Subnanometer-Auflösung Strukturbestimmung von Hämagglutinin aus der Kryo-Elektronentomographie von Influenzaviren

Unser Labor nutzt Strukturbiologie, um Viren und die Entwicklung der Arzneimittelresistenz zu untersuchen. In der aktuellen Arbeit charakterisieren wir, wie Influenza-Hämagglutinin die Konformation bei der Rezeptorbindung verändert. Wir haben die Kryo-Elektronen-Tomographie genutzt, um die Organisation und Struktur der viralen Morphologie zu visualisieren.

Konkret haben wir diese Methode der Kryo-Elektronenmikroskopie verwendet, um die pleomorphe Virus-Influenza abzubilden. Unser Protokoll ermöglicht es uns, die Organisation und Struktur von Influenza-Hämagglutinin in situ an intakten Viren mit subnanometerreicher Auflösung zu untersuchen. Diese höhere Auflösung ermöglicht es uns, zuvor verborgene Interaktionen zu visualisieren.

Starten Sie zunächst ein Linux-Terminal zur Aktivierung der Conda-Umgebung. Nutze das Terminal, um die Conda-Umgebung mit installiertem ISO-Netz zu aktivieren. Erstelle einen Unterordner namens tomo-Ordner und verschiebe dann alle Tomogram-Dateien in diesen Ordner.

Als Nächstes verwenden Sie den Code, um eine Star-Datei im Projektordner zu generieren. Mit einem Texteditor öffnen Sie die generierte Sterndatei und geben Sie den ungefähren Defokus-Wert für die Null-Grad-Neigungsbilder in die vierte Spalte ein. Führe jetzt den CTFD-Faltungsbefehl im Terminal aus.

Nach der Dekonvolvierung wird die EMAN2-GUI-Umgebung aktiviert, um mit der Vorverarbeitung für die Teilchenaushebung zu beginnen. Unter Tomographie klickst du mit der linken Maustaste auf den Pfeil neben den Rohdaten, wähle im Dropdown-Menü Tomogramme importieren und wähle die Dateien aus. Klicken Sie dann mit der linken Maustaste auf den Pfeil neben Segmentierung und wählen Sie vorverarbeitete Tomogramme aus.

Verwenden Sie geeignete Standardparameter. Nach der Vorbearbeitung wird automatisch ein Info-Verzeichnis mit leeren JSON-Dateien erstellt, die mit den Grundnamen der Prozess-Tomographiedateien übereinstimmen. Füge Angstrom-Pixel-Informationen zu den Dateien hinzu, bevor du fortfährst.

Um ein konvolutionelles neuronales Netzwerk oder CNN zur Erkennung des HA-Glykoproteins zu trainieren, ändern Sie das Arbeitsverzeichnis auf den Ort der zu verwendenden Tomogramme. Öffne dann die CNN-Trainingsschnittstelle über das Terminal. Bestätigen Sie, dass vier Fenster offen sind.

Eines enthält Informationen zu CNN-Parametern und Tomogramme im Verzeichnis, und die anderen drei Fenster enthält Bilder guter Referenzen, schlechter Referenzen und Partikel, die vom CNN ausgewählt wurden. Im CNN-GUI klicken Sie auf die neue Option, um ein CNN mit einer Standardlernrate von 0,0001 und einer Boxgröße von acht zu initialisieren. Unter der Dateinamen-Spalte linksklickt man auf ein repräsentatives Tomogramm, um es zu öffnen.

Fahre mit dem Cursor über das offene Tomogramm und klicke auf das Maus-Scrollrad, um ein neues Fenster zu öffnen. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf den N-Zahl-Schieber, um die Z-Achse zu durchqueren. Als Nächstes verwenden Sie im offenen Tomogramm das Panel gute Referenzen, um 10 bis 20 Merkmale auszuwählen, die dem HA entsprechen. Positive Bilder erscheinen im positiven Fenster.

Um eines zu entfernen, halte Shift gedrückt und klicke mit der linken Maustaste darauf. Wechsle nun zum Bad Reference-Panel und wähle 10 bis 20 Referenzen aus, die zu Merkmalen wie leeren Membranpatches, der RNP-Dichte, Fiducialmarkern und Ablagerungen gehören. Stellen Sie die Anzahl der Iterationen auf 50 ein und klicken Sie auf das Zug-Symbol, um mit dem CNN-Training zu beginnen.

