Name: Echtzeit-Stoffwechselnachweis in lebenden Zellen mittels hyperpolarisierter 13C NMR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-08T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Erfahren Sie die Echtzeit-Stoffwechselmessung in lebenden Zellen mittels hyperpolarisierter ¹³C-NMR-Spektroskopie. Diese Methode ermöglicht nicht-invasive Analysen für metabolische Studien und Arzneimittelscreening.

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<li>Sriram, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurement+of+hyperpolarized+lactate+production+and+efflux+as+a+biomarker+of+tumor+aggressiveness+in+an+MR+compatible+3D+cell+culture+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Real-time measurement of hyperpolarized lactate production and efflux as a biomarker of tumor aggressiveness in an MR compatible 3D cell culture bioreactor.</a> NMR Biomed. 28 (9), 1141-1149 (2015).</li>
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<li>Hill, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+free+approach+to+kinetic+analysis+of+real-time+hyperpolarized+13C+magnetic+resonance+spectroscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Model free approach to kinetic analysis of real-time hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy data.</a> PLoS One. 8 (9), e71996(2013).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>[1-13C] Brenztraubensäure</td><td>Cambridge Isot ope Laboratories, Inc.</td><td>CLM-8077</td><td></td></tr><tr><td>3D-Drucker</td><td>Elegoo</td><td>Saturn 2</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>06729-55</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Externes Zirkulationskit für Pumpe</td><td>ALS EINHEIT</td><td>1-4141-02</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Flanschloser Verschraubungssatz</td><td>GL Sciences Inc.</td><td>6010-46390</td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillare mit Kern</td><td>Narishige</td><td>GDC-1.5</td><td>Innendurchmesser ~0,9 mm, Länge 90 mm</td></tr><tr><td>Magnetische Umwälzpumpe</td><td>ALS EINHEIT</td><td>1-4141-01</td><td></td></tr><tr><td>MestReNova</td><td>Mestrelab-Forschung</td><td></td><td>Software zur Verarbeitung und Analyse von NMR-Spektraldaten</td></tr><tr><td>Meine Spritze</td><td>Nipro Corporation</td><td>8277</td><td>0,5 mL/100U, 30G x 10 mm, 140 Stück</td></tr><tr><td>OX063</td><td>&nbsp; Oxford Instruments Co. Ltd.&nbsp; und Polarize IVS Co. Ltd.&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>PEEK-Rohr</td><td>ALS EINHEIT</td><td>3-780-05</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>26252-94</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltische Bio Mini-Pumpe</td><td>ATTO</td><td>1221200</td><td>Hochpräziser, breiter Durchflusstyp für stabilen Medienfluss</td></tr><tr><td>Harz</td><td>Siraya Tech</td><td>Rauchiges Schwarz</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Mittel</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>30264-85</td><td></td></tr><tr><td>Silikon/PTFE-Fläschchen-Septum</td><td>GL Sciences Inc.</td><td>1030-50009</td><td></td></tr><tr><td>Natriumalginat 80-120</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>194-13321</td><td></td></tr><tr><td>SPINit-Software</td><td>RS2D</td><td></td><td>NMR-Software im DNP-Polarisator</td></tr><tr><td>Schwamm</td><td>-</td><td>-</td><td>Handelsüblicher Schwamm im Zuschnitt zur Gelstabilisierung</td></tr><tr><td>Dreiwege-Absperrhahn</td><td>ALS EINHEIT</td><td>3-6247-04</td><td></td></tr><tr><td>Topspin</td><td>Bruker</td><td></td><td>Software zur Erfassung und Verarbeitung von NMR-Daten</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25 %)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>07086-74</td><td></td></tr><tr><td>UV-härtendes Harz</td><td>BONDIC</td><td>BD-SKCJ</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>ALS EINHEIT</td><td>1-5832-41</td><td>Thermischer Roboter TR Serie TR-1&alpha; für die Aufrechterhaltung von 37°; C-Temperatur</td></tr><tr><td>Wilmad NMR-Röhre mit Schraubverschluss</td><td>Sigma</td><td>Z271977</td><td>Frequenz 400 MHz, Durchmesser 10 mm, L 178 mm.</td></tr></tbody></table>

echtzeit-stoffwechselnachweis in lebenden zellen mittels hyperpolarisierter 13c nmr

