Name: Simultane markierungsfreie Autofluoreszenz-Multi-Harmonic-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-29T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Erfahren Sie die markierungsfreie SLAM-Mikroskopie für multimodale Bildgebung biologischer Gewebe. Diese Methode erfasst vier komplementäre Kontraste gleichzeitig und ermöglicht präzise Analysen von Zell- und Gewebestrukturen.

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Die nichtlineare optische Mikroskopie nutzt die Reaktion einer Probe auf intensive optische Strahlung (Licht mit elektrischen Feldern größer als 3 × 103 V/cm), um einen Bildkontrast abzuleiten, bei dem die induzierte Polarisation (und damit das erzeugte Signal) nichtlinear von der einfallenden Intensität 1,2,3 abhängt. Da diese multiplen Kontraste jeweils durch unterschiedliche Licht-Materie-Wechselwirkungen vermittelt werden, bietet die nichtlineare Mikroskopie gleichzeitigen Zugang zu einzigartigen Informationen sowohl über die Morphologie als auch über die chemische Landschaft einer Probe 1,2,3. Während traditionelle Mikroskopietechniken, die eine lineare Wechselwirkung mit dem Beleuchtungslicht beinhalten, auch eine quantitative Bildgebung ermöglichen, ermöglicht die nichtlineare Mikroskopie einen multimodaleren Ansatz, der oft eine verbesserte Abbildungstiefe und optische Schnitte aufweist und gleichzeitig weniger Lichtschäden an der Probe verursacht4. Im Rahmen biomedizinischer Anwendungen, wie z. B. der intraoperativen histologischen Bewertung von Gewebe 5,6, ermöglicht diese Technik die direkte Sondierung nativer Biomoleküle und ermöglicht so nahtlose Untersuchungen lebender Zellen, ohne dass externe Marker oder Modifikationen erforderlich sind. Dieser Ansatz vermeidet die Verwendung von Markierungen, Markierungen7, exogenen Molekülen, genetisch exprimierten fluoreszierenden Proteinen oder Nanopartikeln, die nicht nur einen hohen Arbeitsaufwand erfordern, sondern auch das Potenzial haben, die native Biochemie der Probe zu stören und sich negativ auf Zielzellen oder -gewebe auszuwirken 8,9,10. Somit dient das nichtlineare Mikroskop als leistungsstarkes und echtes Analysewerkzeug, das eine kontinuierliche Abbildung mikroskopischer Strukturen ermöglicht, ohne die chemische und strukturelle Integrität der Probe zu verändern. Diese Fähigkeit eröffnet eine breite Palette von Anwendungen, die von der Diagnose und Wirkstoffforschung bis hin zur Zellsignalisierung und Systembiologie reichen.
Multiphotonenkontraste wie Zwei-Photonen-Autofluoreszenz (2PAF), Drei-Photonen-Autofluoreszenz (3PAF), Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) und Erzeugung der dritten Harmonischen (THG) bieten jeweils analytische Vorteile bei der Charakterisierung von Proben. 2PAF wird von endogenen Flavinen erzeugt, wobei Flavin-Adenosindinukleotid (FAD) in biologischen Systemen am häufigsten vorkommt11. 3PAF nutzt die Nahinfrarotanregung, um intrinsische Chromophore wie NAD(P)H sichtbar zu machen, und ermöglicht die metabolische Bildgebung bei gleichzeitiger Umgehung von UV-bedingten Phototoxizitäts- und Dämpfungsproblemen12. SHG zeigt spezifisch nicht-zentrosymmetrische molekulare Strukturen wie fibrilläres Kollagen (Typen I, II und III) und Proteinarrays 13,14,15,16,17 auf, was strukturelle Einblicke ermöglicht 1. Schließlich eignet sich THG, das empfindlich auf Grenzflächen und kleine strukturelle Merkmale reagiert, hervorragend für die Abbildung von Lipidverteilungen und extrazellulären Vesikeln 18,19,20,21,22.
Jedes dieser Kontrastsignale wurde unabhängig voneinander von Forschungsgruppen untersucht, wodurch sich die Nische für die nichtlineare Multiphotonenmikroskopie als zuverlässiges und vielseitiges Werkzeug für biologische Anwendungen etablierthat 23,24,25,26. Diese Bemühungen wurden von den Erfindern des 2PAF-Mikroskops angeführt, die ihre innovative Technologie nutzten, um neue Einblicke in die Gewebemorphologie, den Zellstoffwechsel und sogar die morphofunktionellen Merkmale von Krankheiten wie Alzheimer und Krebs zu gewinnen23. Ihre Arbeit hat letztlich zu bahnbrechenden Anwendungen in den Neurowissenschaften geführt27,28. In den folgenden Jahren hoben mehrere Forscher die Empfindlichkeit des SHG