Nach Abschluss der Ausbildung drücken Sie auf Bewerbung. Ausgewählte Teilchen werden im Tomogramm als blaue Kreise angezeigt oder im Partikelfenster sichtbar. Feinen Sie weiter, indem Sie zusätzliche positive und negative Referenzen auswählen und regelmäßig auf Speichern klicken, um den Fortschritt zu erhalten.

Sobald das CNN zufriedenstellend funktioniert, klicke auf 'Apply all', um Particle Picking auszuführen. Dann bewerten Sie die Ergebnisse mehrerer Tomogramme und trainieren Sie bei Bedarf neu. Um Koordinaten für jedes Tomogramm zu speichern, öffnen Sie die EMAN2-GUI mit dem Befehl e2projectmanager.py.

Klicken Sie auf den Pfeil unter Subtomogramm-Durchschnitt und wählen Sie manuelles Boxen aus. Gib jetzt den Namen des Tomogramms ein und klicke auf Launch. Dann klickst du nacheinander auf die Datei, speichere das Box-Kabel und tomogram_ha.

txt, um die Koordinaten zu speichern. Navigiere zum Unterordner Neural-Netz und Info-Unterordner zum Sichern und Netzspeichern. HDF, Auszüge.

HDF, Segouts. hdf und boxes3Dref.hdf. Trainieren Sie einen zweiten CNN, um die M1-Proteinschicht und die Präsenz von VRNP zu erkennen, indem Sie die Größe der Trainingsbox von acht auf 14 ändern.

Um Partikel zu kuratieren, laden Sie zuerst Notizbücher aus dem GitHub-Repository herunter. Dann öffne das CNN-Partikelreinigungs-Notebook und lade die erforderlichen Module. Lade die Textdateien der HA- und M1-Koordinaten ins Notizbuch.

Betrachten Sie sie als 3D-Clouds mit der offenen 3D-Bibliothek. Filtern Sie anschließend HA-Koordinaten-Ausreißer mit der offenen 3D-Methode der statistischen Ausreißer-Entfernung heraus. Berechnen Sie anschließend die Abstände zwischen HA- und M1-Punktwolken, indem HA-Punkte mit mehr als 20 Pixeln von M1 als Ausreißer identifiziert werden und die verbleibenden Koordinaten in einer Ausgabetextdatei gespeichert werden.

Alle Partikel verbinden und als Star-Dateien mit der PTS2-Star-Datei speichern. IPYNB. Mit WarpTools extrahieren Sie Partikel mit dem Biegfaktor vier und führen die initiale Subtomogrammmittelung in RELION minus vier mit dem Code durch. Konvertiere die Warpstern-Datei in das RELION 4-Format.

Dann generiere eine Anfangsreferenz mit RELION und raffiniere MPI auf einer Teilmenge von Teilchen. Führen Sie 3D-Auto-Verfeinerung an Subtomogrammen mit RELION Refine-MPI durch. Bei der Konvergenz wiederholt man die automatische Verfeinerung mit Titan-Translation auf acht und Schritt auf zwei.

Nutzen Sie 2D-Klassifikationen, um Junkpartikel mit RELION Refined zu verwerfen. Erstellen Sie Star-Dateien mit guten Klassen mit dem Code und kombinieren Sie dann die einzelnen Star-Dateien. Repräsentative Tomogramme zeigten pleomorphe Virionen mit Formen, die von kugelförmig bis zu verlängerten Formen reichten.

Der endgültige Subtomogramm-Durchschnitt erreichte eine globale Auflösung von 6,0 Ångström mit einer lokalen Auflösung von fünf bis sieben Ångström. Alpha-Helices und Beta-Sheets wurden in der endgültigen HA-Rekonstruktion aufgelöst, was die strukturelle Qualität der verfeinerten Karte unterstützte. Glykosylierungsstellen waren an vier Positionen am HA-Kopf und Stamm identifizierbar, was die Sichtbarkeit der Glykandichte in der finalen Rekonstruktion bestätigte.