Real-Time Metabolic Detection in Living Cells Using Hyperpolarized 13C NMR

In dieser Studie wurde ein fabriziertes System an die hyperpolarisierte 13-C-NMR-Spektroskopie gekoppelt, um den Pyruvatstoffwechsel in lebenden Zellen in Echtzeit zu messen. Die Hauptsignale, die im 1D 13C NMR-Spektrum detektiert wurden, entsprachen Pyruvat (ca. 171 ppm) und Laktat (ca. 183 ppm)21, was es uns ermöglichte, die metabolische Umwandlung von Pyruvat in Laktat unter physiologischen Bedingungen zu bewerten (Abbildung 4).
Spektrale Qualität und Signaldynamik In Abbildung 5 sind repräsentative Ergebnisse von wiederholten Messungen an derselben Probe mit SCCVII-Zellen – einer Plattenepithelkarzinomlinie der Maus, die häufig in hyperpolarisierten MRT-Studien verwendet wird – dargestellt. Die erste Messung zeigte einen deutlichen Anstieg des Laktatsignals, was auf eine aktive metabolische Umsetzung hinweist. Nachfolgende Messungen im Abstand von 1,5 h zeigten jedoch einen fortschreitenden Rückgang der Stoffwechselaktivität. Diese zeitabhängige Reduktion spiegelt wahrscheinlich biologischen Stress oder Anpassung wider, die durch die anfängliche Pyruvatinjektion induziert wurde. Bemerkenswert ist, dass eine ähnliche vorübergehende metabolische Modulation in vivo mit hyperpolarisierter MRT und EPRI berichtet wurde, bei denen die Sauerstoffversorgung des Tumors nach Pyruvatverabreichung vorübergehend abnahm22. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Wiederholbarkeit dieser Messungen eine zerstörungsfreie Verfolgung dynamischer metabolischer Veränderungen ermöglicht – ein Vorteil, der mit destruktiven Methoden nur schwer zu erreichen ist23.
Um die Anwendbarkeit dieses Protokolls auf andere Zelltypen zu bewerten, wurden zusätzliche Messungen mit HeLa-Zellen durchgeführt, einer weit verbreiteten menschlichen Krebszelllinie. Wie in Abbildung 6 gezeigt, zeigten HeLa-Zellen auch eine deutliche Umwandlung von Pyruvat in Laktat. Obwohl die Signalintensität aufgrund derT1-Relaxation allmählich abnahm, blieb das Signal-Rausch-Verhältnis während der gesamten Erfassungsperiode von 60 s ausreichend. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das derzeitige Protokoll breit anwendbar ist und als vielseitiges Werkzeug für die Echtzeit-Erstellung von Stoffwechselprofilen in verschiedenen Zelltypen dienen kann.
Während der schnelle Signalabfall eine inhärente Einschränkung der DNP-basierten NMR ist, minimiert unser In-situ-Mischsystem die Verzögerung zwischen Auflösung und Messung und erhöht dadurch die Nachweisempfindlichkeit. Weitere Verfeinerungen, wie z. B. die Optimierung der Gelmatrixzusammensetzung, können die Anwendbarkeit dieser Methode auf ein breiteres Spektrum biologischer Systeme erweitern.