlich ist, und den damit verbundenen Abfall4. GUVs können durch alternative Methoden mit vergleichbarer Verkapselungseffizienz aus fluiden Grenzflächen zusammengesetzt werden. Im Vergleich zu denen, die auf mikrofluidischen Chips 5,6 oder kontinuierlicher Droplet-Interface-Crossing-Verkapselung (cDICE)7 basieren, bietet der Tröpfchentransfer jedoch den einfachsten Aufbau, der in jedem Labor mit Grundausstattung erschwinglich ist. Darüber hinaus können mikrofluidische Verfahren zu GUVs mit unerwünschten Öleinschlüssen in der Membran führen. Aus diesen Gründen ist der Tröpfchentransfer die Methode der Wahl für die Beladung von GUVs mit wertvollen Ladungen in den Bereichen künstliche Zellen 3,8,9,10 und seit kurzem auch in der Mikrorobotik 11,12.
Die Methode basiert auf der Bildung von Membranblättchen durch die Stabilisierung von Wasser/Öl-Grenzflächen, die durch Phospholipide vermittelt wird. Zuerst werden Phospholipide in einem Öl (Lipidlösung, LS) gelöst, dann wird mit der wässrigen Lösung, die die gewünschte GUV-Fracht (innere Lösung, IS) enthält, im öligen LS eine Wasser-in-Öl-Emulsion hergestellt. Die Emulsion wird dann in ein Röhrchen überführt, in dem zuvor eine andere wässrige Lösung (äußere Lösung, OS) mit LS äquilibriert wurde, um eine Wasser-Öl-Grenzfläche zu bilden. GUVs entstehen, wenn Wassertröpfchen durch Zentrifugation gezwungen werden, diese OS/LS-Grenzfläche zu passieren: Das innere Segel von GUVs bildet sich auf der Oberfläche von IS-Tröpfchen, während das äußere Segel zwischen OS und LS gebildet wird (Abbildung 1).
Es wurden viele Protokollvarianten beschrieben, deren Parameter entsprechend dem jeweiligen experimentellen Bedarf angepasst wurden. Einen ersten umfangreichen Versuch zur Optimierung des Prozesses haben Moga et al.13 beschrieben, während Zhang et al. die meisten relevanten Beispiele in einer aktuellen Übersichtsarbeit zusammengetragenhaben 14. Trotz der vielen beschriebenen Parameter, die das Protokoll beeinflussen, gibt es weder Hinweise darauf, wie ein Optimierungsprozess für eine neue GUV-Formulierung durchgeführt werden könnte, noch auf die Best Practices für die Rückgewinnung und Manipulation von GUV nach der Produktion. Basierend auf der verfügbaren wissenschaftlichen Literatur und unserer direkten Erfahrung stellen wir hier ein allgemeines Protokoll zur Herstellung von GUVs zur Verfügung und diskutieren die Grundprinzipien. Auf diese Weise liefern wir nützliche Hinweise für die Optimierung neuartiger GUV-Formulierungen und zwei Vorsichtsmaßnahmen, die immer auf das Protokoll anwendbar sind: die Herstellung von LS in einer kontrollierten Umgebung und eine Methode zur einfachen Entfernung der oberen Ölphase für die Rückgewinnung einer sauberen GUV-Probe. Wir haben zwei Beispiele ausgewählt: eines mit 240 mM Saccharose als IS und 0,2 mM DOPC in Silikonöl AR20 als LS (Zustand E [leer], siehe Tabelle 1) und das andere bestehend aus 0,2% 1,1 μm Polystyrol-Mikropartikeln in 240 mM Saccharose als IS und 3,18 mM DOPC in Mineralöl als LS (Zustand P [mit Partikeln], siehe Tabelle 1). Beide Proben wurden mit 240 mM Glukose als OS hergestellt. Wir wählten diese Osmolarität, um GUVs zu erhalten, die unter physiologischen Bedingungen eine entspannte Lipidmembran (niedrige Membranspannung) aufweisen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig1v5.jpg"> 
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Tröpfchentransferverfahrens. (A) Drei Lösungen werden in getrennten Durchstechflaschen hergestellt: Phospholipide in Öl (gelbe Phase) zu einer Lipidlösung, eine Saccharose-haltige Lösung (in Cyan) als innere Lösung und eine äquiosmolare Glukoselösung (weiß) als äußere Lösung. (B) LS wird dann mit dem IS gemischt, um eine stabile Emulsion zu bilden, dann (C) wird eine Grenzfläche zwischen OS und LS ausgleichen lassen, bevor (D) die Emulsion darüber gegossen wird. (E) Wassertröpfchen werden durch Zentrifugalkraft gezwungen, die LS/OS-Grenzfläche zu passieren, um (F) die Bildung von GUVs zu ermöglichen. Die Abbildung ist nicht maßstabsgetreu und soll nur ein Schema der Methode darstellen. Abkürzungen: LS = Lipidlösung; IST = innere Lösung; OS = äußere Lösung; GUV = riesiges unilamelläres Vesikel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>0,22 &Mikro; M gemischte Celluloseester Membran&nbsp; Spritzen-Filter</td><td>Merck</td><td>SLGSVR255F</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Röhrchen</td><td>Bioklasse</td><td>06.0279.00</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; L Glasspritze</td><td>Merck</td><td>20737</td><td></td></tr><tr><td>150 mL Becherglas</td><td>Avantor&nbsp;</td><td>213-1123</td><td>Mindestens 3</td></tr><tr><td>20 mL Fläschchen aus dunklem Glas ND24</td><td>Avantor&nbsp;</td><td>548-9001A</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Röhrchen</td><td>Bioklasse</td><td>07.3534.99</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Zylinder</td><td>Avantor&nbsp;</td><td>612-3843</td><td></td></tr><tr><td>500 &mu; L Glasspritze</td><td>Hamilton</td><td>549-1166</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon Röhrchen</td><td>Merck</td><td>CLS352070</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Spritze&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>8SS50L1</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Röhrchen</td><td>Greiner bio-one</td><td>622201</td><td></td></tr><tr><td>600 mL Becherglas</td><td>Avantor&nbsp;</td><td>213-1126</td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; CHNER-Kolben</td><td>Merck</td><td>Z740682</td><td></td></tr><tr><td>Korkringe für Rundkolben</td><td>Avantor&nbsp;</td><td>217-1000</td><td></td></tr><tr><td>Kristallisator</td><td>Dutscher</td><td>080474A</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. S9378</td><td></td></tr><tr><td>Digitales Thermo-Hygrometer</td><td>Bohlender</td><td>Nr. V1863-07</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Forschung</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Bohrer</td><td>Dremel</td><td>4000</td><td></td></tr><tr><td>Erioglaucin-Dinatriumsalz (Brilliant Blue FCF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861146</td><td></td></tr><tr><td>G18 Spritzennadel</td><td>Terumo</td><td>AN1838R1</td><td></td></tr><tr><td>G21 Spritzennadel</td><td>Terumo</td><td>AN2138R1</td><td></td></tr><tr><td>Handschuhkammer</td><td>Bel-Kunst</td><td>Nr. F50030-0000</td><td>Falls verfügbar, kann ein Handschuhfach verwendet werden, aber in Labors mit niedriger Luftfeuchtigkeit ist dies möglicherweise nicht erforderlich</td></tr><tr><td>Magnetrührer für Heizplatten</td><td>LLG Laborbedarf</td><td>6.263 448</td><td></td></tr><tr><td>Leichtes Mineralöl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330779</td><td></td></tr><tr><td>Neues Coccin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199737</td><td></td></tr><tr><td>Nitrilkautschuk O-Ring O-Ring, 8mm Bohrung, 12mm Außendurchmesser</td><td>RS</td><td>196-4863</td><td></td></tr><tr><td>Offene Schraubverschlüsse mit Septum ND24</td><td>Avantor&nbsp;</td><td>548-0031A</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Mikropipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>12346132</td><td></td></tr><tr><td>P10000 Mikropipette</td><td>Avantor&nbsp;</td><td>89079-978</td><td></td></tr><tr><td>P200 Mikropipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>12326132</td><td></td></tr><tr><td>Papierhandtücher</td><td>Avantor&nbsp;</td><td>KIMB6657</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Avantor&nbsp;</td><td>291-1214</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen (1000)</td><td>Eppendorf</td><td>0030000919</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen (10000)</td><td>Eppendorf</td><td>0030000765</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen (200)</td><td>Eppendorf</td><td>0030000870</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrolpartikel, 1.1 & Mikro; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>LB11-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Gummikappe</td><td>Bioclass S.r.l.