Mikrobioreaktor-basierte Produktion von ankerabhängigen mesenchymalen Stromzellen, die auf das akute Atemnotsyndrom vorbereitet sind

Wir untersuchen, wie Zellen mit ihrer Umgebung interagieren, auch bei der Produktion oder Herstellung von Zellen als Therapie. Hier behandeln wir Fragen dazu, wie ankerabhängige Zellen wie MSCs, mesenchymale stromale oder Stammzellen produziert werden können, um einige Barrieren für die klinische Translation zu überwinden. Wachsende Erkenntnis, dass die Variabilität der Zellpopulationen sowohl die Konsistenz als auch die Wirksamkeit des Endprodukts für jede Charge oder Person beeinflusst.

Diese Herausforderungen können sogar die regulatorische Zulassung für einige Zelltherapien beeinträchtigen. Wir zielen auf eine Lücke ab, die eine hohe Anzahl von Zellen pro Milliliter Flüssigkeit bei hoher Umgebungskontrolle und auf eine Weise erreichen kann, die vergrößert werden kann. Dieses Protokoll bietet eine Möglichkeit, eine Inline-Umweltüberwachung für Zellen einzubeziehen, die wie MSCs ankerabhängig sind.

Diese Prozesskontrolle ist ein Vorteil gegenüber Kolben, die noch in den meisten Labor- und klinischen Produktionen verwendet werden. Es gibt mehrere offene Fragen zu MSCs und anderen Zelltypen, die empfindlich auf mechanische Signale reagieren. Zum Beispiel: Wie kann ein solcher Ansatz helfen, Zellen zu konstruieren, um andere Krankheitszustände zu behandeln?

Um zu beginnen, entferne den durchsichtigen Plastikdeckel, der mit Flasche LL im Flaschenregal verbunden ist. Mit einer neuen sterilen 50-Milliliter-Spritze ohne Pümpel verbinden Sie die Düse mit Flasche LL. Gießen Sie das sterile gefilterte Wasser in den Spritzenbehälter und injizieren Sie es in Flasche LL. Ebenso füllen Sie Flasche L mit 25 Millilitern niedrig-Glukose-DMEM ohne FBS, Flasche R mit 25 Millilitern sterilem PBS und Flasche RR mit acht Millilitern Anti-Haft-Spüllösung. Wiederholen Sie das Verfahren, um die erforderliche Anzahl an Verbrauchsmaterialien für das Experiment vorzubereiten.

Als Nächstes führen Sie einen Selbsttest an jeder Kapsel durch, die im Experiment verwendet werden soll. Sobald der Pod alle Kontrollen des Selbsttests erfolgreich bestanden hat, entferne die Selbsttestkassetten und verstaue sie in lichtgeschützte Aufbewahrungstaschen. Befestige das Verbrauchsgut am Bioreaktor.

Entferne das grüne Klebeband von den Verbrauchsventilen und installiere das Verbrauchsmaterial in der Kapsel. Setze die Klemmen wieder ein und prüfe auf Zischen, um eine sichere Abdichtung zu bestätigen. Verbinden Sie die Leitung des Weißdrucksensors, die rote Luftdruckleitung und die blaue Vakuumleitung zwischen dem Verbrauchsgut und der Basisstation oder der Kapsel.

Bestätigen Sie, dass der seitliche Einspritzport mit einer weißen Tropfenklemme verschlossen ist, bevor Sie ein neues Experiment starten. Klicken Sie auf das Flush Bottles-Symbol in der Softwareoberfläche. Aktivieren Sie die Funkknopf für Flasche L, wählen Sie Ausgabe zum Abfall und klicken Sie dann auf MSCserum starten.

Im Fenster "Flascheninhalt" geben Sie an, dass sich MSCserum in Flasche R befindet, die PBS enthält. Dann gehe ich zu Manual Ops und führe drei Auswurf-Waschzyklen an der Abfallflasche durch. Im Fenster Flascheninhalt wird angegeben, dass sich MSCserum jetzt in der Flasche RR befindet, die die Anti-Adhärenz-Spüllösung enthält.

Geh zurück zu Manual Ops und führe einen Auswurf-Waschgang an der Müllflasche durch. Nach 30 Minuten spülen Sie das Verbrauchsmaterial mit PBS aus. Entleeren Sie den Reaktor, um auf die Zell- und Mikroträgerinjektion zu warten.

Im Manual Ops-Panel klicke auf Wiederholen. Lassen Sie das System an der Stelle pausieren, in der das Armaturenbrett eine Aufforderung zum Inokulieren des Reaktors anzeigt. Anschließend pipettieren Sie ein berechnetes Volumen resuspendierter Zellen in ein 15-Milliliter-konisches Rohr mit Mikroträgern für jede Bedingung.

