Echtzeit-Stoffwechselnachweis in lebenden Zellen mittels hyperpolarisierter ¹³C NMR

Wir haben eine nicht-invasive Methode entwickelt, um den Serumstoffwechsel in Echtzeit mit fortschrittlichen hyperpolarisierten NMR-Techniken zu messen. Unser Ziel ist es, zugängliche Werkzeuge für verschiedene biologische Forschungsanwendungen zu schaffen. Es wurde über mehrere hyperpolarisierte NMR-Systeme für den Serumstoffwechsel berichtet. Standardisierte und reproduzierbare Protokolle für eine breitere Forschungsumsetzung standen jedoch bisher nicht zur Verfügung.

Unser Protokoll verbessert die Zugänglichkeit durch die Verwendung kommerziell verfügbarer Komponenten. Wir bieten auch eine umfassende Validierung, einschließlich der Vorteile der Systemmischung und der Möglichkeit wiederholter Messungen für eine breitere Anpassung. Unsere Ergebnisse ermöglichen die Echtzeit-Verfolgung dynamischer Stoffwechselveränderungen in lebenden Zellen ohne Ablenkung. Dies eröffnet neue Möglichkeiten für langfristige Wirkstoffstudien in verschiedenen Anwendungen von Stoffwechselsonden.

Unser Ansatz hat Grenzen, einschließlich Problemoptionen und Automatisierungsanforderungen. Die Lösung der Herausforderungen wird zelluläre Stoffwechselmesstechniken etablieren und die DNP-Forschungsbemühungen unseres Labors in Zukunft bereichern.