</td><td>12.2300.05</td><td></td></tr><tr><td>Konische Gummidichtung</td><td>Avantor&nbsp;</td><td>217-0211</td><td></td></tr><tr><td>Schraubverschlüsse&nbsp; ND24</td><td>Avantor&nbsp;</td><td>548-0161A</td><td></td></tr><tr><td>Silikonöl AR20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10836</td><td></td></tr><tr><td>Silikonrohr (Innendurchmesser 1,6 mm, Außendurchmesser 3 mm)</td><td>RS</td><td>667-8441</td><td></td></tr><tr><td>Silikonrohr (Innendurchmesser 6 mm, Außendurchmesser 12 mm)</td><td>RS</td><td>273-2541</td><td>Mindestens 6 m</td></tr><tr><td>Drei-Wege-Kreuzung</td><td>RS</td><td>795-405</td><td></td></tr><tr><td>Zwei-Wege-Kreuzung</td><td>RS</td><td>419-7287</td><td></td></tr><tr><td>Zweiwege-Ventil</td><td>Claber</td><td>91280</td><td></td></tr><tr><td>Reinstwasser</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>22934</td><td>Wenn verfügbar, kann dieses Produkt durch Wasser ersetzt werden, das durch Milli-Q-Systeme gereinigt wurde</td></tr><tr><td>Universal-Schere</td><td>Bochem</td><td>4154</td><td></td></tr></tbody></table>

mit der tröpfchentransfer-methode lassen sich riesige unilamellare vesikel zuverlässig präparieren

Using the Droplet Transfer Method to Reliably Prepare Giant Unilamellar Vesicles

Eine optimale GUV-Aufbereitung zeichnet sich durch die Bildung einer klaren Ölphase und eines ausgeprägten Pellets aus (Abbildung 4A). In Fällen, in denen Wassertröpfchen nicht in GUVs umgewandelt werden können, kollabieren sie in der Regel und hinterlassen Phospholipid-Ablagerungen an der OS/LS-Grenzfläche (Abbildung 4C). Dieser Effekt wird höchstwahrscheinlich durch die Aggregation von Phospholipiden und anderen Molekülen aus der Ölphase verursacht, die aus einer unzureichenden Äquilibrierung der Phospholipide an der Wasser/Öl-Grenzfläche resultiert. Trotz des Fehlens eines sichtbaren Pellets oder des Vorhandenseins von Schmutz an der Grenzfläche können sich dennoch GUVs bilden, so dass der Prozess fortgesetzt werden kann. Waschschritte sind zwar nicht vollständig wirksam, um alle Phospholipidrückstände zu entfernen, aber sie tragen erheblich zur Beseitigung von Öltröpfchen bei und verbessern die Gesamtqualität der Probe (vergleiche Abbildung 6A und Abbildung 6B).
Die Verwendung von altem LS oder LS, das unter Bedingungen mit hoher Luftfeuchtigkeit hergestellt wurde, führt häufig zu reduzierten GUV-Dispersionen mit geringerer Ausbeute und höherem Gehalt an ungeordneten Aggregaten, die höchstwahrscheinlich durch Phospholipide und andere Moleküle aus der Ölphase gebildet werden (Abbildung 6C). Bei LS, das unter Bedingungen mit hoher Luftfeuchtigkeit hergestellt wurde, beobachteten wir bei der GUV-Produktion Variationskoeffizienten von über 0,8 (mit Proben, die sehr wenige GUVs enthielten), während bei LS, das in der modifizierten Handschuhkammer hergestellt wurde, der Variationskoeffizient unter 0,5 lag.
Unterschiedliche Zentrifugationsbedingungen können sich auf die GUV-Ausbeute und -Qualität auswirken. In einer qualitativen Analyse wurden 20 min bei 3.300 × g als gute Bedingung für saccharosebeladene GUVs identifiziert (Probe E). Eine Verringerung der Drehzahl (45 min bei 500 × g) führte zu einer geringeren Ausbeute, während eine Erhöhung (5 min bei 16.600 × g) zu einer höheren Bildung von ungeordneten Phospholipidaggregaten führte. Eine schwache Zentrifugalkraft kann verhindern, dass viele Tröpfchen die OS/LS-Grenzfläche passieren, daher die verringerte Ausbeute, während eine starke Kraft möglicherweise nicht genügend Zeit für die Organisation der Phospholipide auf dem äußeren Segel während der Grenzflächenüberquerung bietet (Abbildung 7). Auch die Verkapselung von Mikropartikeln kann durch Anpassungen der Zentrifugationsparameter optimiert werden, sofern die Massendichte der Mikropartikel in etwa der des IS entspricht. Zu diesem Zweck ermöglicht die Verringerung der Zentrifugationsbeschleunigung (und damit die Erhöhung der Zentrifugationszeit) eine homogenere Verkapselung der Partikel, indem ein Bruch der Phospholipidmembran aufgrund der von den Feststoffpartikeln ausgeübten Kraft vermieden wird (ein Beispiel für eine gute Verkapselung ist in Abbildung 6D dargestellt, während die Untersuchung der optimalen Zentrifugationsparameter noch im Gangeist 17).
