Transientes optisches Clearing mit absorbierenden Molekülen für die ex vivo und in vivo Bildgebung

Diese Forschung zielt darauf ab, die Gewebereinigung unter Verwendung absorbierender Moleküle als nicht-invasive Strategie zu evaluieren und umzusetzen, um die biomedizinische Bildgebung sowohl in ex vivo-Geweben als auch in lebenden Tieren zu verbessern. Wir haben gezeigt, dass der Lebensmittelfarbstoff Tartrazin verwendet werden kann, um eine schnelle und reversible optische Reinigung sowohl in Geweben als auch in lebenden Tieren zu erzielen, wodurch die Bildgebungstiefe und -klarheit erheblich verbessert wird. Unser Protokoll schließt eine kritische Lücke in der Reproduzierbarkeit des transienten optischen Clearings durch die Beobachtung von Molekülen und integriert fortschrittliche computergestützte Visualisierungstechniken, um die Sichtbarkeit von Merkmalen zu verbessern.

Durch die Bereitstellung eines detaillierten Protokolls für die Gewebereinigung mit absorbierenden Molekülen hilft unsere Arbeit der breiteren Forschungsgemeinschaft in der Biologie und biomedizinischen Bildgebung, diese Methoden in ihren eigenen Studien anzuwenden. Unser Labor hat diese Technologie weiterentwickelt, indem es die physikalische Wechselwirkung zwischen Licht und Gewebe erforscht, die Palette der verfügbaren Materialien erweitert und optimierte optische Bildgebungsplattformen entwickelt hat. Berechnen Sie zunächst die erforderliche Masse des Tartrazin-Farbstoffpulvers, um das gewünschte Lösungsvolumen vorzubereiten.

Übertragen Sie die berechnete Menge des Farbstoffpulvers in ein sauberes Glasfläschchen. Geben Sie mit einer volumetrischen Pipette das erforderliche Volumen an deionisiertem Wasser in das Fläschchen, um die Präzision zu gewährleisten. Wenn sich der Farbstoff bei Raumtemperatur nicht vollständig auflöst, stellen Sie das Glasfläschchen für 10 Minuten in einen auf 40 Grad Celsius vorgeheizten Laborofen oder bis es sich vollständig aufgelöst hat.

Dann die Farbstofflösung 30 Sekunden bis eine Minute lang vortexen, um eine vollständige Auflösung zu gewährleisten. Für das Ex-vivo-Gewebe schneiden Sie ein Hähnchenbrustgewebe in einer Richtung parallel zu den Kollagenfasern auf die gewünschte Dicke und reinigen Sie das geschnittene Gewebe vorsichtig mit Wasser. Legen Sie das Gewebe zwischen zwei saubere Objektträger, um die Dicke zu messen.

Drücken Sie die Objektträger vorsichtig zusammen und messen Sie mit einem Noniuskaliber den Abstand in der Mitte des Gewebes. Als nächstes tränken Sie das Tuch in der vorbereiteten Färbelösung. Und stellen Sie den Behälter auf einen Orbitalschüttler und schütteln Sie ihn 10 Minuten lang mit 100 Umdrehungen pro Minute.

Entferne das Gewebe mit einer sauberen Pinzette aus der Färbelösung. Platzieren Sie die Probe zwischen zwei transparenten Objektträgern und nehmen Sie Bilder mit einer digitalen oder wissenschaftlichen Kamera auf, die auf die entsprechende Auflösung und Vergrößerung eingestellt ist. Führen Sie den Bildgebungsprozess in einer Umgebung mit kontrolliertem Licht durch, um Störungen durch externes Licht zu minimieren.

Um die optische Transmission zu messen, legen Sie die vorbereitete Probe in ein UV-sichtbares Nahinfrarot-Spektrometer. Stellen Sie sicher, dass das System richtig ausgerichtet ist und dass der Lichtstrahl vor und nach der Behandlung mit der Farbstofflösung dieselbe Geweberegion durchdringt, um die Konsistenz der Messung zu gewährleisten. Positionieren Sie das betäubte Tier für den Eingriff auf einem Heizkissen, das bei 37 Grad Celsius temperiert ist.

