Rastertransmissionselektronenmikroskopie-Tomographie in der Virologie: 3D-Bildgebung von unter hohem Druck eingefrorenen, gefriersubstituierten Proben

Eine Virusinfektion könnte erhebliche Veränderungen in der zellulären Infrastruktur verursachen. Um diese Veränderungen in drei Dimensionen zu visualisieren, verwenden wir STEM-Tomographie zur Bildgebung von virusinfizierten Zellen. MINT-Tomographie ist zeitaufwendig und arbeitsintensiv.

Dies macht eine optimale Probenvorbereitung für biologische Proben, wie virusinfizierte Sets, unerlässlich. Die konventionelle STEM-Tomographie ist auf Stichproben von Krankheiten von etwa 200 Nanometern beschränkt. Unser Protokoll ermöglicht 3D-Bildgebung dickerer Abschnitte.

Dies ermöglicht eine umfassendere Visualisierung der virusinfizierten Zellen und der ultrastrukturellen Veränderungen. Viele onkolytische Viren sind ursprünglich bereits klinische Studien, daher arbeiten Forscher und Entwickler weltweit zusammen, und die Wissenschaft erweitert die Grenzen der Krebsbehandlung, und modernste Methoden wie Elektronenmikroskopie und MINT-Tomographie tragen neue Erkenntnisse bei. Wir werden weiterhin virologische Fragen beantworten, indem wir STEM-Tomographie verwenden und sie mit neuen Präparationsprotokollen und anderen Mikroskopietechniken kombinieren.

Zu Beginn füllen Sie die LN-Box mit flüssigem Stickstoff zur Vorbereitung auf die Handhabung und den Transfer der gefrorenen Saphirscheiben vom Hochdruckgefrier- oder HPF-Halter in die Speicherkapseln. Halten Sie einen Dewar mit flüssigem Stickstoff in der Nähe, um die LN-Box während des Einfriervorgangs bei Bedarf aufzufüllen. Halten Sie eine isolierte Pinzette bereit.

Bereite die Probenbehälter vor, die die Saphirscheiben nach der HPF aufnehmen werden. Achten Sie darauf, dass sie einen Deckel und mehrere Löcher für flüssigen Stickstoff haben, in die er einfließen kann, sowie kleine Gewichte, damit sie nicht schwimmen. Setzen Sie den Etikettbehälter in die LN-Box zum Vorkühlen vor der Benutzung.

Dann werden die Proben in den Inkubator gelegt. Untersuchen Sie die Saphirscheiben unter einem Invertiertlichtmikroskop, um sicherzustellen, dass genügend Zellen und eine gute Zellqualität sind, bevor Sie mit Hochdruckgefrieren beginnen. Um HPF durchzuführen, nehmen Sie eine Saphirscheibe aus der Kulturschale und tupfen sie schnell auf Filterpapier, um überschüssiges Material zu entfernen.

Lege die Scheibe in den HPF-Halter, wobei die mit Kohle beschichtete Seite nach oben zeigt, damit die Zahl zwei lesbar ist. Tauchen Sie einen goldenen Abstandshalter in Hexadecan und legen Sie ihn vorsichtig auf die Saphirscheibe. Positioniere eine zweite Saphirscheibe auf dem Abstandshalter, wobei die kohlenstoffbeschichtete Seite nach unten zeigt, um eine Sandwich-Konfiguration zu bilden, bei der die Zellen aufeinander zeigen, und stelle sicher, dass keine Luft eingeschlossen ist.

Schließen Sie den HPF-Halter vorsichtig und schnell, um die Belastung der Probe zu verringern. Stecken Sie den HPF-Halter in den Hochdruckgefrier. Verriegeln Sie es gemäß den Anweisungen des Herstellers und starten Sie den Einfriervorgang.

Als Nächstes übertrage ich den HPF-Halter in die LN-Box. Dann übertrage die Spitze mit den Saphirscheiben in die Vorkühl-LN-Box. Ziehen Sie die Scheiben vorsichtig aus dem Halter.

Bringen Sie die geschlossenen Kryophiolen mit freier Substitutionslösung in ein freies Substitutionsgerät, das auf minus 90 Grad Celsius vorgekühlt ist. Warte, bis die Lösung die gleiche Temperatur erreicht hat. Vorkühlen von Pinzetten, einem Skalpell und einer Zange oder großer Pinzette, indem man sie in flüssigen Stickstoff eintaucht, um die Saphirscheiben zu übertragen.

Übertragen die Hochdruck-Gefrorenproben in das freie Substitutionsgerät. Trennen Sie die Saphirscheiben einzeln, während Sie sie in flüssigem Stickstoff aufbewahren. Und übertrage jede Disc schnell einzeln in ein Kryo-Fläschchen mit kostenloser Substitutionslösung, um sicherzustellen, dass die Disc vollständig eingetaucht ist.

