Name: Rastertransmissionselektronenmikroskopie-Tomographie in der Virologie: 3D-Bildgebung von unter hohem Druck eingefrorenen, gefriersubstituierten Proben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Erfahren Sie die Rastertransmissionselektronenmikroskopie-Tomographie für die 3D-Bildgebung virusinfizierter Zellen. Diese Methode mit Hochdruckgefrierung und Gefriersubstitution ermöglicht präzise Visualisierung ultrastruktureller Veränderungen.

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<li>Abdellatif, M. E. A., Sinzger, C., Walther, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+HCMV+entry+into+host+cells+by+STEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigating HCMV entry into host cells by STEM tomography.</a> J Struct Biol. 204 (3), 406-419 (2018).</li>
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<li>Walther, P., Bauer, A., Wenske, N., Catanese, A., Garrido, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STEM+tomography+of+high-pressure+frozen+and+freeze-substituted+cells%3A+a+comparison+of+image+stacks+obtained+at+200+kV+or+300+kV%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">STEM tomography of high-pressure frozen and freeze-substituted cells: a comparison of image stacks obtained at 200 kV or 300 kV.</a> Histochem Cell Biol. 150 (5), 545-556 (2018).</li>
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<li>Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closer+to+the+native+state.+Critical+evaluation+of+cryo-techniques+for+transmission+electron+microscopy%3A+preparation+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for transmission electron microscopy: preparation of biological samples.</a> Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).</li>
<li>Walther, P., Schmid, E., Höhn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+imaging+techniques%2C+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell imaging techniques, methods and protocols.</a> Methods Mol Biol. 931, 525-535 (2012).</li>
<li>Steyer, A. M., Ruhwedel, T., Möbius, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+sample+preparation+by+high-pressure+freezing%2C+microwave-assisted+contrast+enhancement%2C+and+minimal+resin+embedding+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Biological sample preparation by high-pressure freezing, microwave-assisted contrast enhancement, and minimal resin embedding for volume imaging.</a> J Vis Exp. (145), e59156(2019).</li>
<li>Read, C., Walther, P., von Einem, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytomegaloviruses%2C+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Human cytomegaloviruses, methods and protocols.</a> Methods Mol Biol. 2244, 265-289 (2021).</li>
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<li>Elbaum, M., Seifer, S., Houben, L., Wolf, S. G., Rez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+compositional+contrast+by+cryo-STEM%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Toward compositional contrast by cryo-STEM.</a> Acc Chem Res. 54 (19), 3621-3631 (2021).</li>
<li>Kirchweger, P., Mullick, D., Wolf, S. G., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+organelles+in+situ+by+cryo-STEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of organelles in situ by cryo-STEM tomography.</a> J Vis Exp. (196), (2023).</li>
<li>McDonald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+28+%26%2334%3Btips+and+tricks%26%2334%3B+for+high-pressure+freezing+of+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 28 &#34;tips and tricks&#34; for high-pressure freezing of model systems.</a> Methods Cell Biol. 96, 671-693 (2010).</li>
<li>Sosinsky, G. E., Crum, J., Jones, Y. Z., Lanman, J., Smarr, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combination+of+chemical+fixation+procedures+with+high-pressure+freezing+and+freeze+substitution+preserves+highly+labile+tissue+ultrastructure+for+electron+tomography+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The combination of chemical fixation procedures with high-pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications.</a> J Struct Biol. 161 (3), 359-371 (2008).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Rauch-Wirth, L., Schuetz, D., Groß, R., Rode, S., Glocker, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+enhancing+EF-C+peptide+nanofibrils+are+endocytosed+by+macropinocytosis+and+subsequently+degraded%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Transduction enhancing EF-C peptide nanofibrils are endocytosed by macropinocytosis and subsequently degraded.</a> Biomaterials. , 317(2025).</li>
<li>Tonnemacher, S., Folly-Klan, M., Gazi, A. D., Schaefer, S., Pénard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+H7-protein+is+required+for+the+organization+of+the+viral+scaffold+protein+into+hexamers%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus H7-protein is required for the organization of the viral scaffold protein into hexamers.</a> Sci Rep. 12 (1), 13007(2022).</li>
<li>Villinger, C., Gregorius, H., Kranz, C., Hoehn, K., Münzberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIB%2FSEM+tomography+with+TEM-like+resolution+for+3D+imaging+of+high-pressure+frozen+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">FIB/SEM tomography with TEM-like resolution for 3D imaging of high-pressure frozen cells.</a> Histochem Cell Biol. 138 (4), 549-556 (2012).</li>
<li>Hackstadt, T., Chiramel, A. I., Hoyt, F. H., Williamson, B. N., Dooley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+Golgi+apparatus+and+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum+to+the+SARS-CoV-2+replication+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Disruption of the Golgi apparatus and contribution of the endoplasmic reticulum to the SARS-CoV-2 replication complex.</a> Viruses. 13 (9), 1798(2021).</li>
<li>Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+section+scanning+electron+microscopy+%28S3EM%29+on+silicon+wafers+for+ultra-structural+volume+imaging+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues.</a> PLoS ONE. 7 (4), e35172(2012).</li>
<li>Lewczuk, B., Szyryńska, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-emission+scanning+electron+microscope+as+a+tool+for+large-area+and+large-volume+ultrastructural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies.</a> Animals. 11 (12), 3390(2021).</li>
