Comet-Assay zur Quantifizierung von DNA-Schäden in FLT3-Mutanten-exprimierenden 32D-Zellen nach Exposition gegenüber Typ-I- und Typ-II-FLT3-Inhibitoren

Dieses Protokoll beschreibt eine effektive Methode zur Quantifizierung des Unterschieds in der DNA-Schädigung, die durch Typ-I- und Typ-II-Inhibitoren in FLT3-mutierten Zellen durch Anwendung des Comet-Assays induziert wird.

Wir verwenden den Comet-Assay, um die Genotoxizität von Typ-I- und Typ-II-FLT3-Inhibitoren auf 32D-FLT3-mutierten Zellen systematisch zu bewerten und so wichtige Daten für die klinische Optimierung bei AML zu liefern. Während des Eingriffs verändert sich der Objektträger durch unsachgemäße Handhabung des mikrochirurgischen Werkzeugs, was zu Probenverlust führt. Die Forschung deutet darauf hin, dass AC220 als Typ-II-Inhibitor schwerere DNA-Schäden an FLT3-mutierten Zellen verursacht, was entscheidende Erkenntnisse für die Entwicklung von Kombinationstherapien liefert, indem die Anfälligkeit für DNA-Schäden ausgenutzt wird, um therapeutische Resistenzen zu überwinden.

Untersuchung des Wirkmechanismus von FLT3-Inhibitoren bei der Behandlung von AML und Entwicklung von Dual-Drug- oder Multi-Drug-Kombinationstherapiestrategien auf Basis von FLT3-Inhibitoren. Bereiten Sie zunächst mit einer Pipette eine Mischung aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt und Zellsuspension in 1,5-Milliliter-Röhrchen vor und mischen Sie sie vorsichtig. Dispensieren Sie 55 Mikroliter Aliquots des Agarose-Zellgemisches mit einer Pipette, die in einem 45-Grad-Winkel gehalten wird, auf Kometenobjektträger.

Legen Sie dann die mit der Mischung beschichteten Objektträger 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius in eine dunkle Umgebung. Tauchen Sie die erstarrten Objektträger in vorgekühlte Lyselösung und inkubieren Sie sie mindestens eine Stunde lang bei vier Grad Celsius, um die Objektträger vor Licht zu schützen. Entfernen Sie nach der Lyse die Objektträger aus der Lyselösung.

Saugen Sie mit einer Pipettenpistole vorsichtig so viel Restflüssigkeit wie möglich aus der Umgebung des Paddels auf. Legen Sie dann die Objektträger in alkalischen Elektrophoresepuffer und lassen Sie sie eine Stunde lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln voräquilibrieren. Legen Sie nun die Objektträger in die Elektrophoresekammer.

Um die Objektträger vollständig einzutauchen, fügen Sie genügend vorgekühlte alkalische Elektrophoreselösung hinzu. Führen Sie die Elektrophorese 30 Minuten lang bei 24 Volt mit konstantem Strom durch, wobei ein voräquilibrierter Puffer verwendet wird, um DNA-Schäden zu reduzieren. Verwenden Sie nach der Elektrophorese eine Pipettenpistole, um den alkalischen Elektrophoresepuffer aus der Umgebung des Objektträgers zu aspirieren.

Tauchen Sie die Objektträger fünf Minuten lang in doppelt destilliertes Wasser und tauchen Sie sie dann fünf Minuten lang in 70%iges Ethanol. Legen Sie die Objektträger zum Trocknen 15 Minuten lang in einen auf 37 Grad Celsius eingestellten Inkubator. Tragen Sie als Nächstes ein 100-Mikroliter-Aliquot YeaRed-Nukleinsäurefärbung auf jede Vertiefung des Objektträgers auf.

Inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei 28 Grad Celsius in einer lichtgeschützten Umgebung. Spülen Sie die Objektträger vorsichtig mit Wasser ab, um überschüssige Flecken zu entfernen, und trocknen Sie sie in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Der Comet-Assay wurde systematisch eingesetzt, um differentielle DNA-Schadensprofile zu quantifizieren, die durch Gilteritinib und AC220 in FLT3-mutierten Zelllinien induziert wurden.

Die quantitative Analyse des Schwanz-DNA-Prozentsatzes bestätigte, dass beide Verbindungen die DNA-Schäden nach zwei, vier und sechs Stunden signifikant erhöhten, wobei AC220 zu jedem Zeitpunkt höhere Schadensniveaus als Gilteritinib verursachte. Alle Moment-Tail-Messungen spiegelten den Tail-DNA-Trend wider, mit statistisch signifikanten Anstiegen für beide Behandlungen von zwei bis sechs Stunden und höheren OTM-Werten, die in der AC220-Gruppe durchweg beobachtet wurden.