Effiziente Techniken für eine umfassende Probenahme von zugänglichem Gewebe bei adulten Xenopus

Diese Arbeit zielt darauf ab, eine replizierbare Methode zur schnellen Entnahme des Xenopus-Herzventrikels, des arteriellen Rumpfes, des linken Leberlappens, der Gallenblase, der Lunge, der Bauchspeicheldrüse, der Milz, des Kehlkopfes, der Speiseröhre, des Magens, des Darms, der Hoden, des Fettkörpers, des Eileiters, der paarigen Nieren, des Ischiasplexus, der Haut, des Thymus und des gesamten Auges in weniger als einer Stunde zu entwickeln. Eine experimentelle Herausforderung ist die Optimierung der Gewebefrische. Aus diesem Grund wurde das Protokoll so konzipiert, dass es in weniger als einer Stunde abgeschlossen werden kann. Durch die Priorisierung der Gewebefrische können diese Gewebe verwendet werden, um qualitativ hochwertige biochemische Analysen wie Proteomik durchzuführen und gleichzeitig die Anzahl der verwendeten Tiere zu minimieren. In Zukunft werden wir ein Protokoll über Gewebe schreiben, die schwieriger zu erreichen sind, wie Gehirn, Muskeln und Knochen.

[Dozent] Positionieren Sie zunächst den eingeschläferten Strahl für die Präparierung und stecken Sie die Gliedmaßen fest. Schneiden Sie mit einer Präparierschere die Haut entlang der Mittellinie und dann seitlich durch, um zwei Hautlappen zu erzeugen. Fassen Sie die Linea alba mit einer Pinzette und ziehen Sie sie aus der Zölomhöhle weg. Schneiden Sie vorsichtig durch die Muskulatur in Richtung Kopf und legen Sie zwei Lappen der Hohlraumwand an. Reduzieren Sie die Coracoid-Knochen, um einen besseren Zugang zum Herzen zu erhalten. Dehnen Sie das Perikard, perforieren Sie es und schälen Sie es zurück, um die drei Herzkammern freizulegen. Schneiden Sie nun die Orakel an der Kreuzung mit dem Ventrikel und dem Arterienstamm ab. Fassen Sie mit einer Pinzette die Spitze des Ventrikels und schneiden Sie sie knapp unterhalb der Verbindung mit dem Arterienstamm ab, wobei Sie einen Rand lassen. Beobachten Sie die Verzweigung des arteriellen Stammes, ziehen Sie den Rumpf straff und schneiden Sie die Aortenstämme kurz nach den Punkten, an denen sie sich in Bögen teilen. Fassen Sie als Nächstes die Lippe des linken Leberlappens und heben Sie sie vorsichtig an, um die Leber- und Zystengänge freizulegen. Nehmen Sie Proben aus den unteren zwei Dritteln des linken Lappens unterhalb dieser Ansätze. Nachdem Sie die Gallenblase identifiziert haben, fassen Sie sie an, ziehen Sie sie vom rechten Leberlappen weg und durchtrennen Sie ihren Ansatz. Fassen Sie dann die Spitze der Lunge und ziehen Sie sie straff. Schneiden Sie die Lunge an der Grenze, wo sie in den Bronchus übergeht. Entfernen Sie den Bronchus aus dem Kehlkopf. Verschieben Sie für die Entfernung der Eierstöcke die Eierstocklappen auf ihre jeweiligen Seiten, um die Ansatzstellen ventral der Nieren sichtbar zu machen. Entfernen Sie mit einer Schere die Eierstöcke in der Nähe der Nieren, ohne sie zu beschädigen. Als nächstes untersuchen Sie den vorderen Lappen der Leber, der auch als Medianlappen bezeichnet wird, und beobachten Sie seine Verbindung zum Zwölffingerdarm durch das Mesentar. Verwenden Sie eine Iridektomieschere, um das Mesentarium und das Hepatoduodenalband zu durchtrennen. Die verbleibende fleischige Masse besteht aus der Bauchspeicheldrüse und dem Gallengang. Trennen Sie die Verbindung der Bauchspeicheldrüse und des Gallengangs vom vorderen Leberlappen und lassen Sie einen Rand übrig. Fassen Sie den Magen mit einer Zahnzange und ein Ende der Bauchspeicheldrüse mit einer Gewebezange. Unter Vergrößerung ziehen Sie die Bauchspeicheldrüse vorsichtig vom Magen weg. Identifizieren Sie dann die Milz und entnehmen Sie eine Probe, indem Sie ihren Ansatz am Bauchfell durchtrennen. Fassen Sie den Kehlkopf an seinem unteren Ende und beginnen Sie, ihn aus der Höhle zu heben, wobei Sie alle Peritonealansätze durchtrennen, wenn sie auftreten. Wenn der Kehlkopf angehoben ist, verwenden Sie eine