Schneiden Sie mit einer Kleintierschermaschine das Fell aus dem gewünschten Bildgebungsbereich ab. Tragen Sie die Enthaarungscreme weniger als 60 Sekunden lang auf die getrimmte Stelle auf, um alle Resthaare zu entfernen, und entfernen Sie die Creme sofort. Reinigen Sie die Haut mit Alkoholtüchern, um Reizungen zu vermeiden.

Um die Bildgebung vorzubereiten, legen Sie ein auf 37 Grad Celsius eingestelltes Heizkissen unter das Tier, um eine Unterkühlung zu vermeiden. Richten Sie die Lichtquelle und die Kamera aus, um Bilder in hoher Qualität aufzunehmen. Verwenden Sie zur Anwendung eine 0,65 molare Tartrazinlösung, gemischt mit 0,3% bis 0,4% Agarosegel.

Tragen Sie die vorbereitete Lösung mit einer Pipette auf die Haut auf, je nach Versuch entweder auf den Bauch oder auf den Kopf. Lassen Sie die Lösung einige Sekunden einwirken, um mit der Absorption zu beginnen. Schrubben Sie nun mit einem Wattestäbchen vorsichtig den Anwendungsbereich, um die Lösung gleichmäßig zu verteilen und die Hautabsorption zu verbessern.

Massieren Sie dann die Stelle sanft mit einem sauberen Wattestäbchen und tragen Sie bei Bedarf mehr Lösung auf. Achten Sie auf das Auftreten von orangeroten Punkten, die allmählich zu einer einheitlichen Farbe verschmelzen, was auf eine erfolgreiche Farbdurchdringung und den Beginn der optischen Reinigung hinweist. Massieren Sie den Bereich weiter, bis die Haut transparent wird und die inneren Organe sichtbar sind, was normalerweise etwa drei bis fünf Minuten für eine kleine Fläche dauert.

Legen Sie vorsichtig einen Objektträger oder Deckglas über die Haut, um den Glanz der Oberfläche zu reduzieren und Reflexionen zu minimieren. Reinigen Sie die Färbelösung vorsichtig mit einem Wattestäbchen oder einem weichen, mit Wasser angefeuchteten Tuch von der Haut. Der optische Reinigungseffekt kehrt sich um und die Haut kehrt allmählich zu ihrem ursprünglichen undurchsichtigen Aussehen zurück.

Lassen Sie das Tier nach dem Ausschalten der Gasanästhesie wieder zu Bewusstsein. Sobald das Tier vollständig wach und mobil ist, bringen Sie es in seinen Heimatkäfig zurück. In unbehandeltem ex vivo Hühnerbrustgewebe waren die zugrunde liegenden Muster nicht sichtbar, und die Spektrometerdaten zeigten niedrige Transmissionswerte, die mit zunehmender Gewebedicke abnahmen.

Nach der Behandlung mit einer 0,65-molaren Tartrazinlösung wurde das Gewebe sichtbar transparent und die darunter liegenden Gitter- und Logomuster traten deutlich hervor. Es wurde auch ein erheblicher Anstieg der Transmissionswerte über alle Dicken im sichtbaren Spektrum beobachtet. Bei lebenden Mäusen ermöglichte die Anwendung von 0,65 molaren Tartrazinlösung die Visualisierung innerer Organe durch die Haut innerhalb von Minuten nach der Behandlung, was eine sichtbar erhöhte Transparenz im Bauchbereich zeigte.

Die optische Reinigung der Kopfhaut ermöglichte die Visualisierung von zerebralen Blutgefäßen ohne chirurgische Entfernung der Haut, was die Wirksamkeit der Technik für die Bildgebung des Gehirns demonstriert. Der Clearing-Effekt war vollständig reversibel. Durch das Spülen des Gewebes mit Wasser wurde innerhalb weniger Stunden die Deckkraft und das normale Hautbild wiederhergestellt, wobei über mehrere Tage hinweg ein Nachwachsen der Haare beobachtet wurde.