MicroRNA-Amplifikation und -Erkennung durch In-situ-Hybridisierung mit gesperrten Nukleinsäuren als neuartige Detektions- und Quantifizierungsmethode

Ziel unserer Forschung war es, einen Test zu entwickeln und zu validieren, der gleichzeitig MikroRNAs und mehrere Proteine im FFPE-Gewebe nachweist und quantifiziert, um die Beziehung zwischen beiden innerhalb des TME räumlich zu beobachten. Es überwindet tatsächlich gängige Einschränkungen bestehender molekularer Sequenzierung und einigermaßen traditioneller Sequenzierung, indem es eine direkte Quantifizierung, Kolokalisierung und gleichzeitige räumliche Detektion von MikroRNAs und Proteinen bietet – alles ohne das Gewebe zu zerstören und die Zell- und subzelluläre Lokalisierung zu erhalten. Diese Technologie ebnet potenziell den Weg sowohl für Grundlagenforschung zu regulatorischen Netzwerken, Krankheitsmechanismen als auch für translationale oder klinische Studien zur Suche nach besseren Biomarkern und therapeutischen Zielen.

Beginnen Sie damit, formalinfixierte, paraffineingebettete Proben des menschlichen Ovarialtumors zu entnehmen, die über Nacht bei 60 Grad Celsius aufbewahrt werden. Reinigen Sie mit RNAse-freiem Wasser alle Geräte und Werkzeuge gründlich. Als Nächstes wird die Deparaffinisierung durchgeführt, die Proben jeweils dreimal für fünf Minuten in Xylol eingetaucht.

Rehydrieren Sie das Gewebe mit 10 Runden sequentieller verdünnter Ethanolserie, jeweils für drei Minuten. Und dann die Proben einmal in TBS für zwei Minuten abwaschen. Tragen Sie 10 Minuten lang eine 3%-Wasserstoffperoxidlösung auf die Proben auf.

Waschen Sie die Proben jeweils zweimal für zwei Minuten mit TB. Anschließend trage ich eine 3,7%ige Paraformaldehydlösung für 10 Minuten auf. Danach beginnt die erste Antigenentnahme mit dem Easy Retriever Infrarotsystem.

Die Objektträger in frischen EZ-AR-1-Puffer tauchen und 15 Minuten lang bei 95 Grad Celsius in der Mikrowelle aufwärmen. Dann spülen Sie die Proben für zwei Minuten in TBST, gefolgt von zwei zweiminütigen Waschen in TBST. Zu Beginn zeichnen Sie mit einem hydrophoben Barrierenstift um jeden Gewebeschnitt eine Barriere.

Fügen Sie eine Antikörperblockierungslösung hinzu und inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer. Nun tragen Sie den primären Antikörper auf, der in derselben Blocklösung verdünnt ist, um den Gewebeabschnitt vollständig zu bedecken, und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer. Nach dreimalem Waschen der Objektträger in TBST geben Sie die Anti-Maus- und Kaninchen-Meerrettichperoxidase-Lösung hinzu, um das Gewebe zu bedecken, und inkubieren Sie 10 Minuten lang in der Feuchtigkeitskammer bei Zimmertemperatur.

Verdünnen Sie nun das erste Fluoro-4 im Verhältnis 1:100 mit einem Verstärkungsverdünner. Tragen Sie diese Mischung auf das Gewebe auf und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer, wobei Sie direktem Licht entgehen. Nach der zweiten Runde der Antigenentnahme und Blockierung wie zuvor gezeigt wird der zweite primäre Antikörper mit derselben Blocklösung verdünnt.

Tragen Sie den verdünnten Antikörper auf, um den gesamten Gewebeschnitt zu bedecken, und inkubieren Sie ihn über Nacht mindestens 16 Stunden bei vier Grad Celsius in einer Luftfeuchtigkeitskammer. Am nächsten Tag werden die Objektträger dreimal für jeweils zwei Minuten in TBST gewaschen und mit einer Anti-Maus- und Kaninchen-Meerrettichperoxidase-Lösung inkubiert, wie zuvor gezeigt. Anschließend wird das verdünnte zweite Fluoro-4 auf die Objektträger aufgetragen und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in der Feuchtigkeitskammer inkubiert.

