Name: Comet-Assay zur Quantifizierung von DNA-Schäden in FLT3-Mutanten-exprimierenden 32D-Zellen nach Exposition gegenüber Typ-I- und Typ-II-FLT3-Inhibitoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: Erfahren Sie, wie der Comet-Assay DNA-Schäden durch Typ-I- und Typ-II-FLT3-Inhibitoren in 32D-Zellen quantifiziert. Diese Methode liefert entscheidende Daten zur Optimierung von Therapiestrategien bei akuter myeloischer Leukämie.

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1. Aufbau eines DNA-Schadensmodells in 32D-Zellen mit FLT3-ITD-Mutationen 18
<ol>
	<li>Rückgewinnung von Zellen<ol>
		<li>Mit einer Pinzette werden kryokonservierte FLT3-ITD-mutierte 32D-Zellen (gelagert bei -80 °C) schnell übertragen. Entnehmen Sie Kryoröhrchen mit einer Pinzette und tauchen Sie sie sofort für genau 60 s in ein temperaturgeregeltes Wasserbad (37 °C ± 0,5 °C), um das kontrollierte Auftauen abzuschließen. HINWEIS: Schütteln Sie die Kryoröhrchen während des Auftauens intermittierend, um eine gleichmäßige Erwärmung zu gewährleisten.</li>
		<li>Die kryokonservierten Proben werden bei 150 × g für 5 min bei 25 °C ± 1 °C zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig mit sterilen serologischen Pipetten abgesaugt, während das Zellpellet erhalten bleibt.</li>
		<li>Geben Sie 1 ml vollständiges Wachstumsmedium (RPMI 1640 + 10 % fötales Rinderserum + 1 % Penicillin/Streptomycin) in das Kryokonservierungsröhrchen. Führen Sie eine sanfte Verreibung durch 10 aufeinanderfolgende Pipettierzyklen (1 ml Volumen) durch, um eine vollständige Resuspension zu gewährleisten. Übertragen Sie die Zellsuspension in eine 100-mm-Zellkulturschale und fügen Sie 7 ml vollständiges Medium hinzu, um ein Endvolumen von 8 mL zu erreichen.</li>
		<li>Bewegen Sie das Kulturgefäß vorsichtig mit fünf horizontalen und fünf rotierenden Bewegungen. Halten Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37,0 °C ± 0,2 °C mit 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit. Vor der experimentellen Verarbeitung 24 Stunden inkubieren.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bewertung der Zellviabilität<ol>
		<li>Für das Experiment werden FLT3-ITD-mutierte 32D-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase mit gutem zellulären Status ausgewählt. HINWEIS: Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase haben in der Regel einen kurzen Teilungszyklus und eine hohe Häufigkeit der Zellteilung.<ol>
			<li>Beobachten Sie die Morphologie und den Wachstumszustand von FLT3-ITD-mutierten 32D-Zellen mit einem Elektronenmikroskop. Stellen Sie sicher, dass die Kriterien für die Schwellenwerte für die Zellproliferation erfüllt sind: Suchen Sie nach Zellen in Form eines einzigen Kügelchens mit glatten Kanten, gleichmäßiger Dispersion, wenigen Aggregaten, einheitlicher Zellgröße, intakter Plasmamembranintegrität und Zelltrümmern &lt; 5 %.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Verwenden Sie einen Zellzähler, um die Konzentration der Zellsuspension zu bestimmen. HINWEIS: Mischen Sie die Zellsuspensionen (10 aufeinanderfolgende Pipettierzyklen mit 1 ml sterilen Spitzen bei 50 % maximaler Pipettengeschwindigkeit).</li>
		<li>Standardisieren Sie die Zellsuspension auf 2,0 × 105 Zellen/ml in vollständigem Wachstumsmedium durch iterative Verdünnung. Dispensieren Sie mit einer Pipette 50 μl Aliquots in die zentralen Vertiefungen (B2-G7) einer 96-Well-Platte mit flachem Boden. Füllen Sie die peripheren Vertiefungen (A1-H12) mit 100 μl sterilem PBS, um die Feuchtigkeit zu erhalten und Randverdunstungseffekte zu minimieren.</li>
