Mit der Tröpfchentransfer-Methode lassen sich riesige unilamellare Vesikel zuverlässig präparieren

Unser Ziel ist es, zellähnliche Mikroroboter zu entwickeln, die durch Körpergewebe navigieren, um Therapien lokal durchzuführen. Sie basieren auf riesigen unilamellären Vesikeln und einer phospholipidischen Membran und enthalten aktive Partikel. Dieses Protokoll bietet einen Leitfaden für Anfänger, die die Tröpfchentransfermethode in der synthetischen Biologie und in anderen Bereichen, z. B. in der Mikrorobotik, übernehmen und anpassen möchten.

Im Vergleich zu anderen GUV-Präparationstechniken bietet dieses Protokoll eine hohe Verkapselungseffizienz und eine einfache Ausführung, wodurch es für jede Forschungsgruppe mit grundlegender Laborausrüstung zugänglich ist. Wir werden die Navigation von GUV-basierten Mikrorobotern in gewebeähnlichen Umgebungen untersuchen und Sensorstrategien implementieren, um eine autonome Bewegung in Richtung kranker Zellen zu ermöglichen. Bewegen Sie die Handschuhkammer zunächst entweder in eine chemische Haube oder daneben.

Öffnen Sie die Handschuhkammer und platzieren Sie einen mit Siliziumdioxidpartikeln gefüllten Kristallisator auf dem Boden der Kammer. Decken Sie den Kristallisator mit einer weißen Auflagefläche ab und schichten Sie ihn dann mit Küchenpapier aus. Geben Sie alle erforderlichen Materialien in die Handschuhkammer und stellen Sie das Glasfläschchen mit der Chloroformlösung auf einen Korkringhalter oder ein 150-Milliliter-Becherglas, das so nah wie möglich an der Bedienerseite positioniert ist.

Schließen Sie nun die Handschuhkammer und stellen Sie sicher, dass die beiden Hälften sicher ausgerichtet sind und nicht verrutschen können. Verwenden Sie die mitgelieferten Kunststoffschrauben, um die Kammer vollständig abzudichten. Schließen Sie das Auslassventil und tauchen Sie Rohr Nummer fünf in ein 500-Milliliter-Becherglas, das zur Hälfte mit Wasser gefüllt ist.

Verbinden Sie als Nächstes das ventilgeregelte Ende von Rohr Nummer zwei mit der Vakuumleitung. Verbinden Sie dann das andere Ende mit der Stickstoffleitung mit Rohr Nummer drei. Öffnen Sie das Ventil und schalten Sie die Vakuumleitung ein, bis sich die Handschuhe aufblasen und zu steif werden, um sich zu biegen.

Schließen Sie dann sowohl die Unterdruckleitung als auch das Ventil. Öffnen Sie als Nächstes die Stickstoffleitung, bis die Handschuhe Luft ablassen und aus der Handschuhkammer herausragen. Nachdem Sie die Handschuhe angezogen haben, verwenden Sie eine Hamilton-Spritze, um das angegebene Volumen DOPC in Chloroformlösung in ein dunkles Glasfläschchen zu übertragen.

Verschließen Sie die Durchstechflasche mit der Kappe mit den Nadeln. Verbinden Sie nun Rohr Nummer sechs mit Rohr Nummer acht und Rohr Nummer sieben mit Rohr Nummer neun mithilfe der bidirektionalen Verbindungen. Ziehen Sie die Handschuhe aus dem Handschuhfach aus und öffnen Sie das Auslassventil.

Öffnen Sie dann langsam die Stickstoffleitung und überwachen Sie den Gasfluss auf Blasen im Becherglas. Erhöhen Sie allmählich den Stickstofffluss, bis eine gleichmäßige, aber beobachtbare Blasenrate erreicht ist. Schließen Sie nach drei Minuten Durchfluss die Stickstoffleitung.

Sobald die letzte Blase aus dem Becherglas austritt, schließen Sie das Auslassventil. Ziehen Sie die Handschuhe wieder an und trennen Sie die Rohre acht und neun von den bidirektionalen Verbindungen. Öffnen Sie anschließend die Durchstechflasche und setzen Sie die Kappe wieder in das 50-Milliliter-Röhrchen ein.

Öffnen Sie dann die Ölflasche und füllen Sie die benötigte Menge Öl in das dunkle Fläschchen. Verschließen Sie das Fläschchen wieder mit der Kappe, ziehen Sie die Handschuhe aus und öffnen Sie die Handschuhkammer. Wirbeln Sie das versiegelte Lipidsuspensionsfläschchen mindestens 30 Sekunden lang kräftig ein.

Dann inkubieren Sie es bei 80 Grad Celsius in einem Wasserbad für 30 Minuten. Nachdem Sie das Fläschchen erneut vortexiert haben, inkubieren Sie es über Nacht bei Raumtemperatur. Schneide mit einer Schere den Deckel von einem Fünf-Milliliter-Röhrchen ab.