gegenüber Veränderungen in der extrazellulären Matrix hervor, dem Gerüst, das den Zellen strukturelle Unterstützung bietet und das während der Krebspathogenese erhebliche Veränderungen erfährt29. Campagnola et al.14,24,30,31 zeigten, dass die SHG-Mikroskopie die Visualisierung makromolekularer und supramolekularer Anordnungen ermöglicht und Details wie die Anordnung, Konzentration und Art des Kollagens enthüllt, die mit herkömmlichen fluoreszenzbasierten Techniken nicht nachweisbar sind. Diese Ergebnisse unterstreichen das Potenzial der SHG-Mikroskopie als praktikables Diagnoseinstrument im klinischen Umfeld. Schließlich wurde die THG-Mikroskopie erfolgreich eingesetzt, um Netzhautschichten bei Nagetieren mit subzellulärer Auflösung25 zu visualisieren, Gehirnstrukturen32 zu kartieren und die Multigrenzflächentopographie der Melanomzellinvasionzu erfassen 33.
Diese historischen Implementierungen der nichtlinearen Mikroskopie beinhalteten im Allgemeinen einen modengekoppelten Femtosekundenlaser (fs), der an ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur (NA) gekoppelt war, um die nichtlinearen Signale zu erzeugen und zu sammeln, die dann mit einem dichroitischen Spiegel zu einem Bandpassfilter geleitet und mit einer Photomultiplier-Röhre (PMT) gesammelt wurden34. Trotz ähnlicher Implementierungen konzentrierten sich die meisten Anwendungen darauf, nur einen oder höchstens zwei Kontraste zu erfassen, während die anderen übersehen wurden. Um das Potenzial des Multiphotonenmikroskops voll auszuschöpfen, implementierten Boppart et al. zunächst die sequentielle Erfassung mehrerer nichtlinearer Kontraste 21,35,36,37, gefolgt von deren gleichzeitiger Detektion 4,22,38,39,40,41 . Die daraus resultierende Technik, die als Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-Harmonic (SLAM)-Mikroskopie bekannt ist, registriert die nichtlinearen 2PAF-, 3PAF-, SHG- und THG-Signale räumlich und zeitlich durch Single-Shot-Anregung und Multiplex-Detektion und erreicht so eine überlegene analytische Leistung. Die raumzeitliche Co-Lokalisierung dieser vier Kanäle liefert hochrangige und funktionsreiche Daten42, die Vorteile gegenüber sequentiell erfassten Daten bieten, indem sie Bewegungsartefakte eliminieren und eine verbesserte Bildregistrierung gewährleisten. Folglich ermöglicht SLAM die Erzeugung von zusammengesetzten Merkmalen, wie z. B. optischen Reduktions-Oxidations-Verhältnissen, die die metabolischen Eigenschaften effektiv charakterisieren 43,44,45. Darüber hinaus erleichtert die kombinierte Analyse von Signalen über Modalitäten hinweg die Entwicklung zusätzlicher Funktionen auf der Grundlage der Korrelation und Kolokalisierung von Kanälen. Shi et al. zeigten beispielsweise, wie wichtig die Kolokalisationsmerkmale der SLAM-Mikroskopie für die genaue Klassifizierung von Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) sind, die in der pharmazeutischen Produktion verwendet werden42. Auf diese Weise legt SLAM den Grundstein für das, was heute als Stand der Technik in der Multiphotonenmikroskopie gilt, und ebnet den Weg für zukünftige Fortschritte auf diesem Gebiet46.
In diesem Protokoll skizzieren wir die Schlüsselkomponenten eines SLAM-Mikroskops (Abbildung 1) und beschreiben eine Schritt-für-Schritt-Methodik für seine Implementierung. Dazu gehören die Erzeugung und Formgebung der Anregungsimpulse, die repräsentative Gewebeprobenvorbereitung, bildgebende Verfahren und die Verarbeitung sowie die Darstellung der resultierenden Daten. Durch die Verwendung von Standardtechnologie und etablierten Techniken ist dieses Protokoll universell, übertragbar und kann mit ähnlichen optischen Systemen in verschiedenen Labors leicht reproduziert werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68637/68637fig1v2.jpg"> 