[Erzähler] Geben Sie zunächst zwei Milliliter 0,25 % Volumen-zu-Volumen-Trypsin-EDTA-Lösung in eine 10-Zentimeter-Schale. Kippen Sie die Schüssel vorsichtig, um sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche bedeckt ist. Aspirieren Sie dann die überschüssige Trypsin-Ethylendiamin-tracetinsäure-Lösung. Stellen Sie das Gericht in einen auf 37 Grad Celsius eingestellten Inkubator und inkubieren Sie es zwei Minuten lang. Geben Sie dann 10 Milliliter Nährmedium in die Schale. Pipettieren Sie mit einer Pipette vorsichtig auf und ab, um die Zellen von der Oberfläche zu lösen, und sammeln Sie die gesamte Zellsuspension in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen. Nehmen Sie nun ca. 10 Mikroliter der Zellsuspension und laden Sie sie in einen Zellzähler, um die Anzahl der Zellen zu bestimmen. Stellen Sie sicher, dass die gemessene Anzahl eine Ausbeute von ca. 10 Millionen Zellen bestätigt, oder passen Sie sie nach Bedarf an. Die restliche Zellsuspension bei 120 x g fünf Minuten lang zentrifugieren. Nach der Zentrifugation den Überstand aspirieren und verwerfen. Resuspendieren Sie das resultierende Zellpellet in vier Millilitern 2 %iger Alginatlösung und pipettieren Sie es langsam, um die Blasenbildung zu minimieren. Geben Sie nun 10 Milliliter 50 Millimolare Calciumchloridlösung in ein 50 Milliliter Zentrifugenröhrchen. Befestigen Sie die Spritze an der Kappe des Zentrifugenröhrchens, das die Calciumchloridlösung enthält. Ziehen Sie 300 Mikroliter des Zellalginatgemisches in eine 0,5-Milliliter-Spritze, die mit einer 10-Millimeter-Nadel mit drei Gauges ausgestattet ist. Verschließen Sie dann das Zentrifugenröhrchen fest, während die Spritze an der Kappe befestigt ist, und setzen Sie die Baugruppe in die Zentrifuge ein, um sie fünf Minuten lang vorsichtig bei 200 x g zu drehen. Entfernen Sie den Überstand nach der Zentrifugation und resuspendieren Sie das resultierende Gel in Kulturmedium. Übertragen Sie anschließend mit einer Pasteur-Pipette das verkapselte Gel in ein NMR-Röhrchen und setzen Sie die Schwammhalterung ein, um eine dichte Versiegelung zu gewährleisten. Das Mediumreservoir mit 5 Vol.-% Deuteriumoxid in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad vorwärmen. Beginnen Sie die Zirkulation mit einer Geschwindigkeit von ca. 500 Mikrolitern pro Stunde, um die Bedingungen zu stabilisieren. Überprüfen Sie das Setup, um sicherzustellen, dass keine Lecks vorhanden sind, bevor Sie fortfahren. 18 Mikroliter Kohlenstoff-13-markierte Brenztraubensäure in einer Konzentration von 14,2 molaren und mit 25 Millimolar OX063 dotierten Brenztraubensäure in ein Probengefäß geben. Verbinden Sie das Fläschchen mit dem Flüssigkeitspfad des dynamischen Kernpolarisationspolarisationssystems. Setzen Sie anschließend das angeschlossene Fläschchen in die Bohrungseinheit des dynamischen Kernpolarisators ein. Wenden Sie Mikrowellenbestrahlung bei etwa 188 Gigahertz mit einer Leistung von 22 Milliwatt für eine Dauer von 60 bis 80 Minuten an. Verwenden Sie das in das dynamische Kernpolarisationssystem integrierte Festkörper-Kernspinresonanzspektrometer, um die Intensität des Kohlenstoff-13-Signals zu überwachen. Erfassen Sie die Signaldaten alle fünf Minuten mit der Steuerungssoftware der Anlage. Lösen Sie nun die polarisierte Probe schnell in 3,2 Millilitern Auflösungspuffer auf, der auf biologische Temperatur vorgewärmt ist. Laden Sie die vorbereitete Probe in ein NMR-Röhrchen und führen Sie das Röhrchen in das Spektrometer ein. Starten Sie auf der NMR-Konsole das automatisierte Verfahren, um das Sperren, Tuning, Anpassen und Shimming mit der Probe durchzuführen, um eine optimale spektrale Auflösung und Signalstabilität zu gewährleisten. Laden Sie eine Kohlenstoff-13-Impulserfassungssequenz mit aktivierter Protonenentkopplung mit einer Einstellung wie 13-CPD. Stellen Sie den Flip-Winkel auf 90 Grad mit einem Ein-Mikrosekunden-Impuls ein, der als P1 gekennzeichnet ist. Definieren Sie als Nächstes die Erfassungszeit als 1,376 Sekunden, die spektrale Breite als 23.663 Hertz und die Erfassungspunkte (TD) als 65.536. Stellen Sie die Entspannungsverzögerung D1 auf null Sekunden ein. Weisen Sie TD1 150 Zeitschritte zu, um 150 sequenzielle Spektren im pseudo-2-dimensionalen Modus zu erfassen, und stellen Sie die Empfängerverstärkung auf einen niedrigen Wert ein, z. B. ungefähr eins, um eine durch die hyperpolarisierten Abtastungen verursachte Signalsättigung zu vermeiden. Stoppen Sie nun die Peristaltikpumpe, um die Zirkulation des Mediums vorübergehend zu stoppen, bevor Sie die hyperpolarisierte Lösung durch den Einlassschlauch injizieren. Beginnen Sie mit der spektralen Erfassung etwa 10 Sekunden vor dem Auflösen des hyperpolarisierten Substrats, um die Signalerfassung bei der Ankunft am Nachweisort sicherzustellen. Wenn die Lösung den dynamischen Kernpolarisationspolarisator verlässt, ziehen Sie einen Milliliter davon in eine Spritze. Schalten Sie das Dreiwegeventil am Einlass des Bioreaktors auf Position B, um die hyperpolarisierte Lösung in das NMR-Rohr zu leiten. Schalten Sie das Ventil nach Abschluss der Injektion wieder auf Position A, um die Zirkulation des Mediums wieder aufzunehmen und einen Rückfluss zu verhindern. Bestätigen Sie abschließend, dass die Injektion erfolgreich war, nachdem Sie einen Anstieg des freien Induktionszerfallssignals in der Erfassungssoftware festgestellt haben. Stellen Sie sicher, dass die endgültige Lösung eine Temperatur zwischen 308 und 313 Kelvin und einen pH-Wert von etwa sieben erreicht, bevor Sie sie zur NMR-Messung übertragen. Hyperpolarisierte Kohlenstoff-13-NMR-Spektren derselben verkapselten Probe der SCCVII-Zelle wurden in Abständen von 1,5 Stunden aufgenommen, um die Durchführbarkeit wiederholter zerstörungsfreier Messungen zu bewerten. Die erste NMR-Messung zeigte ein deutlich erhöhtes Laktatsignal, was auf eine metabolische Umwandlung von aktivem Pyruvat in Laktat hinweist. Nachfolgende Messungen im Abstand von 1,5 Stunden zeigten eine fortschreitende Verringerung der Intensität des Laktatsignals, was auf eine verminderte Stoffwechselaktivität im Laufe der Zeit hindeutet. In HeLa-Zellen bestätigten erste Messungen eine erfolgreiche Umwandlung von Pyruvat in Laktat mit deutlich erkennbaren Signalspitzen. Obwohl das Signal aufgrund der T2-Relaxation allmählich abnahm, blieb das Signal-Rausch-Verhältnis während der gesamten 60-Sekunden-Erfassung angemessen, was darauf hindeutet, dass das aktuelle Protokoll breit anwendbar ist und als vielseitiges Werkzeug für die Echtzeit-Erstellung von metabolischen Profilen in verschiedenen Zelltypen dienen kann.