Da die Diffusion von Phospholipiden durch die Ölphase beeinflusst werden kann, kann ein einfacher qualitativer Test durchgeführt werden, um die Stabilität der Emulsion zu bewerten (Abbildung 5). Mit Hilfe eines im IS gelösten färbenden Farbstoffs (Brilliant Blue FCF) zur Verbesserung der Visualisierung können Emulsionen mit unterschiedlichen Wasser/Öl-Verhältnissen hergestellt und über die Zeit beobachtet werden. Der Stabilitätsverlust lässt sich durch die Aggregation von Wassertröpfchen und die daraus resultierende Trennung von der Ölphase sichtbar machen. Da große Tröpfchen (mit bloßem Auge sichtbar) weniger wahrscheinlich in GUVs umgewandelt werden, empfehlen wir, die Emulsionsbedingung zu verwenden, die die geringste Phasentrennung bietet.
Der Effekt von Variationen im Protokoll kann durch eine Größenverteilungsanalyse überprüft werden, wie in Protokollabschnitt 4 beschrieben: Die Durchmesser von GUVs können mit ImageJ aus Phasenkontrastmikroskopbildern gemessen werden, und die Größenverteilung kann mit einem auf GitHub16 verfügbaren Skript analysiert werden. Nach diesem Protokoll konnte beispielsweise eine Zunahme von GUVs mit größeren Durchmessern beobachtet werden, wenn Mineralöl gegenüber Silikonöl AR20 gewählt wurde (Abbildung 8).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig2v5.jpg"> 
Abbildung 2: Aufbau der Handschuhkammer. Diese Abbildung zeigt die wichtigsten Modifikationen an der Handschuhkammer für die Herstellung der Lipidlösung. (A) Einlassanschluss mit Stickstoff und Vakuum; (B) Einlassverbindung mit der Handschuhkammer; (C) Auslassventil; (D) Nadellagerkappe für die Verdampfung des Lösungsmittels; (E) dünne Rohre für die Verdampfung von Lösungsmitteln; (F) Kieselsäurepartikel zur Aufnahme von Feuchtigkeit; (G) Gegenstände, die in die Handschuhkammer gelegt werden sollen: digitales Thermo-Hygrometer (1), Lipidlösung in organischem Lösungsmittel (2), Korkringhalter (3), Glasspritze (4), offene Kappe mit Septum und Nadeln (5), Öllösung (6), offenes dunkles Fläschchen mit Kappe (7), 10-ml-Spitzen (8), P10000-Pipette (9); (H) Ende des Auslassrohrs, das in Wasser getaucht ist; I) Durchstechflasche, verschlossen mit nadelgelagerter Kappe, die mit Ein- und Auslass verbunden ist; (J) Schematische Darstellung des modifizierten Handschuhfachs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig3v5.jpg"> 
Abbildung 3: Behälter zur einfachen Ölentnahme. Wichtigste Schritte bei der Zubereitung von GUVs in einem Behälter zur einfachen Entnahme des Öls gemäß Protokollabschnitt 2.1. (A) In eine 5-ml-Röhrchenkappe wird ein Loch gebohrt, damit eine P1000-Spitze hineinpasst; dann (B) wird die Kappe auf ein leeres 5-ml-Röhrchen gesetzt, wobei die Spitze durch einen O-Ring in das Loch eingeführt wird. (C) Die Lösungen werden gemäß den Protokollabschnitten 2.2 und 2.3 in das Röhrchen gegeben, die Spitze wird verschlossen und das Röhrchen wird in ein 50-ml-Röhrchen gegeben. GUVs, die aus 0,2 mM DOPC in Silikonöl hergestellt wurden, wurden mit 230,7 mM Saccharose und 3,1 mM Brilliant Blue FCF beladen, um die Visualisierung zu verbessern. (D) Nach der Zentrifugation wird die obere Ölphase zusammen mit einem Teil des GUV-Puffers in der Spitze eingeschlossen (der cyan erscheint, weil ein Teil der Tröpfchen nicht in GUVs umgewandelt wird und der Farbstoff im OS freigesetzt wird). Dank der Gummikappe kann die Spitze zusammen mit dem Flüssigkeitsinhalt leicht aus dem 5 mL Röhrchen entnommen werden, was eine schnelle und einfache Entnahme der gesamten Ölphase ermöglicht. (E) Das GUV-Granulat kann leicht vom Boden eines Röhrchens in einer klaren Dispersion gesammelt werden, ohne offensichtliche Ölverunreinigung, wie durch Phasenkontrastmikroskopie nachgewiesen wurde (F). Maßstabsleiste = 20 μm. Abkürzungen: LS = Lipidlösung; IST = innere Lösung; OS = äußere Lösung; GUV = riesiges unilamelläres Vesikel; DOPC = 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig4v5.jpg"> 
