Simultane markierungsfreie Autofluoreszenz-Multi-Harmonic-Mikroskopie

Die simultane markierungsfreie Autofluoreszenz-Multiharmonischen-Mikroskopie (SLAM-Mikroskopie) erfasst einzigartige Informationen in biologischen Proben durch Messung nichtlinearer Wechselwirkungen mit Licht. In unserem Labor verwenden wir diese Technik, um Leben und Krankheit auf mikroskopischer Ebene zu untersuchen. Wir beobachten eine Verschiebung hin zu markierungsfreier multimodaler Bildgebung, die umfassendere Einblicke in Zell- und Gewebestrukturen und -dynamiken bietet, während gleichzeitig Toxizität vermieden und komplementäre Kontraste und Korrelationen zwischen den Modalitäten ermöglicht werden.

Ein hochmodernes, markierungsfreies nichtlineares Mikroskop erfasst jeweils ein Signal, wodurch Fehlausrichtungen, Lichtschäden und viele gleichzeitige Prozesse vermieden werden können. Das SLAM überwindet diese Probleme, indem es einen streng koregistrierten multimodalen Kontrast ermöglicht, der zuverlässige räumliche und zeitliche Daten gewährleistet. Diese Technik ermöglicht die gleichzeitige Anregung und Detektion von vier Kanälen in einem Multiphotonenmikroskop.

Verwendung photonischer Kristallfasern zur Verbreiterung von Pulsen für SHG, THG sowie Zwei- und Drei-Photonen-Fluoreszenz. SLAM erfasst gemultiplexte metabolische strukturelle und dynamische Zellsignalinformationen ohne Alignment-Artefakte oder exogene Markierungen und ermöglicht so eine standardisierte quantitative Gewebeanalyse. Seine Anwendungen umfassen die Grundlagenbiologie, die translationale Forschung und die Entdeckung von Biomarkern in der Onkologie, Neurodegeneration und Geweberegeneration.

Verwenden Sie zunächst ein Spektrometer oder einen optischen Spektrumanalysator, um den Laser nach dem Parabolspiegel zu vermessen und die Superkontinuumserzeugung der photonischen Kristallfaser zu überprüfen. Drehen Sie die Halbplatte hinter dem polarisierenden Strahlteiler, um die Breite des Superkontinuums zu optimieren. Schalten Sie den Mikroskopie-Autokorrelator ein.

Stellen Sie in der Software den Detektor auf den internen Detektor ein und stellen Sie den Scanbereich auf 5 Pikosekunden ein, um die volle Breite der Impulsautokorrelation zu erfassen. Lösen Sie die Blockade des Lasers und richten Sie den Autokorrelator auf den Strahl aus, der den Pulsformer verlässt, bis ein Signal erscheint. Stellen Sie sicher, dass Verschluss 2 geschlossen ist.

Tragen Sie dann das entsprechende Immersionsmedium wie Wasser oder Öl auf die Objektivlinse auf. Platzieren Sie den externen Detektor des Autokorrelators auf dem Mikroskoptisch und positionieren Sie ihn direkt über dem Objektiv. Schalten Sie nun die scannenden Galvanometerspiegel ein, um deren Spannung auf 0 zu setzen.

Öffnen Sie den Verschluss und verwenden Sie ein fluoreszierendes Ziel, um zu bestätigen, dass der Strahl den externen Detektor erreicht. Legen Sie den Autokorrelator-Detektor auf den externen Detektor fest. Passen Sie dann die Tischposition an, bis das Signal erscheint.

Passen Sie die Polynomkoeffizienten des Pulsformers an, um die vom Autokorrelator gemessene Pulsbreite iterativ zu minimieren. Wenn die Pulsbreite abnimmt, verringern Sie den Scanbereich entsprechend, um die Genauigkeit und Visualisierung der Autokorrelationsfunktion zu verbessern. Stellen Sie sicher, dass der Lasereingang zur photonischen Kristallfaser blockiert ist, und schalten Sie den Laser ein.

Lassen Sie den Laser 30 Minuten lang aufwärmen. Vergewissern Sie sich, dass der Strahlengang frei von Hindernissen ist, und platzieren Sie dann ein optisches Leistungsmessgerät im Strahlengang direkt vor der photonischen Kristallfaser. Drücken Sie die Steuertaste, um Verschluss 1 zu öffnen und die Eingangsleistung zu messen.

Verschluss 1 wieder schließen. Bewegen Sie den Leistungsmesser an den Ausgang der photonischen Kristallfaser nach dem Parabolspiegel. Öffnen Sie den Verschluss 1 und verwenden Sie den dreiachsigen Eingangstisch, um die Ausgangsleistung zu maximieren.