		<li>Herstellung von FLT3-Inhibitor-haltigem Medium: Wählen Sie neun Wells in einer 12-Well-Zellkulturplatte aus und markieren Sie sie gemäß der FLT3-Inhibitor-Konzentrationsleiter (0, 3,90625, 7,8125, 15,625, 31,25, 62,5, 125, 250, 500 und 1000 nM). Geben Sie 400 μl vollständiges Medium in die mit 10,0 μM gekennzeichneten Vertiefungen und 200 μl vollständiges Medium in die verbleibenden Vertiefungen.<ol>
			<li>Verdünnung von Gilteritinib: Geben Sie mit einer Pipettenpistole 4 μl 100 μM Gilteritinib-Reagenz (Gilteritinib in Dimethylsulfoxid) in jede der Vertiefungen, die mit 1000 nM markiert sind, und mischen Sie die Lösung gründlich. 200 μl 1000 nM Gilteritinib in die mit 500 nM gekennzeichneten Vertiefungen pipettieren und mischen; Pipettieren Sie dann 200 μl 500 nM Gilteritinib in die mit 250 nM gekennzeichneten Vertiefungen und mischen Sie. Nehmen Sie jedes Mal 200 μl der vorherigen Verdünnung in die nächste Vertiefung und mischen Sie, um die gewünschte Konzentration zu erreichen.</li>
			<li>AC220-Verdünnung: Geben Sie mit einer Pipettierpistole 4 μl 100 μM AC220-Reagenz (AC220 in Dimethylsulfoxid) in jede der Vertiefungen, die mit 1000 nM markiert sind. Führen Sie Schritt 1.2.4.1 für die anderen Vertiefungen aus. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die FLT3-Inhibitor-Stammlösung in der Pipette vollständig in die Vertiefungen überführt wird, um Lösungsreste zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die Lösung gut gemischt ist, bevor Sie mit der Verdünnung fortfahren.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inkubation: Dispensieren Sie FLT3-Inhibitor-haltige Medien mit einer Pipette in dafür vorgesehene Vertiefungen (50 μl/Well). Bewahren Sie die 96-Well-Platte unter physiologischen Kulturbedingungen (37,0 °C ± 0,2 °C, 5 % CO2, 95 % Luftfeuchtigkeit) genau 72 Stunden ± 15 Minuten auf.</li>
		<li>Aliquotieren Sie 10 μl CCK-8-Reagenz mit einer Pipette in alle experimentellen und blinden Kontrollvertiefungen. Schützen Sie die Platte vor Licht und inkubieren Sie sie unter normoxischen Bedingungen (37 °C, 5 % CO2) für 2,0 h ± 10 min. HINWEIS: Geben Sie das Reagenz bei niedriger Pipettengeschwindigkeit mit einer Eintauchtiefe von 2 mm an der Spitze ab, um die Blasenbildung zu minimieren. Vermeiden Sie Luftblasen während der Probenzugabe, um Interferenzen mit den Außendurchmessermesswerten zu vermeiden.</li>
		<li>Nehmen Sie die 96-Well-Platte aus dem Inkubator und messen Sie die Extinktion bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader. Notieren Sie die Ergebnisse.</li>
		<li>Berechnen Sie die prozentuale Hemmung gemäß der Berechnungsformel IC50 : Hemmung (%) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68469/68469eq1.jpg" style="margin: auto;"> × 100% Die experimentelle Vertiefung des Arzneimittels bezeichnet die mit dem Arzneimittel behandelten Zellvertiefungen. Zellkontrollvertiefung bezeichnet Zellvertiefungen, die nicht mit dem Medikament behandelt wurden. Blinde Kontrollvertiefungen zeigen nur Medium ohne Zellen an.</li>