Bohren Sie ein etwa acht Millimeter großes Loch in die Mitte der Kappe, in das eine P1000-Pipettenspitze passt. Wenn das Loch zu breit ist, um in die Spitze zu passen, entsorgen Sie die Kappe und beginnen Sie mit einer neuen Kappe neu. Mit einem zwei mal fünf Zentimeter großen Streifen Schleifpapier die Ränder des Bohrlochs glatt streichen.

Setzen Sie die Kappe wieder auf das Fünf-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 3.000 g, um alle verbleibenden Kunststoffpartikel zu entfernen. Entfernen Sie dann die Kappe und entsorgen Sie die Tube. Schneide nun den Verschluss aus einem neuen Fünf-Milliliter-Röhrchen ab und setze ihn durch den vorbereiteten Lochverschluss wieder auf.

Führen Sie eine P1000-Spitze durch das Loch, wobei ein O-Ring zwischen der Spitze und der Kappe verriegelt ist, um eine weitere Abwärtsbewegung zu verhindern. Füllen Sie die Tube mit 5,5 Millilitern äußerer Lösung durch die Spitze. Die zuvor vorbereitete Durchstechflasche mit Lipidsuspension mindestens 30 Sekunden lang vortexen.

Dann inkubieren Sie es 30 Minuten lang im 50 Grad warmen Wasserbad. Lassen Sie die zuvor vorbereiteten Wasserlösungen mindestens 10 Minuten lang bei Raumtemperatur äquilibrieren. Pipettieren Sie nun 300 Mikroliter der äußeren Lösung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen oder das zuvor modifizierte Fünf-Milliliter-Röhrchen.

Schichten Sie langsam 100 Mikroliter Lipidsuspension auf die Öllösung und stellen Sie sicher, dass sich zwei unterschiedliche und kontinuierliche Phasen bilden. Lassen Sie die Schnittstelle 10 Minuten lang ungestört stehen, um sich auszugleichen. Pipettieren Sie in einem Zwei-Milliliter-Röhrchen 250 Mikroliter Lipidsuspension, gefolgt von 6,25 Mikrolitern innerer Lösung, um eine 2,5%ige Wasser-in-Öl-Emulsion herzustellen.

Mischen Sie die beiden Phasen, bis die Emulsion homogen und stabil erscheint. Übertragen Sie 200 Mikroliter der vorbereiteten Emulsion auf die zuvor gebildete Grenzfläche zwischen Öllösung und Lipidsuspension. Wenn Sie ein 1,5-Milliliter-Röhrchen verwenden, schließen Sie das Röhrchen einfach.

Wenn Sie das modifizierte Fünf-Milliliter-Röhrchen verwenden, setzen Sie eine Gummikappe auf die Pipettenspitze und geben Sie das gesamte Röhrchen vorsichtig in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Die Röhrchen werden bei Raumtemperatur mit geeigneter Geschwindigkeit zentrifugiert. Nach der Zentrifugation ist zu vergewissern, dass unten ein undurchsichtiges Pellet vorhanden ist und ob die Ölphase oben klar ist.

Um Öl aus dem Fünf-Milliliter-Röhrchen mit den GUVs zu entfernen, ziehen Sie die Pipettenspitze aus dem Röhrchen, während Sie darauf achten, dass die Gummikappe an Ort und Stelle bleibt. Entsorgen Sie die Spitze und bewahren Sie die Gummikappe, den O-Ring und die Haltekappe für die zukünftige Verwendung auf. Wenn Sie stattdessen ein 1,5-Milliliter-Röhrchen verwenden, verwenden Sie eine P1000-Mikropipette, um die Öllösung zu entfernen, wobei Sie etwa 50 Mikroliter zurücklassen und darauf achten, dass das Pellet nicht gestört wird.

Wechseln Sie die Pipettenspitze und resuspendieren Sie das Pellet in den restlichen 50 Mikrolitern der Lösung. Zum Schluss überträgst du das resuspendierte Material in ein sauberes Zwei-Milliliter-Röhrchen. Lipidlösungen, die unter Bedingungen mit hoher Luftfeuchtigkeit hergestellt wurden, erzeugten riesige unilamellare Vesikel mit signifikant geringeren Ausbeuten und einer größeren Prävalenz von ungeordneten Aggregaten im Vergleich zu solchen, die in einer feuchtigkeitskontrollierten Kammer hergestellt wurden, obwohl in letzterer noch einige Aggregate vorhanden waren.

Bei 3.300 g für 20 Minuten waren die Ausbeute und die Qualität der mit Saccharose beladenen Vesikel optimal, während sowohl niedrigere als auch höhere Zentrifugationsgeschwindigkeiten zu ungünstigen Ergebnissen führten, wie z. B. eine verringerte Ausbeute oder Aggregatbildung. Mineralöl führte zu Vesikeln mit einer größeren durchschnittlichen Durchmesserverteilung, während Silikonöl AR 20 eine signifikant höhere Gesamtvesikelzahl erzeugte.