Abbildung 1: Das optische Design eines simultanen markierungsfreien Autofluoreszenz-Multiharmonischen (SLAM) Mikroskops. Der Femtosekundenlaser gibt 1040 nm Licht in 370 fs Pulsen bei einer Wiederholrate von 10 MHz aus. Intensität und Polarisation des Lasers werden sorgfältig kontrolliert, bevor ein photonischer Kristall gepumpt wird, um ein Superkontinuum zu erzeugen. Die Pulse werden dann von einem Pulsformer komprimiert und in ein kundenspezifisches Laser-Scanning-Mikroskop geleitet (gestrichelte Box). Dichroitische Spiegel und Bandpassfilter isolieren die von der Probe erzeugten nichtlinearen Signale, bevor sie von hochempfindlichen Photonendetektoren wie Photomultiplier-Röhren (PMTs) oder Hybrid-Photodetektoren (HPDs) detektiert werden. Das optische Design basiert auf einem zuvor beschriebenen System41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68637/68637fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>3-Achsen-Tisch</td><td>ThorLabs (Englisch)</td><td>MAX316</td><td>Unterbrochen.</td></tr><tr><td>35 mm Bildschale mit Glasboden</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>Unbeschichtetes #0 Deckglas.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>21063029</td><td>Hoher Glukosegehalt, HEPES, kein Phenolrot.</td></tr><tr><td>Nahrungsergänzungsmittel für das Wachstum von Endothelzellen</td><td>PromoCell</td><td>Nr. C-39210</td><td>Fötales Kälberserum weglassen.</td></tr><tr><td>FemtoTrain Femtosekundenlaser</td><td>Spektren-Physik</td><td>1040-5</td><td>Durchschnittliche Leistung: >5,0 W, Pulsenergie: >500 nJ, Wellenlänge: 1040 nm &plusmn; 8 nm, Wiederholrate: 10 MHz, Pulsbreite (FWHM): < 220 fs.</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Cytiva</td><td>SH30071.03</td><td>HyClone charakterisiert.</td></tr><tr><td>Abisolierer für Fasern</td><td>ThorLabs (Englisch)</td><td>T10S13</td><td></td></tr><tr><td>Flavinadenin-Dinukleotid-Dinatriumsalzhydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. F6625</td><td></td></tr><tr><td>Galvanometer-Spiegel</td><td>Cambridge Technologie</td><td>6215H</td><td>Unterbrochen.</td></tr><tr><td>Arbeitsplatz für die Glasbearbeitung</td><td>Vytran</td><td>GPX3800</td><td></td></tr><tr><td>BildJ</td><td>Eliceiri Labor an der University of Wisconsin Madison</td><td>Version 2.16.0</td><td>Fidschi Vertrieb.</td></tr><tr><td>Kimwipe Seidenpapier</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Cytiva</td><td>SH30034.01</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskoptisch</td><td>Angewandte wissenschaftliche Instrumente</td><td>FTP-2050</td><td></td></tr><tr><td>Tischregler für Mikroskope</td><td>Angewandte wissenschaftliche Instrumente</td><td>MS-2000-500-UDSW</td><td></td></tr><tr><td>Autokorrelator für Mikroskopie</td><td>Angewandte Physik und Elektronik GmbH</td><td>Carpe</td><td></td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>Olymp</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td>Eintauchen in Wasser, 25-fache Vergrößerung, 1,05 NA.</td></tr><tr><td>Optischer Leistungsmesser</td><td>Newport</td><td>Artikel-Nr.: 919P-003-10</td><td>600 - 1700 nm.</td></tr><tr><td>Optischer Spektrumanalysator</td><td>ThorLabs (Englisch)</td><td>OSA202C</td><td></td></tr><tr><td>Photonische Kristallfaser</td><td>NKT Photonik</td><td>LMA-PM-15 NKT</td><td>Großer Modenbereich, Polarisation beibehaltend. Kerndurchmesser: 15 &μm.</td></tr><tr><td>Präzisions-Spaltgerät für optische Fasern</td><td>Fujikura</td><td>CT-101</td><td></td></tr><tr><td>Impulsformer</td><td>Biophotonik-Lösungen Inc.</td><td>FemtoJock-D</td><td>Unterbrochen.</td></tr><tr><td>&beta;-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid, reduziertes Dinatriumsalzhydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10128023001</td><td></td></tr></tbody></table>

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Simultaneous Label-Free Autofluorescence Multi-Harmonic Microscopy

Der komplexe, mehrkanalige, multimodale Ansatz des SLAM-Mikroskops (Abbildung 1) kann es für neue Benutzer schwierig machen, Probleme zu beheben und die Ergebnisse zu verstehen. Erstens weist ein gut gespaltenes PCF eine saubere Oberfläche auf (Abbildung 2C) mit einer flachen Oberfläche, die senkrecht zur Länge des PCF verläuft (Abbildung 2A). Eine abgewinkelte, abgebrochene Spaltfläche (Abbildung 2B) u...

Simultane markierungsfreie Autofluoreszenz-Multi-Harmonic-Mikroskopie

Nonlinear optical microscopy images biological samples by detecting signals from the nonlinear interaction of ultrashort laser pulses with endogenous ...

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Biotechnik

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