Split-Hybridisierungssonde unter Verwendung eines DNA-Fluoreszenz-Leuchtaptamers als Signalreporter für die sequenzspezifische Nukleinsäureanalyse

Wir entwickeln neuartige Fluoreszenz-Hybridisierungssonden für die sequenzspezifische Nukleinsäureanalyse. In jüngster Zeit wurden die Tools für die Hybridisierungsanalyse um Assays erweitert, die die Vorteile von CRISPR-Cas-Systemen nutzen. Derzeit werden modernste Hybridisierungssonden wie TaqMan und molekulare Beacon-Sonden am häufigsten zur Analyse von Nukleinsäurezielen eingesetzt.

Die genaue Detektion von Einzelnukleotidsubstitutionen und Nukleinsäurezielen ist nach wie vor eine praktische Herausforderung. Unser Protokoll stellt das erforderliche Maß an Zellaktivität sicher und bietet gleichzeitig eine markierungsfreie Fluoreszenzsignalauslesung. Entwerfen Sie zunächst die Sequenzen von zwei unmodifizierten DNA-Oligonukleotidsträngen, die SLAS bilden.

Verwenden Sie ein Fragment, das Nukleotide für 6 bis 39 von DAP-10-42 enthält. Wandeln Sie den Stamm 1, bestehend aus den Nukleotiden 1 bis 8 und 36 bis 42, in den Stamm 1 Prim um, indem Sie einen prallen Thymin an Position 5 entfernen, den Stamm auf vier Basenpaare kürzen und ein terminales Cytosin-Guanin-Basenpaar hinzufügen. Die Nukleotide 9 bis 29 sind in den einen SLAS-Strang und die Nukleotide 30 bis 35 in den anderen einzuschließen.

Verlängern Sie die drei primenterminalen Sequenzen des Fragments mit den Nukleotiden 9 bis 29 durch Zugabe von Desoxy-GGTCAT. Verlängern Sie dann die Sequenz der fünf Primzahlen des 30- bis 35-Fragments mit Desoxy-TGACC, um einen Sechs-Basen-Paarstamm 2 zu bilden. Verlängern Sie nun Stamm 1 prime auf beiden Strängen mit Desoxy-TT-Linkern und DNA-Sequenzen, die zum Nukleinsäureziel komplementär sind.

Daraus ergeben sich die Sequenzen der Stränge SLAS-U und SLAS-S, aus denen die Sonde besteht. Machen Sie SLAS-S komplementär zu einer Region mit 7 bis 10 Nukleotiden. Dazu gehört auch die Einzelnukleotid-Substitutionsstelle.

Stellen Sie dann sicher, dass der Zielbindungsarm von SLAS-U komplementär zu einem 15 bis 25 Nukleotidfragment ist, das an die SLAS-S-Region angrenzt. Bewerten Sie die Schmelztemperaturen der Zielbindungsduplexe mithilfe des UNAFold-Webservers. Klicken Sie auf die Registerkarte INAMelt.

Gehen Sie zu Anwendungen, und wählen Sie Zwei-Zustands-Schmelzhybridisierung aus. Geben Sie die interagierenden Sequenzen in der Reihenfolge von fünf Primzahlen bis drei Primzahlen in die Felder links und rechts ein. Stellen Sie dann die Assay-Temperatur auf 22 Grad Celsius ein und geben Sie die monovalenten und zweiwertigen Kationenkonzentrationen auf 20 Millimolare bzw. 25 Millimolare Ionen ein.

Passen Sie die Konzentrationen der interagierenden Sequenzen im entsprechenden Feld an. Klicken Sie auf Senden, und überprüfen Sie die Werte für Gibbs-Energieänderung, EnthalpY, Entropie und Schmelztemperatur für die entsprechenden Duplexe. Vergewissern Sie sich, dass die Schmelztemperaturen für perfekt aufeinander abgestimmte Ziele und die Zielbindungsarme von SLAS-S und SLAS-U über der Assay-Temperatur von 22 Grad Celsius liegen.

Stellen Sie sicher, dass der Duplex zwischen SLAS-S und einem nicht übereinstimmenden Ziel Schmelztemperaturen unterhalb der Assay-Temperatur ergibt, um die Spezifität zu erhalten. Passen Sie bei Bedarf die Längen der Zielbindungsarme an, um diese Bedingungen zu erfüllen. Beziehen Sie die finalisierten SLAS-U- und SLAS-S-Oligonukleotidstränge von einem kommerziellen DNA-Lieferanten oder synthetisieren Sie sie intern mit einem automatisierten DNA-Synthesizer.

Bereiten Sie Stammlösungen von Auramine O, SLAS-S, SLAS-U und Assay-Puffer vor. Bereiten Sie den Mastermix vor, der alle Assay-Komponenten außer dem Ziel enthält. Füge nukleasefreies Wasser zu den letzten fünf mal sechsten Volumen des Mastermixes hinzu.

Dann den Mastermix vortexen und drehen. Geben Sie 50 Mikroliter in jedes Probenröhrchen. Beschriften Sie als Nächstes eine Probe als Leerprobe ohne Ziel und eine als Positivkontrolle.

Geben Sie 10 Mikroliter der zielhaltigen Probe in ein Röhrchen mit dem Mastermix, um eine 60-Mikroliter-Probe herzustellen. Für den Rohling fügst du 10 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzu. Pipettieren Sie dann 10 Mikroliter synthetisches DNA-Oligonukleotid, das die Zielsequenz enthält, in das Positivkontrollröhrchen.

Alle Proben in der Zentrifuge mit einer Mikrozentrifuge kurz vermischen. Dann inkubieren Sie die Röhrchen bei 22 Grad Celsius für 10 bis 60 Minuten. Messen Sie die Fluoreszenz bei 540 Nanometern nach Anregung bei 475 Nanometern mit einem Fluoreszenzspektrophotometer.

SLAS wurde so zugeschnitten, dass es auf ein bestimmtes Fragment des NANOGP8-Gens abzielt. Ziel M war vollständig komplementär zum SLAS-S-Strang, während Ziel MM eine Cytosin-Nukleotidposition 1, 423 aufwies, was zu einer Fehlanpassung mit SLAS-S führte. Nach Zugabe des vollständig komplementären Ziels M stieg die Fluoreszenz stetig an und erreichte nach 45 bis 50 Minuten ein Plateau.

Ein klares Signal war jedoch innerhalb von 10 Minuten mit einem Signal-zu-Blind-Verhältnis von 10 nachweisbar. SLAS zeigte ein hohes Fluoreszenzsignal für vollständig übereinstimmende Ziele, jedoch nicht für nicht übereinstimmende Ziele oder Leerproben. Die Fluoreszenzleistung stieg linear mit der Zielkonzentration auf bis zu 500 Nanomolar an, was die Quantifizierung und Bestimmung der Nachweisgrenzen ermöglichte. PCR-amplifizierte Proben zeigten unterschiedliche Signalpegel, wobei nur Probe 2 den Fluoreszenzschwellenwert von 2 überschritt.

Basierend auf der Kalibrierkurve wurde die Konzentration von NANOGP8 Amplikon in Probe 2 auf 124+ bzw. 13 Nanomolar geschätzt. Die Fluoreszenzdetektion des SLAS-Signals war sowohl bei einem Tisch-Spektralphotometer als auch bei einem tragbaren Fluorometer konsistent. Ein Signal-zu-Blind-Verhältnis von über 20 wurde auch visuell mit UV-Licht beobachtet.