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Schematische Darstellung des gesamten Arbeitsablaufs von der Zellkultur bis zur hyperpolarisierten NMR-Messung. Der Prozess beginnt mit der Zellkultur (~2 Wochen), gefolgt von der Alginat-Gel-Vorbereitung (~60 min), um die Zellen für eine stabile Messung zu verkapseln. Als nächstes wird die Hyperpolarisation mit einem DNP-Polarisationssystem (~60 min) durchgeführt, und die NMR-Messung wird mit einem 400 MHz NMR-Spektrometer (~5 min) durchgeführt. Die Fotos auf der rechten Seite zeigen die entsprechenden Instrumente, die in diesem Workflow verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Aufbau eines Bioreaktors für die hyperpolarisierte NMR-Messung. (A) Schematische Darstellung des Bioreaktoraufbaus. Das Kulturmedium wird durch Einlass A in das NMR-Röhrchen eingeführt und anschließend in den Abfall geleitet. Alginatkügelchen, die lebende Zellen enthalten, werden in das NMR-Röhrchen gegeben. Bei hyperpolarisierten NMR-Messungen wird die hyperpolarisierte Sonde durch den Einlass B injiziert, der als hyperpolarisierter Sondeneinlass bezeichnet wird. (B) Foto des gesamten Bioreaktoraufbaus, wobei die Einlass- und Auslassschläuche deutlich beschriftet sind. (C) Nahaufnahme des Schalters für den Einlassschlauch mit Einlass A (mittlere Perfusion) und Einlass B (hyperpolarisierte Sondeninjektion). (D) CAD-Design und (E) repräsentatives Foto der 3D-gedruckten Schwammfixierungskomponente, die in der NMR-Röhre platziert ist. Das Bauteil umfasst ein Loch zur Führung einer Glaskapillare, die die hyperpolarisierte Substratlösung abgibt, und eine Plattform zum Halten eines Schwamms. Das Bauteil selbst liegt nicht dicht an der Innenwand des NMR-Schlauchs an; (F) Stattdessen wird ein Schwamm um ihn herum eingeführt, um die Lücke zu füllen. Diese Struktur stabilisiert das Bauteil und lässt das Abfallmedium durch den Schwamm nach oben fließen, wodurch ein zusätzliches Auslassloch überflüssig wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Zubereitung des Alginat-Gels. (A) Schematische Darstellung und (B) Foto der Alginat-Gel-Kugelbildungsvorrichtung. Das linke Bild zeigt den gesamten Aufbau, einschließlich des Zentrifugenröhrchens mit einer Spritze, die an seinem modifizierten Deckel befestigt ist. Das Bild oben rechts zeigt einen Deckel mit einem kleinen Loch für die Spritzenspitze, während das Bild unten rechts einen Deckel mit einer quadratischen Öffnung für eine stabile Positionierung der Spritze zeigt. Das Zentrifugenröhrchen ist mit 10 mL Calciumchloridlösung vorgefüllt, so dass die Alginatlösung, die aus der Spritzenspitze austritt, geliert werden kann, wodurch Alginat-Gelkugeln gebildet werden. (C) Repräsentatives mikroskopisches Bild, das die Morphologie von Alginat-Gelkugeln zeigt. (D) Repräsentatives mikroskopisches Bild, das die Morphologie von Alginat-Gelkugeln zeigt, die HeLa-Zellen enthalten. Maßstabsleiste = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig4.jpg"> 
Abbildung 4: Schematische Darstellung der Vorbereitungsschritte für die NMR-Messung und Hyperpolarisation. Während des ~60-minütigen DNP-Aufbauprozesses wird die NMR-Einrichtung parallel durchgeführt, um Verzögerungen zu minimieren. Die Vorbereitung umfasst das Laden von Alginatperlen in das NMR-Röhrchen, gefolgt von einer1-Stunden-Lock-Einstellung, Shimming und Sondenabstimmung, um sicherzustellen, dass das System für die sofortige Messung bereit ist. Nach Auflösung und in situ Mischen zeigt die zeitaufgelöste 13-C-NMR-Spektroskopie klare Pyruvat- und Laktatpeaks. Die bei etwa 171 ppm, 179 ppm und 183 ppm beobachteten Spitzenwerte entsprechen Pyruvat, Pyruvathydrat bzw. Laktat. Für die NMR-Messung wurden ca. 4 × 107 HeLa-Zellen verwendet, die in Alginat-Gel verkapselt waren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig5.jpg"> 