<li>Höög, J. L., Schwartz, C., Noon, A. T., O'Toole, E. T., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+interphase+microtubules+in+fission+yeast+analyzed+by+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography.</a> Dev Cell. 12 (3), 349-361 (2007).</li>
<li>Jiang, Y., Lin, H., Fu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+mitochondrial+ultrastructure+of+Drosophila+indirect+flight+muscle+revealed+by+serial-section+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">3D mitochondrial ultrastructure of Drosophila indirect flight muscle revealed by serial-section electron tomography.</a> J Vis Exp. (130), e56567(2017).</li>
<li>Snijder, E. J., Limpens, R. W. A. L., de Wilde, A. H., de Jong, A. W. M., Zevenhoven-Dobbe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unifying+structural+and+functional+model+of+the+coronavirus+replication+organelle%3A+tracking+down+RNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+Biol%22%5BJournal%5D)">A unifying structural and functional model of the coronavirus replication organelle: tracking down RNA synthesis.</a> PloS Biol. 18 (6), e3000715(2020).</li>
<li>Welsch, S., Miller, S., Romero-Brey, I., Merz, A., Bleck, C. K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+three-dimensional+architecture+of+the+dengue+virus+replication+and+assembly+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Composition and three-dimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites.</a> Cell Host Microbe. 5 (4), 365-375 (2009).</li>
<li>Cortese, M., Goellner, S., Acosta, E. G., Neufeldt, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+characterization+of+Zika+virus+replication+factories%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural characterization of Zika virus replication factories.</a> Cell Rep. 18 (9), 2113-2123 (2017).</li>
<li>Milrot, E., Lazar, S., Schuster, O., Makdasi, E., Schmaya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+the+infection+cycle+of+VSV-%CE%94G-spike+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Insights from the infection cycle of VSV-ΔG-spike virus.</a> Viruses. 14 (12), 2828(2022).</li>
<li>Schauflinger, M., Bergner, T., Neusser, G., Kranz, C., Read, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+permanganate+is+an+excellent+alternative+to+osmium+tetroxide+in+freeze-substitution%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Potassium permanganate is an excellent alternative to osmium tetroxide in freeze-substitution.</a> Histochem Cell Biol. 157 (4), 481-489 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1-Hexadecän</td><td>Merck KGaA</td><td>8220640500</td><td></td></tr><tr><td>200-Kupfer-Gitter mit Parallelstäben</td><td>Plano GmbH</td><td>G2014C</td><td></td></tr><tr><td>37 & Grad; C-Trocknungskammer</td><td>Binder GmbH</td><td>9010-0323</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>VWR international GmbH</td><td>20066330</td><td></td></tr><tr><td>DDSA</td><td>Elektronenmikroskopiewissenschaften</td><td>13710</td><td></td></tr><tr><td>Diamantmesser</td><td>Diatome Ltd</td><td>https://www.diatomeknives.com/ultra-35</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>Elektronenmikroskopiewissenschaften</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td>Embed-812-Harz</td><td>Elektronenmikroskopiewissenschaften</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>EM-Werkzeuge</td><td>TVIPS GmbH</td><td>TVIPS-Software: EM-Tools; https://www.tvips.com/imaging-software/em-tools/</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol zu 100 %</td><td>Merck KGaA</td><td>1.00983.2511</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>VWR international GmbH</td><td>516-0812</td><td></td></tr><tr><td>Flaschen mit Schnappdeckelglas 11 mL</td><td>VWR international GmbH</td><td>548-0625</td><td></td></tr><tr><td>Formvar</td><td>Elektronenmikroskopiewissenschaften</td><td>15830-25</td><td></td></tr><tr><td>Freeze-Substitutionseinheit Leica EM AFS2</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/sample-preparation-for-electron-microscopy/p/leica-em-afs2/</td><td></td></tr><tr><td>Glod Sol 25 nm</td><td>AURION Immuno Gold Reagenzien & Zubehör</td><td>425.011</td><td></td></tr><tr><td>Goldes Kiefernloch & Oslash; 2000 & mu; m</td><td>Science Services GmbH</td><td>GA2000-Au</td><td></td></tr><tr><td>Graiticules Buchstaben-Netzchen Kupfer</td><td>Plano GmbH</td><td>NH6C</td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>MEDAX GmbH & Kompanie KG</td><td>12501</td><td></td></tr><tr><td>Hochvakuumverdampfungssystem BAF 300</td><td>BAL-TEC AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hochdruckgefrierschrank Wohlwend HPF Compact 01</td><td>Ingenieurbüro M. Wohlwend GmbH</td><td>https://www.wohlwend-hpf.ch/index.html</td><td></td></tr><tr><td>Flüssigstickstofftank</td><td>H.Erben GmbH</td><td>94500</td><td></td></tr><tr><td>Stickstoff (Flüssigkeit)</td><td>VWR international GmbH</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>NMA</td><td>Elektronenmikroskopiewissenschaften</td><td>19000</td><td></td></tr><tr><td>Osmiumtetroxid</td><td>ChemPur Feinchemikalien und Forschungsbedarf GmbH</td><td>006051</td><td></td></tr><tr><td>Ofen 120 °C; C</td><td>Binder GmbH</td><td>9010-0194</td><td></td></tr><tr><td>PELCO easi-Glow</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>91000</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin 0,1 % w/v aq. Lösung</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>18026</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock-Röhren 0,5 mL</td><td>Eppendorf SE</td><td>0030 121.023</td><td></td></tr><tr><td>Probenbehälter (Beem-Kapseln)</td><td>Plano GmbH</td><td>G360-1</td><td></td></tr><tr><td>Saphirscheibendurchmesser 3 x 0,16 mm</td><td>Ingenieurbüro M. Wohlwend GmbH</td><td>500</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome Leica EM UC7</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td>https://www.leica-microsystems.com/de/produkte/em-probenvorbereitung/p/leica-em-uc7/</td><td></td></tr><tr><td>Uranylacetat</td><td>Riedel de Ha&euml; n AG</td><td>31697</td><td></td></tr><tr><td>UV-Lichtkammer</td><td>Dinies</td><td>ELG100S</td><td></td></tr></tbody></table>