Zur Anwendung der Sonde waschen Sie die Objektträger dreimal für jeweils zwei Minuten in TBST. Um mit der dritten und letzten Antigenentnahme zu beginnen, tauchen Sie die Objektträger in den EZ-AR 1 Elegance-Puffer ein und lassen Sie sie 15 Minuten lang bei 107 Grad Celsius in der Mikrowelle eintauchen. Kühlen Sie die Objektträger 20 Minuten bei Zimmertemperatur, bevor Sie sie einmal drei Minuten lang in einem Tebel waschen.

Trage genug RNAscope Protease Plus auf, um die Gewebefläche zu bedecken, und inkubiere bei 40 Grad Celsius 30 Minuten lang im Ofen. Dann wird die mikroRNA-gesperrte Nukleinsäuresonde für vier Minuten auf 90 Grad Celsius erhitzt, um sie zu denaturieren. Verdünnen Sie die denaturierte Sonde sofort mit einem In-situ-Hybridisierungspuffer für microRNA.

Nach dem Vortexen und Drehen der vorbereiteten Sonde geben Sie sie dazu, um die gesamte Gewebefläche abzudecken, und eine Stunde lang bei 60 Grad Celsius im Ofen inkubieren zu lassen. Waschen Sie die Objektträger einmal für fünf Minuten in 5x SSC-Puffer. Führen Sie fünf strenge Waschen bei 60 Grad Celsius mit dem SSC-Puffer jeweils fünf Minuten lang durch.

Wasche dann die Objektträger einmal für fünf Minuten in 0,2 mal SSC bei Raumtemperatur. Um den Blockpuffer vorzubereiten, mischen Sie TBS und 0,5%-Blockierungsreagenzpulver. Tragen Sie den Blockpuffer auf und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer.

Als Nächstes werden Antidigoxin und Meerrettichperoxidase-Konjugat von Mäusen aufgetragen und 30 Minuten bei Zimmertemperatur in einer befeuchteten Kammer inkubiert. Nach drei TBST-Waschen wird eine 1:50-Verdünnung der Tyramidsignalverstärkung plus Cyanin 3 für 10 Minuten bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer auf die Objektträger angewendet. Wasche die Objektträger noch dreimal für jeweils fünf Minuten in TBST.

Trage genug DAPI-Arbeitslösung auf, die 1:1000 in TBS verdünnt ist, um den Gewebeschnitt vollständig zu bedecken. Inkubieren Sie die Objektträger fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer mit Umgebungsfeuchtigkeit. Waschen Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten in TBST.

Tragen Sie Deckschichten mit Montagemedium auf und lassen Sie die Objektträger 10 Minuten bei Zimmertemperatur trocknen. Lagern die getrockneten Objektträger bei vier Grad Celsius im Dunkeln 24 bis 72 Stunden vor der Bildaufnahme oder bis zu drei Monate zur längeren Lagerung. Die miRNA-Expression von miR-181c-3p wurde sowohl in Kontroll- als auch in antikörpergefärbten Objektträgern konsistent nachgewiesen, wobei sichtbar stärkere Signale in den Tumorzellregionen konzentriert waren.

Die Anwendung des Anti-EpCAM-Antikörpers mit einem 620-Nanometer-Emissionsfluorophor färbte die Tumorzellen in der HGSC-Probe. Anwendung des Anti-CD8-Antikörpers mit einer 620-Nanometer-Emission von Fluorophoren, die deutlich als CD8-positive T-Zelle markiert sind. Die kombinierte Protein- und miRNA-Detektion ermöglichte die räumliche Lokalisierung von miR-181c-3p im Vergleich zu EpCAM-positiven Tumorzellen und CD8-positiven Immunzellen.

Die positive Kontrollsonde, die auf U6-kleine Kern-RNA abzielte, erzeugte starke fluoreszierende Signale über alle Gewebetypen hinweg und bestätigte so die Wirksamkeit der Sonde und die Gewebeintegrität. Die Negativkontrollsonde, die eine verschlüsselte miRNA-Sequenz verwendete, zeigte kein nachweisbares Signal in keinem Gewebetyp, was auf keine unspezifische Bindung hindeutet. Die Zielprobe für miR-181c-3p zeigte eine starke Expression im hochgradigen serösen Karzinomgewebe ohne Signal im normalen Ovarialgewebe oder im normalen Eileitergewebe, was die Spezifität und Genauigkeit der Sonde und des Tests demonstriert.