Füllen Sie jedes Rohr mit frischen, warmen menschlichen mesenchymalen Stammzellmedien zwischen 2,2 und 2,5 Millilitern auf. Arbeiten Sie mit ein oder zwei Verbrauchsgütern gleichzeitig, entfernen Sie sie aus der Basisstation und bringen Sie sie in den Biosicherheitsschrank. Ziehen Sie die Zellen- und Mikroträgermischung mit einer grünen vier Zoll stumpfen Nadel in eine fünf-Milliliter-Spritze.

Injizieren Sie das Gemisch in den Reaktor. Greifen Sie die Injektionsportleitung nahe der Basis der Kassette und achten Sie darauf, die Leitung nicht abzutrennen. Mit einer rollenden Bewegung zwischen Daumen und Zeigefinger drehen Sie die Injektionsportlinie zwei volle Umdrehungen, um einen verknoteten Knick in der Linie zu erzeugen.

Stecken Sie den Knoten in den Ausschnitt nahe der Basis des Injektionsports und sichern Sie ihn mit einem kleinen Stück Laborband. Dann bringen Sie das Verbrauchsgut zur Basisstation zurück. Nachdem Sie die Injektion für alle Verbrauchsgüter wiederholt haben, navigieren Sie durch die Softwareoberfläche, um anzuzeigen, dass die Impfung abgeschlossen ist.

Wenn die Software zur Startseite zurückkehrt, entferne die weiße Klemme aus den verbrauchbaren Ausgabezeilen. Gehen Sie in Manual Ops ein und führen Sie die Funktion "Eject Excess aus" mit dem Output Port auf P für die Durchsetzung eingestellt. Aktivieren Sie den statischen Mischmodus mit einem Zyklus von 1, 680 Sekunden eingeschaltet und 120 Sekunden aus, und stellen Sie die Mischfrequenz auf fünf Hertz ein.

Um mit der Zellentnahme zu beginnen, verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, um 200 Mikroliter Pronase und etwa 300 bis 400 Mikroliter Luft zu entnehmen. Schrauben Sie die Kappe an der Seiteneinführungsleitung ab und sprühen Sie den nadellosen Ventilanschluss mit 70%-Ethanol ein. Entfernen Sie das Klebeband von der Injektionsleitung der verknoteten Seitenöffnung, lösen Sie den Knoten und lösen Sie die weiße Tropfenklemme.

Schließen Sie nun die Ein-Milliliter-Spritze an und injizieren Sie das Pronase vorsichtig in den Reaktor. Jagen Sie der Flüssigkeit mit Luft nach, um eine vollständige Lieferung zu gewährleisten. Ziehen Sie die Tropfenklemme wieder ein und schließen Sie die Einspritzleitung wieder ab.

Dann wird das Verbrauchsmaterial in den Pod zurückgegeben, alle Leitungen wieder angeschlossen, die weiße C-Klemme entfernt und das Mischen fortgesetzt. Stellen Sie die Abfallflasche und die Medienquellenflasche auf Eis. Starte einen fünfminütigen Timer und lass das Pronase die Mikroträger im Reaktor verdaut.

Nach fünf Minuten überprüfen Sie, ob die Mikroträger verschlechtert sind, indem Sie ihr Fehlen im Reaktor überprüfen. Ernte die Zellen, indem du manuelle Operationen eingibst, die Anzahl der Zyklen auf drei setze, wähle Output Port W für Abfall und klicke auf Eject Wash. Nach Abschluss der Auswurf-Waschzyklen wird das Verbrauchsmaterial in den Biosicherheitsschrank übertragen.

Dann entnehmen Sie den Inhalt der Abfallflasche mit einer 10- oder 20-Milliliter-Spritze. Gib den Inhalt der Abfallflasche in ein 15-Milliliter-konisches Zentrifugenrohr. Zentrifugiere die Zellen bei 300g für fünf Minuten.

Aspirieren Sie das Supernatant und bewerten Sie die Größe des Zellpellets. Umweltbedingungen, darunter pH-Wert, Temperatur, gelöster Sauerstoff und Kohlendioxid, wurden während der zehntägigen Kulturperiode im Mikrobioreaktorsystem stabil aufrechterhalten. Die pH-Variation war im Mikrobioreaktor deutlich geringer als im Gewebekultur-Polystyrolkolben.

Die Zellausbeute war im Mikrobioreaktor höher als im T25-Kolben, während eine ähnliche Zelllebensfähigkeit erhalten blieb. Von den 14 gemessenen, potenzassoziierten kritischen Qualitätsmerkmalen zeigten neun eine signifikant höhere mRNA-Expression im Mikrobioreaktorzustand im Vergleich zur T75-Kolbe.