rastertransmissionselektronenmikroskopie-tomographie in der virologie: 3d-bildgebung von unter hohem druck eingefrorenen, gefriersubstituierten proben

Scanning Transmission Electron Microscopy Tomography in Virology: 3D Imaging of High-pressure Frozen, Freeze-substituted Samples

Rastertransmissionselektronenmikroskopie-Tomographie in der Virologie: 3D-Bildgebung von unter hohem Druck eingefrorenen, gefriersubstituierten Proben

Electron microscopy (EM) and especially three-dimensional (3D) EM techniques have become established methods in structural virology. Investigation of ...

scanning-transmission-electron-microscopy-tomography-virology-3d

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Das Protokoll beschreibt eine High-Throughput-Ansatz zur Bestimmung Strukturen von Membranproteinen mittels Kryo-Elektronen-Tomographie und 3D-Bildverarbeitung. Es deckt die Einzelheiten der Probenvorbereitung, Datenerfassung, Datenverarbeitung und-interpretation, und schließt mit der Produktion von einer repräsentativen Ziel für den Ansatz, die HIV-1 Envelope Glykoproteins. Diese Berechnungsverfahren sind in einer Weise, Forscher und Studenten ermöglicht, remote arbeiten und einen Beitrag zur...

Bestimmung von Molekülstrukturen von HIV Hüllglycoproteine ​​mit Cryo-Elektronen-Tomographie und automatisierte Sub-Tomogramm Averaging

Wir beschreiben eine korrelative Mikroskopie-Methode, die High-Speed-3D-Live-cell Fluoreszenzlichtmikroskopie und hochauflösenden Kryo-Elektronen-Tomographie vereint. Wir demonstrieren die Fähigkeit des korrelativen Verfahren durch Abbilden dynamisch kleine HIV-1-Partikeln Interaktion mit dem Host-HeLa-Zellen.