Nachdem Sie das Kryo-Fläschchen geschlossen haben, setzen Sie es sofort zurück in das freie Substitutionsgerät. Sobald alle Proben platziert sind, beginnen Sie mit dem Substitutionsprozess. Sobald die Proben 20 Grad Celsius erreichen.

Waschen Sie die Proben jeweils dreimal für 30 Minuten mit 100 % Aceton. Um die Proben vorab einzubetten, inkubieren Sie die Proben in einem Drittel Epoxidharz und zwei Dritteln Aceton für eine Stunde. Nachdem die Proben eine Stunde lang mit zwei Dritteln Epoxidharz und einem Drittel Aceton inkubiert wurden, tauschen Sie die Lösung durch 100 % Epoxidharz aus und inkubieren Sie über Nacht mit offenem Fläschchendeckel, damit am folgenden Tag das verbleibende Aceton verdampfen kann; die Saphirscheiben werden in neue, beschriftete Reaktionsröhren mit frisch vorbereitetem Epoxidharz gefüllt.

Positionieren Sie die Scheiben horizontal, gestützt von der Wand des Röhrchens, wobei die Seite mit den Zellen nach oben zeigt. Dann werden die Reaktionsröhren mit offenen Deckeln in einen auf 60 Grad Celsius eingestellten Ofen gesetzt und das Harz mindestens 48 Stunden polymerisieren lassen. Nachdem das Epoxidharz polymerisiert ist, tauchen Sie die Spitze eines geschlossenen Reaktionsrohrs für etwa 10 Sekunden in flüssigen Stickstoff ein.

Schlage das Reaktionsrohr auf einen Tisch, um den Harzblock freizugeben. Die Saphirscheibe trennt sich leicht von der Kohlenstoffschicht, die an den eingebetteten Zellen befestigt bleibt. Wählen Sie den Interessensbereich in der eingebetteten Stichprobe aus und reduzieren Sie die Stichprobengröße auf den Interessensbereich.

Mit einem Ultramikroton und einem Diamantmesser werden Schnitte von etwa einem Mikrometer Dicke auf einem poly-L-lysinbehandelten, glotusgeladenen parallelen Balkengitter für STEM-Bildgebung und STEM-Tomographie gesammelt. Behandeln Sie Schnitte mit kolloidalem Gold als treuhänderische Marker und tragen Sie eine Kohlenstoffbeschichtung auf. Nach dem Schneiden und Inspizieren ultradünner Schnitte sind die Proben für die Bildgebung bereit.

Basierend auf der Forschungsfrage solltest du entweder den Hellfelddetektor, den Dunkelfelddetektor oder beide einfügen. Aktivieren Sie den Scan-Modus und nehmen Sie ein Testbild der Probe auf. Wählen Sie eine Vergrößerung höher als 800.000-fach, die größer ist als die endgültig gewünschte Vergrößerung.

In der Nähe des Interessebereichs den Fokus anpassen und Astigmatismus korrigieren, wobei Sie eine direkte Strahlbelastung auf den kritischen Probenbereichen vermeiden. Stellen Sie die Exzentriehöhe so ein, dass der Interessenbereich bzw. der ROI über den gesamten Neigungsbereich verteilt bleibt. Wähle eine Funktion in der Nähe des ROI, bringe sie in die Mitte, fokussiere, korrigiere Astigmatismus und neige die Bühne schrittweise auf minus 72 Grad.

Um das Sichtfeld auszuwählen, navigiere zurück zum ROI, bring es in den Fokus und erzeuge ein Übersichtsbild. Stellen Sie die gewünschte Endvergrößerung für die Neigungsreihenaufnahme ein. Richten Sie eine automatische Neigungsserienaufnahme von Bildern ein, die von minus 72 Grad bis plus 72 Grad reichen, und bilden alle 1,5 Grad.

Starten Sie die automatisierte Neigungsserie-Erfassung. Repräsentative virtuelle Schnitte aus dem STEM-Thermogramm zeigten, wie die Orientierung von Virionen die Sichtbarkeit der charakteristischen Kugelform in zweidimensionalen Ansichten beeinflusst. Nur Virionen, die parallel zur Betrachtungsebene ausgerichtet waren, erschienen mit der vollständigen, wohldefinierten Kugelmorphologie, während andere je nach Neigungswinkel kreisförmig oder verlängert wirkten.

Um die Orientierungsbeschränkungen der 2D-Bildgebung zu überwinden, wurde die STEM-Tomographie eingesetzt, um große Cluster von knospendender rekombinanter vesikulärer Stomatitisvirus-Virion zu erfassen und so die Virionform in drei Dimensionen ohne Richtungsverzerrung zu beurteilen. Die Seitenansicht des Thermogramms bestätigte den volumetrischen Vorteil der STEM-Tomographie, die viele vollständige Virionen in einem einzigen 600-Nanometer-dicken Schnitt erfasst, im Gegensatz zur begrenzten Probenahme, die mit einem 200-Nanometer-TEM-Abschnitt möglich ist.