		<li>Analysieren Sie die normierten Dosis-Wirkungs-Daten durch nichtlineare Regression unter Verwendung eines logistischen Modells mit vier Parametern. Klicken Sie auf die Schaltfläche Kurve anpassen, um die Kurvenanpassung durchzuführen. Leiten Sie die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) aus der Modellkonvergenz ab (R2 &gt; 0,98, Restsumme der Quadrate &lt; 0,15) und berechnen Sie die 95%-Konfidenzintervalle durch 1000-Iterations-Bootstrap-Resampling.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA-Schädigungsexperiment von 32D-Zellen mit FLT3-ITD-Mutation, induziert durch FLT3-Inhibitor<ol>
		<li>Wählen Sie FLT3-ITD-mutierte 32D-Zellen mit Wachstumsschub (Populationsverdopplungszeit &lt; 24 Stunden) für die Beurteilung des DNA-Schadens aus.</li>
		<li>Zählen Sie die Zellen (siehe Schritt 1.2.2 für Details).</li>
		<li>Zellaussaat: Stellen Sie die Dichte der Zellsuspension auf 1 × 106 Zellen pro Schale ein, indem Sie eine Schale mit einem Durchmesser von 6 cm und 4 ml Zellsuspension pro Schale verwenden.</li>
		<li>Bereiten Sie drei Replikate für jede Inhibitorkonzentration vor: 55 nM gilteritinib: 4 ml Medium + 2,2 μl 100 μM Stamm, 0,15 nM AC220: 4 ml Medium + 6 μl 100 nM Stamm. Die Lösungen werden im Vortex-Mix gemischt und 15 Minuten lang bei 37 °C äquilibriert. Schütteln Sie die Röhrchen vorsichtig, um eine ausreichende Durchmischung zu gewährleisten. Aspirieren Sie das ursprüngliche Medium und ersetzen Sie es durch 4 ml/Schale mit frisch zubereitetem inhibitorhaltigem Medium unter Verwendung steriler serologischer Pipetten.</li>
		<li>Inkubieren Sie die behandelten Zellen unter physiologischen Bedingungen (37 °C, 5 % CO2, 95 % Luftfeuchtigkeit) für definierte Intervalle (0, 2, 4, 6 H). Sofortige Prozesszeit-Null-Kontrollen für die Bewertung von DNA-Schäden zu Studienbeginn.</li>
		<li>Trypanblau-Ausschluss-Assay<ol>
			<li>Zentrifugieren Sie die gesammelten Zellen bei 150 × g für 1 min. Der Überstand wird verworfen und die Zellen werden mit 1 ml Kulturmedium resuspendiert.</li>
			<li>Pipettieren Sie 100 μl resuspendierte Zellen in ein Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff, fügen Sie 100 μl Trypanblau-Färbung (2x) hinzu, mischen Sie vorsichtig und färben Sie sie 3 Minuten lang.</li>
			<li>Zählen Sie die Zellen (siehe Schritt 1.2.2 für Details).</li>
			<li>Berechnen Sie die Zellviabilität wie folgt: %Zellüberleben = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68469/68469eq2.jpg" style="margin: auto;"> × 100% HINWEIS: Für den Comet-Assay wurden nur Proben mit einer Lebensfähigkeit von ≥90 % verarbeitet.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Vorbereitung der Reagenzien und Vorbereitung der Zellprobe
<ol>
	<li>Die Lyselösung (enthält 2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 10, 1 % Triton X-100, 10 % DMSO) wird 30 Minuten lang im Kühlschrank bei 4 ΰC ± 0,5 °C äquilibriert.</li>
	<li>Schmelzende Agarose (LMA) bei 95 °C für 15 min schmelzen und dann in einem Wasserbad bei 37 °C aufbewahren, um eine Verfestigung zu verhindern.</li>
	<li>Bereiten Sie den alkalischen Elektrophoresepuffer (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH &gt;13) vor, indem Sie 12 g NaOH mit einer elektronischen Waage wiegen, 2 mL 500 mM EDTA-Lösung pipettieren und dann ddH2O hinzufügen, um bis zu 1 l des Puffers herzustellen.</li>
	<li>Zellernte<ol>
		<li>Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Die Zellsuspensionen werden bei 800 × g 5 min lang zentrifugiert. Die Überstände werden durch Vakuumfiltration abgesaugt.<ol>
			<li>Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 1 ml vollständigem Medium mit 1 ml-Pipettenspitzen mit breiter Bohrung, gefolgt von 10 vertikalen Inversionen.</li>