Korrelative Mikroskopie für 3D-Strukturanalyse von dynamischen Wechselwirkungen

Wir präsentieren ein Protokoll, wie die Erfassung und Verarbeitung Kryo-Elektronenschichtaufnahmen von ganzen Mitochondrien. Die Technik liefert detaillierte Einblicke in die Struktur, Funktion und Organisation der großen Membranproteinkomplexen in nativen biologischen Membranen.

Visualisierung der ATP-Synthase-Dimere in den Mitochondrien durch Elektronen Cryo-Tomographie

Die Befestigung von Virionen an einer Oberfläche ist eine Voraussetzung für eine einzelne Virionen-Bildgebung durch Super-Resolution Fluoreszenz-Bildgebung oder Atomkraftmikroskopie (AFM). Hier zeigen wir ein Probenvorbereitungsverfahren zur kontrollierten Haftung von Virionen auf Glasoberflächen, die für den Einsatz in AFM und Super-Auflösungfluoreszenz-Bildgebung geeignet sind.

Probenvorbereitung für Single Virion Atomic Force Microscopy und Super-Resolution Fluorescence Imaging

Dieser Bericht beschreibt ein Probenvorbereitungsprotokoll und spezifische Bildgebungsbedingungen für die Durchführung der Rastertransmissionselektronentomographie von dicken biologischen Proben.

Vorbereitung und Beobachtung von Dick biologischen Proben durch Scanning Transmission Electron Tomography

Dieses Protokoll beschreibt, wie die vorübergehende DNA-Verdichtung in Cyanobakterien zu visualisieren. Synchrone Anbau, Überwachung durch die Fluoreszenz-Mikroskopie, schnelles Gefrieren und hoher Spannung Cryo-Elektron Tomographie verwendet. Ein Protokoll für diese Methoden vorgestellt, und zukünftige Anwendungen und Entwicklungen diskutiert.

Visualisierung der DNA Verdichtung in Cyanobakterien durch Hochspannungs-Cryo-Elektron Tomographie

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, das die Probenvorbereitungs- und Datenerfassungsschritte beschreibt, die in der Kryo-Soft-Röntgentomographie (SXT) erforderlich sind, um die Ultrastruktur ganzer kryokonservierter Zellen mit einer Auflösung von 25 nm Halbtonhöhe abzubilden.

Eine kartographische 3D-Beschreibung der Zelle durch Kryo-Soft-Röntgentomographie

Wir präsentieren ein Protokoll zur Lamellenpräparation von gefrorenen biologischen Proben mittels kryofokussiertem Ionenstrahl-Mikrobearbeitung für hochauflösende Strukturstudien von Makromolekülen in situ mit Kryo-Elektronentomographie. Das vorgestellte Protokoll enthält Richtlinien für die Herstellung von hochwertigen Lamellen mit hoher Reproduzierbarkeit zur strukturellen Charakterisierung von Makromolekülen innerhalb der Saccharomyces cerevisiae.

Herstellung und Kryo-FIB-Mikrobearbeitung von Saccharomyces cerevisiae für die Kryo-Elektronentomographie

Hier werden Protokolle beschrieben, um Virusanordnungen herzustellen, die für die Flüssig-EM- und Kryo-EM-Analyse auf der Nanoskala mittels Transmissionselektronenmikroskopie geeignet sind.

Weiterentwicklung der hochauflösenden Bildgebung von Virusanordnungen in Flüssigkeit und Eis

Die Kryo-STEM-Tomographie bietet eine Möglichkeit, Organellen intakter Zellen ohne Einbettung, Schnitt oder andere invasive Präparate sichtbar zu machen. Die erzielte 3D-Auflösung liegt derzeit im Bereich von wenigen Nanometern, mit einem Sichtfeld von mehreren Mikrometern und einer zugänglichen Dicke in der Größenordnung von 1 μm.

Visualisierung von Organellen in situ mittels Kryo-STEM-Tomographie

Erfahren Sie die Rastertransmissionselektronenmikroskopie-Tomographie für die 3D-Bildgebung virusinfizierter Zellen. Diese Methode mit Hochdruckgefrierung und Gefriersubstitution ermöglicht präzise Visualisierung ultrastruktureller Veränderungen.

Rastertransmissionselektronenmikroskopie-Tomographie in der Virologie: 3D-Bildgebung von unter hohem Druck eingefrorenen, gefriersubstituierten Proben (Video) | JoVE Journal

Rastertransmissionselektronenmikroskopie-Tomographie in der Virologie: 3D-Bildgebung von unter hohem Druck eingefrorenen, gefriersubstituierten Proben

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