gebogene Iridektomieschere, um das Speiseröhrengewebe vorsichtig vom Kehlkopf zu trennen und zu schneiden. Ziehen Sie dann den Kehlkopf nach unten und schneiden Sie ihn aus der Mundhöhle ab, während Sie die verbleibenden sichtbaren Ansätze durchtrennen. Beobachten Sie die Krümmung des Magens, die ihn von der Speiseröhre unterscheidet, und die Pylorusrestriktion, die den Beginn des Darms markiert. Schneiden Sie den Verdauungskanal direkt vor der Magenkrümmung, um ihn von der Speiseröhre zu trennen. Öffnen Sie die Öffnung und lokalisieren Sie die gemeinsame Öffnung der Eustachischen Röhren auf dem Dach. Halten Sie den Mund offen und ziehen Sie an der Speiseröhre, um ihre Befestigung zu beobachten. Schneide dann die Speiseröhre aus der Mundhöhle direkt unter der Eustachischen Öffnung ab. Entfernen Sie dann die Speiseröhre. Fassen Sie nun den Magen und schneiden Sie ihn an der Pylorusrestriktion durch, wo er mit dem Zwölffingerdarm verbunden ist. Ziehe den Dickdarm straff und schneide ihn so nah wie möglich an die Kloake. Entferne den Darm und durchtrenne dabei alle sichtbaren Peritonealansätze. Wenn der Frosch männlich ist, identifizieren Sie die Hoden und entfernen Sie einen mit einer Iridektomieschere, um sicherzustellen, dass die Niere intakt bleibt. Toupieren Sie die Fettkörper auseinander und positionieren Sie sie auf den jeweiligen Seiten, um den Peritonealansatz in der Nähe der Niere freizulegen. Fassen Sie die Basis eines Fettkörpers und schneiden Sie ihn aus dem Bauchfell, wobei Sie einen Rand lassen. Um die Harnblase zu entfernen, schneiden Sie so nah wie möglich an der Kloake. Wenn der Frosch weiblich ist oder einen sichtbaren verkümmerten Eileiter hat, fassen Sie das untere Ende des Eileiters und ziehen Sie ihn von der Kloake weg. Schneiden Sie den Eileiter in der Nähe der Kloake ab und ziehen Sie ihn dann aus der Zölomhöhle, wobei Sie alle Peritonealansätze durchtrennen. Fassen Sie mit einer Pinzette die retroperitonealen paarigen Nieren und durchtrennen Sie das Bauchfell an ihrer Basis. Heben Sie die Nieren aus der Höhle und durchtrennen Sie alle Peritonealansätze. Fassen Sie dann das Nervenbündel am Ischiasplexus mit einer Pinzette und durchtrennen Sie die Nerven an der Stelle, an der sie aus der Zölomhöhle austreten. Hebe das Nervenbündel an und durchtrenne es wieder an der Verbindung mit der Wirbelsäule. Entfernen Sie nun die Stecknadeln und drehen Sie das Tier auf die Bauchseite. Stecken Sie die Gliedmaßen wieder fest und wählen Sie eine hintere Gliedmaße für die Probenahme aus, indem Sie den Fuß feststecken. Exzidieren Sie einen mandelförmigen Hautabschnitt über dem Gastrocnemius und der Tibio-Fibularegion. Fassen Sie die Rückenhaut und machen Sie einen seitlichen Schnitt um die Körpermitte des Tieres. Um einen durchgehenden Kreisschnitt zu erstellen. Entfernen Sie die Stifte, befestigen Sie die Beine in einer Hand und greifen Sie mit einer Rattenzahnzange nach der vorderen Rückenhaut. Häuten Sie das Tier, indem Sie die Rückenhaut kräftig über Kopf und Arme ziehen. Um die Thymusdrüse zu entnehmen, identifizieren Sie die Fettmasse, die das Kiefergelenk bedeckt, und schneiden Sie den hinteren Rand der Masse ab, wo sie mit dem rosa Muskelgewebe verschmilzt. Schneiden Sie mit einer Iridektomieschere die Masse aus dem Knochen ab, die Melanophorencluster freilegt, falls vorhanden. Schneiden Sie dann das Gewebe ab, um Muskeln oder Knorpel zu entfernen. Stecken Sie als Nächstes das Tier fest und wählen Sie ein Auge aus. Führen Sie eine gebogene Iridektomieschere in die Augenhöhle ein und schneiden Sie vorsichtig um die Krümmung des Auges herum, um Muskelansätze zu lösen. Zum Schluss schiebst du die Schere tiefer in die Augenhöhle und schneidest den Sehnerv hinter dem Auge durch. Löse das Auge aus seiner Augenhöhle und schneide alle verbleibenden Muskeln ab. Durch dieses Verfahren wurden alle wichtigen Organe innerhalb einer Stunde nach der Euthanasie entnommen, gespült und getrimmt.