			<li>Zählen Sie die Zellen wie in Schritt 1.2.</li>
			<li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen bei 150 × g für 5 Minuten, um das gesamte Medium zu entfernen. Resuspendieren Sie die gewaschenen Zellen in kalziumfreiem PBS auf ~5,0 × 105 Zellen/ml.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Verfahren des Comet-Assays
<ol>
	<li>Bereiten Sie im Voraus Kometen-Assay-Objektträger und Zellproben vor. Bereiten Sie mit einer Pipette eine 10:1 (v/v) Mischung aus LMA, Agarose und Zellsuspension (5 × 105 Zellen/ml) in 1,5 ml-Röhrchen vor und mischen Sie vorsichtig. Dispensieren Sie 55 μl Aliquots des Agarose-Zell-Gemisches auf Kometenobjektträger mit einer Pipette, die in einem Winkel von 45° gehalten wird, wobei ein Abstand von 2 mm zur Objektträgeroberfläche eingehalten wird. Legen Sie die mit der Mischung beschichteten Objektträger 30 Minuten lang bei 4 °C auf, um Licht zu vermeiden. HINWEIS: Während der Zugabe des LMA und der Zellmischung zu den Komet-Assay-Objektträgern ist die Suspension langsam und gleichmäßig zu dosieren, um Blasenbildung zu verhindern und eine homogene Gelverteilung zu gewährleisten.</li>
	<li>Tauchen Sie die erstarrten Objektträger in eine vorgekühlte Lyselösung (enthält 2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 10, 1 % Triton X-100, 10 % DMSO) und führen Sie die Lyse für ≥1 h bei 4 °C unter lichtgeschützten Bedingungen durch.</li>
	<li>Entfernen Sie nach der Lyse den Objektträger aus dem Lysat und saugen Sie mit einer Pipettenpistole so viel Flüssigkeit wie möglich um das Paddel herum auf. Legen Sie dann den Objektträger in einen alkalischen Elektrophoresepuffer (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH &gt;13) und balkalibrieren Sie ihn 1 h lang bei 4 °C vor, wobei darauf zu achten ist, dass kein Licht vorhanden ist.</li>
	<li>Elektrophorese: Positionieren Sie die Objektträger in einer Elektrophoresekammer und fügen Sie ausreichend alkalische Elektrophoreselösung hinzu, um die Objektträger einzutauchen. Führen Sie die Elektrophorese bei 24 V (entspricht 0,74 V/cm) mit konstantem Strom (300 mA) für 30 Minuten unter Verwendung eines voräquilibrierten Puffers (4 °C) durch, um DNA-Schäden zu minimieren.</li>
	<li>Neutralisation: Nach der Elektrophorese die alkalische Elektrophoreselösung mit einer Pipettenpistole aus dem Objektträger absaugen, die Objektträger 2 x 5 min in dH2O tauchen und anschließend 5 min in 70%iges Ethanol tauchen. Trocknen Sie die Objektträger in einem Inkubator bei 37 °C für 15 min.</li>
	<li>Färbung: Ein 100 μL Aliquot von 1x YeaRed Nukleinsäure-Färbung pro Vertiefung auftragen und 30 min bei Raumtemperatur unter lichtgeschützten Bedingungen inkubieren. Entfernen Sie überschüssige Flecken durch sanftes wässriges Spülen und anschließendes thermisches Trocknen bei 37 °C.</li>
	<li>Bildgebung: Führen Sie die Fluoreszenzvisualisierung mit einem Fluoreszenzmikroskop durch, das mit einem 4-fach-Objektiv ausgestattet ist, wobei die digitale Bildaufnahme unter standardisierten Belichtungsbedingungen durchgeführt wird.</li>
</ol>
4. Datenverarbeitung
<ol>
	<li>Führen Sie eine quantitative Bildanalyse durch, um Standard-Kometenparameter zu bestimmen, einschließlich Schweif-DNA (%), Olivenschweifmoment und Schweiflänge (μm).<ol>
		<li>Öffnen Sie die Schnittstelle der Software (Abbildung 5).</li>