Abbildung 5: Zeitaufgelöster Nachweis von Pyruvat- und Laktatsignalen in wiederholten Messungen. Hyperpolarisierte 13C NMR-Spektren derselben SCCVII-Zellverkapselung Probe wurden in Abständen von 1,5 Stunden aufgenommen, um die Durchführbarkeit wiederholter zerstörungsfreier Messungen zu bewerten. Die Spitzenintensitäten von Pyruvat (offene Kreise) und Laktat (gefüllte Kreise, skaliert um 1000×) werden für jede Aufnahme im Zeitverlauf aufgetragen. (A) Erste Messung. (B) Die zweite Messung nach 1,5 h zeigt eine deutliche Verringerung der Laktatproduktion. (C) Die dritte Messung, nach weiteren 1,5 Stunden, bestätigte eine anhaltend niedrige Stoffwechselaktivität. Die quantitative Analyse auf der Grundlage der Fläche unter der Kurve (AUC) zeigte, dass das Verhältnis von [Laktat]/[Pyruvat] von 0,00134 (erste Messung) auf 0,00019 (zweite) und 0,00027 (dritte) abnahm. Die endgültige Zellkonzentration im Alginatgel betrug etwa 1,0 × 107 Zellen/ml (4 × 107 Zellen in 4 ml). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig6.jpg"> 
Abbildung 6: Umwandlung von Pyruvat in Laktat in HeLa-Zellen. Zeitaufgelöste hyperpolarisierte 13C NMR-Signale von Pyruvat und Laktat wurden in lebenden HeLa-Zellen gemessen. Die Intensität des Pyruvatsignals wird auf ihren Maximalwert zum Zeitpunkt Null normiert. Die Intensität des Laktatsignals wird zur besseren Sichtbarkeit um den Faktor 10:3 skaliert. Die quantitative Analyse auf der Grundlage der Fläche unter der Kurve (AUC) ergab ein [Laktat]/[Pyruvat]-Verhältnis von 0,00121. Die endgültige Zellkonzentration im Alginat-Gel betrug ungefähr 7,5 × 106 Zellen/ml (3 × 107 Zellen in 4 ml). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a> 
Ergänzende Abbildung 1. Repräsentative Bilder des Fläschchenseptums, das im Bioreaktorsystem verwendet wird. (A) Silikon/PTFE-Septum (9 mm Durchmesser) vor Gebrauch. (B) Das gleiche Septum in der Praxis, mit PEEK-Schlauch, der durch durchstochene Löcher eingeführt wird. Die Elastizität des Septummaterials ermöglicht es, dass es um den Schlauch herum wieder abdichtet und während der hyperpolarisierten Substratinjektion luftdichte Bedingungen aufrechterhält. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Figure%20S1.tif" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen</a>
Ergänzende Abbildung 2: Zeitaufgelöstes hyperpolarisiertes 13C NMR-Spektrum, aufgenommen nach externem Mischen. Repräsentatives zeitaufgelöstes Spektrum des [1-13C]-Pyruvatstoffwechsels, gemessen mit einem Tisch-NMR-System nach externem Mischen von hyperpolarisiertem Pyruvat und Zellen außerhalb des NMR-Röhrchens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Figure%20S2_RE.tif" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen</a>
Ergänzende Datei 1: CAD-Konstruktion des zylindrischen Halters. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Supplementary%20file%201_RE.ipt" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen</a>