Lassen Sie die photonische Kristallfaser 10 Minuten lang erwärmen, maximieren Sie dann die Ausgangsleistung wieder mit dem Drei-Achsen-Tisch und zeichnen Sie die Übertragung des PCF auf. Bewegen Sie das Leistungsmessgerät hinter den Neutraldichtefilter und drehen Sie den Filter, um die Laserleistung einzustellen, die die Probe erreicht. Multiplizieren Sie die gemessene Leistung mit dem Transmissionsgrad der verbleibenden Optik, um die Probenleistung zu bestimmen.

Schalten Sie nun die Galvanometer und den Tisch ein. Starten Sie die Erfassungssoftware und geben Sie die gewünschten Bildparameter ein. Legen Sie die Probe mit demselben Immersionsmedium auf den Tisch, das zuvor auf die Objektivlinse aufgetragen wurde.

Schalten Sie dann die Raumbeleuchtung aus und schließen Sie die Vorhänge, um das Eindringen von Umgebungslicht zu verhindern. Schalten Sie anschließend die Netzteile und Verstärker des Detektors ein. Schließen Sie den Leuchtkasten, der den Mikroskoptisch umgibt.

Mit den elektronischen Steuerschaltern können Sie die Melderklappen 3-6 manuell öffnen. Klicken Sie in der Erfassungssoftware auf die Option Zum Starten der Erfassung, um das SLAM-Imaging zu starten. Stellen Sie den Fokus des Mikroskops mit dem Tischregler ein, bis die Probe deutlich sichtbar ist.

Verwenden Sie den Joystick am Mikroskoptisch-Controller, um das gewünschte Sichtfeld zu finden. Klicken Sie nach der Positionierung auf Stopp und Zurücksetzen. Schalten Sie auf der Registerkarte Speichern die Option Daten speichern auf Ja um.

Klicken Sie dann auf die Option Click to Start Acquisition und warten Sie, bis das Imaging abgeschlossen ist. Um die Probe während der Bildgebung zu manipulieren, schließen Sie die Detektorverschlüsse und verwenden Sie eine Taschenlampe oder Stirnlampe zur Beleuchtung. Kehren Sie nach den Anpassungen zum Imaging-Setup zurück.

Um die Bildaufnahme zu beenden, schließen Sie die Melderverschlüsse, schalten Sie die Melder aus und schalten Sie erst dann die Raumbeleuchtung ein. Blockieren Sie den Laser mit Verschluss 1 und schalten Sie ihn dann aus. Schalten Sie die Galvanometer aus, schalten Sie die Erfassungssoftware aus und schließen Sie sie.

Entsorgen Sie die Gewebeprobe ordnungsgemäß und reinigen Sie den Arbeitsplatz. Eine richtig gespaltene photonische Kristallfaser zeigte eine flache Endfläche senkrecht zu ihrer Achse und eine saubere Fläche. Schlecht gespaltene photonische Kristallfasern zeigten abgewinkelte Schnitte, abgebrochene Flächen und ausgeprägte Kratzer oder Ablagerungen auf der Oberfläche.

Unsachgemäße Handhabung oder Kontamination führte zu sichtbarem Schmutz und Partikelablagerungen um die Faseroberfläche, die das Luftlochmuster verdeckten. Ein verbrannter Kern mit abgedunkelten Bereichen deutete auf eine beschädigte photonische Kristallfaser am Ende ihrer Lebensdauer hin. Das Superkontinuumsspektrum erstreckte sich über etwa 975-1.175 Nanometer mit einer flachen Oberseite und ausgeprägten spektralen Modulationen.

Die Pulsautokorrelation nach der Kompression zeigte ein symmetrisches Profil mit einem schmalen halben Maximum über die gesamte Breite, was auf eine gute Pulsformung hinweist. Einwandfrei funktionierende Superkontinuumsquellen erzeugten starke Signale der zweiten und dritten Harmonischen. Ein verengtes Superkontinuum führte zu einem Verlust der Signalintensität der dritten Harmonischen, während das Signal der zweiten Harmonischen erhalten blieb.

Das Fehlen von Pulsformung reduzierte alle nichtlinearen Signale drastisch, was zu einem schwachen und kontrastarmen Bild führte. Die erfolgreiche SLAM-Bildgebung von ex vivo Nierengewebe zeigte ausgeprägte Nephronstrukturen mit mehreren starken optischen Signalen, einschließlich der Erzeugung der dritten Harmonischen und der NADPH-Fluoreszenz. Interstitielle Kollagenfasern der Niere waren über starke Signale der zweiten harmonischen Erzeugung identifizierbar.

Das Bild des Redoxverhältnisses zeigte einen erhöhten aeroben mitochondrialen Metabolismus in den proximalen Tubuli der Nierenrinde im Vergleich zur Medulla. Eine zweite Karte des Redoxverhältnisses bestätigte die räumliche Variation des oxidativen und glykolytischen Stoffwechsels, was den unterschiedlichen Energieverbrauch im Gewebe verstärkt.