Abbildung 4: GUV-Bildung. Beispiele für (A) OS/LS-Grenzfläche, (B) ein sauberes GUV-Pellet mit einer klaren Ölphase und (C) ein GUV-Pellet mit Ablagerungen an der OS/LS-Grenzfläche (die Ablagerungen und Pellets erscheinen rötlich, da der IS dieser GUV-Population mit 1,65 mM New Coccin-Farbstoff ergänzt wurde, um die Visualisierung zu verbessern). Abkürzungen: LS = Lipidlösung; IST = innere Lösung; OS = äußere Lösung; GUV = riesiges unilamelläres Vesikel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig6v5.jpg"> 
Abbildung 5: Emulsionsstabilität mit unterschiedlichen Öl- und Wasser-in-Öl-Verhältnissen. Die Abbildung zeigt die Stabilität von Emulsionen im Laufe der Zeit, abhängig von der Art des Öls und dem verwendeten Wasser/Öl-Verhältnis (w/o). Das IS bestand aus 230,7 mM Saccharose und 3,1 mM Brilliant Blue FCF, um die Visualisierung der Emulsionen zu verbessern. Mit Mineralöl hergestellte Emulsionen sind weniger stabil als ihre Gegenstücke, die mit Silikonöl AR20 hergestellt werden. Dieser Effekt wird durch zunehmende W/O-Verhältnisse noch verstärkt. Emulsionen im Silikonöl AR20 sind zwar deutlich stabiler, aber auch ihre Stabilität nimmt mit zunehmendem W/O-Verhältnis ab, wobei die Phasentrennung unmittelbar nach der Emulgierung sichtbar ist (Silikonöl AR20 bei 10%). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig5v5.jpg"> 
Abbildung 6: Beobachtung von GUVs mit einem Phasenkontrastmikroskop. Eine 20-fache Vergrößerung von mit Saccharose beladenen GUVs, die aus einem LS hergestellt wurden, das aus 3,18 mM DOPC in Mineralöl besteht. (A) Probe, die nach der Ölentnahme entnommen wurde; (B) Probe, die nach den Waschschritten entnommen wurde; (C) schlechte GUV-Ausbeute aus einem LS, das in Umgebungen mit unreguliertem Sauerstoff und Feuchtigkeit hergestellt wurde; (D) mit Mikropartikeln beladene GUVs. Maßstabsleiste = 10 μm; Öltropfen sind eingekreist, und Beispiele für ungeordnete Aggregate von Phospholipiden und Ölmolekülen sind durch einen Pfeil gekennzeichnet. Abkürzungen: LS = Lipidlösung; GUVs = riesige unilamelläre Vesikel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig7v5.jpg"> 
Abbildung 7: Einfluss verschiedener Zentrifugationsbedingungen auf die GUV-Bildung. Phasenkontrastbilder von saccharosebeladenen GUVs, die mit einem LS aus 0,2 mM DOPC in Silikonöl AR20 hergestellt wurden. Die Abbildung zeigt einen qualitativen Vergleich von GUVs bei (A) 16.600 × g für 5 min, (B) 3.300 × g für 20 min und (C) 500 × g für 45 min. Während eine hohe Zentrifugationsgeschwindigkeit zu einem höheren Gehalt an Phospholipid-Aggregaten führt, führt eine niedrige Zentrifugationsgeschwindigkeit zu einer geringeren Ausbeute. Maßstabsleiste = 50 μm. Abkürzungen: LS = Lipidlösung; GUV = riesiges unilamelläres Vesikel; DOPC = 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68340/68340fig8v5.jpg"> 
Abbildung 8: Analyse der Größenverteilung. Vergleich von zwei mit Saccharose beladenen GUV-Proben, die aus (A) 0,2 mM DOPC in Mineralöl und (B) 0,2 mM DOPC in Silikonöl AR20 gewonnen wurden (*die Probe wurde 10x verdünnt, um eine klare Unterscheidung der GUVs unter einem Phasenkontrastmikroskop zu ermöglichen). Die Analyse nach Protokollabschnitt 4 zeigt eine Größenverteilung in Richtung höherer Durchmesser für die Mineralölprobe im Vergleich zu Silikonöl-AR20-Proben. Die Ausbeute der Silikonprobe ist jedoch fast 20x höher. Abkürzungen: GUV = riesiges unilamelläres Vesikel; DOPC = 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68340/68340fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Schritt</td>