		<li>Importieren Sie ein Bild in die Software, klicken Sie auf Datei und dann auf Datei auswählen , um das Bild, das Sie analysieren möchten, in die Software zu importieren. Halten Sie anschließend die Maustaste gedrückt und ziehen Sie, bis ein blaues Feld erscheint. Ziehen Sie das blaue Feld, um sicherzustellen, dass die Zelle, die Sie analysieren möchten, in dem Feld eingeschlossen ist. Mit der Option Anpassen in der Abbildung können Sie die Position des Rahmens so anpassen, dass die gesamte Zelle einbezogen wird (Abbildung 5).</li>
		<li>Bevor Sie die Analyse starten, klicken Sie auf Start und dann auf Analysieren. Die Ergebnisse der Einzelzellanalyse werden auf der rechten Seite unter "Profile" angezeigt. Nachdem Sie jede Zelle analysiert haben, klicken Sie auf Speichern. Die Parameter, die erkannt werden können, werden auf der rechten Seite von "Profile" angezeigt, und die numerischen Werte der verschiedenen Parameter werden unten angezeigt. Klicken Sie abschließend auf Datei | Exportieren von Ergebnissen. Zu den erhaltenen Ergebnissen gehören HeadArea, TailArea, HeadDNA, TailDNA, HeadDNA%, TailDNA%, HeadRadius, TailLength, CometLength, HeadMeanX, TailMeanX, TailMoment und OliveTailMoment.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Swaminathan, M., Wang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+therapies+for+AML%3A+A+round-up+for+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Clin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Novel therapies for AML: A round-up for clinicians.</a> Expert Rev Clin Pharmacol. 13 (12), 1389-1400 (2020).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Beyotime</td><td>ST066</td><td></td></tr><tr><td>1x YeaRed Nukleinsäure-Färbung</td><td>Yeasen</td><td>10202ES</td><td></td></tr><tr><td>32D-ZELLE</td><td>Cobioer</td><td>CBP60995</td><td></td></tr><tr><td>AC220</td><td>TargetMol</td><td>Nr. T2066</td><td></td></tr><tr><td>Zellzähl-Kit-8</td><td>Dojindo</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>Zell-Zählplatte</td><td>QiuJing</td><td>XB-K-25</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Thermo</td><td>51032872</td><td></td></tr><tr><td>Comet Assay Software-Projekt (CASP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CometAssay Kit&nbsp;</td><td>Trevigen</td><td>4250-050-K</td><td></td></tr><tr><td>Zytation 5</td><td>BioTek</td><td>16280004</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PFANNE</td><td>ST30-3302</td><td></td></tr><tr><td>Gilteritinib</td><td>TargetMol</td><td>Nr. T4409</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 9.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeits-Zentrifuge</td><td>Thermo</td><td>&nbsp; Artikel-Nr.: 9AQ2861</td><td></td></tr><tr><td>L-1000XLS+ Pipetten</td><td>Rainin</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>L-20XLS+ Pipetten</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>Behälter für flüssigen Stickstoff</td><td>Mvecryoge</td><td>YDS-175-216</td><td></td></tr><tr><td>Multiskan FC Mikroplatten-Photometer</td><td>Thermo</td><td>1410101</td><td></td></tr><tr><td>Na2OH</td><td>DAMAO</td><td>1588</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio GmbH</td><td>Nr. P1020</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung, 100x</td><td>Beyotime</td><td>Nr. C0222</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 mittel</td><td>Gibco</td><td>C22400500BT</td><td></td></tr><tr><td>Trinokulares Lebendzellmikroskop</td><td>Motic</td><td>1.1001E+12</td><td></td></tr><tr><td>Ultratiefkühlschrank</td><td>Haire</td><td>V118574</td><td></td></tr></tbody></table>