Echtzeit-Stoffwechselnachweis in lebenden Zellen mittels hyperpolarisierter 13C NMR

The protocol presents a method to integrate an in-house-built bioreactor system with hyperpolarized 13C nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy to ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Die Empfindlichkeitssteigerung durch die auflösungsdynamische Kernpolarisation (DNP) ermöglicht es, Stoffwechselprozesse in Echtzeit mittels NMR und MRT zu verfolgen. Die Eigenschaften und Leistungen eines dedizierten Dissolution-DNP-Setups, das für die Untersuchung enzymatischer Reaktionen entwickelt wurde, werden diskutiert.

Die Auflösung dynamische Kernpolarisation Besetzung für Echtzeit-enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit Messungen von NMR

Ein dynamisches Phantom mit mehreren Kompartimenten wird verwendet, um einige biologische Aspekte zu simulieren, die für Stoffwechselstudien mit hyperpolarisierten Magnetresonanzmitteln von Interesse sind.

Die Verwendung eines Mehrfach Dynamische einzelner Enzym-Phantom für Studien von hyperpolarisiertem Magnetic Resonance Agents

Die dynamische Kernpolarisation mit anschließender Probenauflösung hat Echtzeitstudien des Stoffwechsels in biologischen Systemen ermöglicht. Hyperpolarisiertes [1-13C]pyruvat wurde verwendet, um die Laktatdehydrogenase-Aktivität in einer Prostatakarzinom-Zelllinie in vitro zu untersuchen.

hyperpolarisiertem 13 C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

Wir präsentieren ein Protokoll zur Messung der Magnetfeldabhängigkeit der Spin-Gitter-Entspannungszeit von 13C-angereicherten Verbindungen, die mittels dynamischer kernatischer Polarisation mit schneller feldzyklusweiseer Entspannungsometrie hyperpolarisiert werden. Insbesondere haben wir dies mit [1-13C]pyruvat nachgewiesen, aber das Protokoll könnte auf andere hyperpolarisierte Substrate ausgedehnt werden.

Messung der Spin-Lattice Relaxation Magnetfeldabhängigkeit von hyperpolarisiertem [1-13C]pyruvat

Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines NMR-Bioreaktors, um verkapselte menschliche Zellen bis zu 72 h lebensfähig zu halten, gefolgt von einer zeitaufgelösten NMR-Datenerfassung und -analyse in der Zelle. Die Methodik wird angewendet, um intrazelluläre Protein-Ligand-Interaktionen in Echtzeit zu überwachen.

Überwachung von Protein-Liganden-Interaktionen in menschlichen Zellen durch quantitative In-Zell-NMR in Echtzeit mit einem Bioreaktor mit hoher Zelldichte

Wir beschreiben einen Versuchsaufbau zur Verabreichung von hyperpolarisierten 13C-markierten Metaboliten im kontinuierlichen Perfusionsmodus an ein isoliertes perfundiertes Mausherz. Ein spezieller 13-C-NMR-Erfassungsansatz ermöglichte die Quantifizierung der metabolischen Enzymaktivität in Echtzeit, und eine multiparametrische 31-P-NMR-Analyseermöglichte die Bestimmung des ATP-Gehalts und des pH-Werts des Gewebes.

Untersuchung des kardialen Stoffwechsels im isolierten perfundierten Mausherz mit hyperpolarisierter [1-13 C]Pyruvat- und 13C/31P-NMR-Spektroskopie

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) wurden als wesentliche Technik, um Bild die Umwelt und die Interaktion bestimmter Proteine ​​und Farbstoffe, die in lebenden Zellen entstanden. FLIM fluoreszierender molekularer Rotoren ermöglicht die Zuordnung der Viskosität in lebenden Zellen.

Fluorescence Lifetime Imaging für molekulare Rotoren in lebenden Zellen

Wir haben ein Durchflusszytometer mit laserinduzierten Ultraschall zu erkennen zirkulierenden Melanomzellen als Frühindikator von Metastasen entwickelt.

Erkennung und Isolierung von zirkulierenden Melanomzellen mit Photoakustische Flowmetrie

Dieses Papier zeigt ein Protokoll, um die mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mittels Mikroindentation mit einem Atomic Force Microscope (AFM) zu charakterisieren.

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Dual-Kamera-Emissionsspaltanlagen für zwei-Farben-Fluoreszenz-Mikroskopie erzeugen Echtzeit-Bildsequenzen mit außergewöhnlichen optischen und zeitlichen Auflösung, einem Bedarf von lebenden Zellassays einschließlich Parallelplattenlaufkammer Adhäsions-Assays. Als Software wird verwendet, um Bilder von gleichzeitig erworben Emissionskanäle verschmelzen, pseudocolored Bildsequenzen produziert.

Gleichzeitig Capturing in Echtzeit Bilder in zwei Emissions Kanäle unter Verwendung eines Dual-Kamera-Emissions-Splitting-System: Anwendungen in der Zelladhäsion

Erfahren Sie die Echtzeit-Stoffwechselmessung in lebenden Zellen mittels hyperpolarisierter ¹³C-NMR-Spektroskopie. Diese Methode ermöglicht nicht-invasive Analysen für metabolische Studien und Arzneimittelscreening.

Echtzeit-Stoffwechselnachweis in lebenden Zellen mittels hyperpolarisierter ¹³C NMR

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