			<td>Bedingung E</td>
			<td>Bedingung P</td>
			<td>Beschreibung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1.1</td>
			<td>4,11 g</td>
			<td>ca. 17,11 Gramm</td>
			<td>Masse an Saccharose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1.1</td>
			<td>ca. 2,16 g</td>
			<td>ca. 2,16 g</td>
			<td>Masse der Glukose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1.2</td>
			<td>ca. 240 mM</td>
			<td>ca. 1000 mM</td>
			<td>Konzentration von Saccharose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1.2</td>
			<td>ca. 240 mM</td>
			<td>ca. 240 mM</td>
			<td>Konzentration von Glukose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.3.2</td>
			<td>Silikonöl</td>
			<td>Mineralöl</td>
			<td>Ölphase für LS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.3.2</td>
			<td>0,1 mL Glasspritze</td>
			<td>0,5 mL Glasspritze</td>
			<td>Glasspritze zum Transfer von DOPC in Chloroformlösungen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.3.10</td>
			<td>63 μL</td>
			<td>500 μL</td>
			<td>Volumen von DOPC in Chloroform-Lösung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.3.16</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>Ölvolumen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4.1</td>
			<td>3300 g 20 Minuten</td>
			<td>500 g 45 Minuten</td>
			<td>Bedingungen der Zentrifugation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Variationen im Protokoll. Die Tabelle zeigt die Variationen für verschiedene Schritte des Protokolls (in der ersten Spalte angegeben), um zwei verschiedene GUV-Populationen herzustellen: saccharosebeladene GUVs (Bedingung E) und mikropartikelbeladene GUVs (Bedingung P).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ID</td>
			<td>Erforderliche Schritte</td>
			<td>Innendurchmesser (mm)</td>
			<td>Außendurchmesser (mm)</td>
			<td>Länge (mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>1.2.1; 1.2.3</td>
			<td>7</td>
			<td>13</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>1.2.1; 1.2.4; 1.3.5</td>
			<td>7</td>
			<td>13</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>1.2.1; 1.2.4; 1.3.5</td>
			<td>7</td>
			<td>13</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>1.2.1; 1.2.4; 1.2.5</td>
			<td>7</td>
			<td>13</td>
			<td>2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>1.2.1; 1.2.6; 1.3.13</td>
			<td>7</td>
			<td>13</td>
			<td>2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>1.2.2; 1.2.7; 1.3.11</td>
			<td>3</td>
			<td>7</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>1.2.2; 1.2.7; 1.3.11</td>
			<td>3</td>
			<td>7</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>1.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.15</td>
			<td>3</td>
			<td>7</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>1.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.15</td>
			<td>3</td>
			<td>7</td>
			<td>200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 2: Rohre für Gas- und Vakuumanschlüsse in der Handschuhkammer. In der Tabelle sind die Abmessungen der Silikonrohre aufgeführt, die für die Verbindung der Handschuhkammer mit den Stickstoff- und Vakuumleitungen verwendet werden. Referenz-IDs werden bereitgestellt, um den Montageprozess zu erleichtern.

Mit der Tröpfchentransfer-Methode lassen sich riesige unilamellare Vesikel zuverlässig präparieren

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