comet-assay zur quantifizierung von dna-schäden in flt3-mutanten-exprimierenden 32d-zellen nach exposition gegenüber typ-i- und typ-ii-flt3-inhibitoren

Comet Assay to Quantify DNA Damage in FLT3 Mutant-expressing 32D Cells after Exposure to Type I and Type II FLT3 Inhibitors

Der Comet-Assay wurde systematisch eingesetzt, um differentielle DNA-Schadensprofile zu quantifizieren, die durch Gilteritinib und AC220 in FLT3-mutierten Zelllinien induziert wurden. Die Analysen zeigten, dass der Unterschied in der DNA-Schädigung zwischen Zellpopulationen, die nicht mit Gilteritinib und AC220 behandelt wurden, statistisch nicht signifikant war (P &gt; 0,05). Dosisabhängige Erhöhungen der Schwanz-DNA (%) und der Olive Moment Tail (OMT)-Werte erreichten eine statistische Signifikanz (P &lt; 0,05) nach ei...

Comet-Assay zur Quantifizierung von DNA-Schäden in FLT3-Mutanten-exprimierenden 32D-Zellen nach Exposition gegenüber Typ-I- und Typ-II-FLT3-Inhibitoren

FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT3), a class III receptor tyrosine kinase, exhibits a mutation frequency of approximately 30% in acute myeloid leukemia ...

comet-assay-to-quantify-dna-damage-flt3-mutant-expressing-32d-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das Video zeigt den Kometen-Assay zum Nachweis von DNA-Schäden nach Exposition gegenüber schädlichen Stoffen. Unter alkalischen Bedingungen wickelt sich die DNA ab und denaturiert, und bei der Elektrophorese wandern die unbeschädigte und die beschädigte DNA unterschiedlich im Agarosegel und bilden eine kometenförmige Struktur. Die langsam wandernde unbeschädigte DNA bildet den kreisförmigen Kometenkopf, während die schnell wandernden beschädigten DNA-Fragmente den länglichen Kometenschweif...

Comet Assay zur Detektion von DNA-Schäden in Zellen

Der Comet Assay ist ein effizientes Mittel zur Feststellung von Einzel-und Doppelstrang-Brüche, einschließlich Alkali-labile Websites und DNA-DNA/DNA-protein Cross-Links auf der DNA in allen Zellen, einschließlich Neuronen im Hippocampus. Die Methode nimmt den Vorteil dieser differentielle Migration von DNA in einem elektrischen Feld aufgrund von Unterschieden in Menge an DNA-Schäden.

Testen DNA Damage in Hippocampus-Neuronen mit dem Comet Assay

Wir beschreiben hier eine Plattform, die Comet-Assay Nachweis von DNA-Schäden mit beispielloser Durchsatz ermöglicht. Die Gerätemuster Säugerzellen in einem Microarray und ermöglicht die parallele Verarbeitung von 96 Proben. Der Ansatz erleichtert Analyse der Ausgangsniveau von DNA-Schäden, die Exposition induzierten DNA-Schäden und DNA-Reparatur-Kinetik.

CometChip: Eine Hochdurchsatz-96-Well-Plattform für Mess DNA-Schäden in menschlichen Zellen Microarray

Die Comet-Assay ist eine effiziente Methode um zu erkennen, dass DNA-Schäden einschließlich Einzel- und Doppelstrang-DNA bricht. Wir beschreiben basische und neutrale Comet Assays zur Messung der DNA-Schäden in den Krebszellen, die therapeutische Wirkung der Chemotherapie zu bewerten.

Bewertung von In-vitro- DNA-Schäden mit Comet-Assay

Dieses Protokoll beschreibt mehrere Verfahren zur Herstellung hochwertiger gefrorener Gewebeproben zum Zeitpunkt der Nekropsie zur Verwendung im Kometentest zur Beurteilung von DNA-Schäden: 1) Hackfleisch, 2) abgekratzte Epithelzellen aus dem Magen-Darm-Trakt und 3) gewürfeltes Gewebe Eine Homogenisierung mit einem Gewebeminincing-Gerät erforderlich.

Verwendung von gefrorenem Gewebe im Kometentest zur Bewertung von DNA-Schäden

Der Kometentest ist ein beliebtes Mittel zum Nachweis von DNA-Schäden. Diese Studie beschreibt einen Ansatz zum Ausführen von Objektträgern in repräsentativen Varianten des Kometenassays. Dieser Ansatz erhöhte die Anzahl der Proben signifikant und verringerte gleichzeitig die Assay-Laufzeit, die Anzahl der Objektträgermanipulationen und das Risiko einer Beschädigung von Gelen.

Ein Hochdurchsatz-Comet-Assay-Ansatz zur Beurteilung zellulärer DNA-Schäden

Verzögerte Überempfindlichkeitsreaktionen (DTH) ist eine entzündliche Reaktion durch CCR7-Effektor-Memory-T-Lymphozyten vermittelt. Hier zeigen wir, wie die aktive DTH in Lewis-Ratten induzieren und Überwachung der entzündlichen Reaktion.

Induktion und Überwachung von Active Delayed Type Überempfindlichkeit (DTH) in Ratten

Regulatorische T-Zellen: Therapeutische Potenzial zur Behandlung von Transplantatabstoßung und Typ-I-Diabetes

Verzögerte Überempfindlichkeitsreaktionen (DTH) ist eine entzündliche Reaktion durch CCR7-Effektor-Memory-T (TEM)-Lymphozyten vermittelt. Hier zeigen wir, wie um Antigen-spezifische TEM-Zellen zu aktivieren, bewegen Adoptiveltern DTH in Lewis-Ratten und überwachen die entzündliche Reaktion.

Induktion und Überwachung von Adoptive Allergien vom verzögerten Typ in Ratten

Ein detailliertes Protokoll ist für die Darstellung der Echtzeit Bildung von DNA-Reparatur-Komplexe...

Imaging Mismatch Reparatur und zellulären Reaktionen auf DNA-Schäden in Bacillus subtilis</em

Erfahren Sie, wie der Comet-Assay DNA-Schäden durch Typ-I- und Typ-II-FLT3-Inhibitoren in 32D-Zellen quantifiziert. Diese Methode liefert entscheidende Daten zur Optimierung von Therapiestrategien bei akuter myeloischer Leukämie.

Comet-Assay zur Quantifizierung von DNA-Schäden in FLT3-Mutanten-exprimierenden 32D-Zellen nach Exposition gegenüber Typ-I- und Typ-II-FLT3-Inhibitoren (Video) | JoVE Journal

Comet-Assay zur Quantifizierung von DNA-Schäden in FLT3-Mutanten-exprimierenden 32D-Zellen nach Exposition gegenüber Typ-I- und Typ-II-FLT3-Inhibitoren

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