Eine minimalinvasive Methode zur Generierung eines syngenen orthotopen Mausmodells für Lungenkrebs

Unsere aktuelle Forschung konzentriert sich auf das Verständnis von Lungenkrebserkrankungen und darauf, wie neue Behandlungsmethoden entwickelt werden können, die mit der Standardtherapie kompatibel sind, einschließlich Chemotherapie, Strahlentherapie und Immuntherapie. Wir konnten kein orthotopes Lungenkrebsmodell finden, das Kriterien für die spezifische Untersuchung von Lungenkrebs im Frühstadium festlegte. Wir arbeiten daran, klare und replizierbare Richtlinien bereitzustellen, um diese Lücke mit diesem Protokoll zu schließen.

Dieses Protokoll ist minimalinvasiv und einfach durchzuführen. Zusätzlich ermöglicht dieses Protokoll gemäß den von uns bereitgestellten Kriterien das Screening der präzisen Tumorimplantation und ermöglicht eine frühzeitige Tumorerkennung durch biolumineszente Bildgebung. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, Lungenkrebs im Frühstadium im Wirtsgewebe zu untersuchen, was die präklinische Weiterentwicklung neuartiger Krebstherapeutika und die Untersuchung der Tumormikroumgebung ermöglicht.

Wir werden diese Technik nutzen, um die Mechanismen und Wirksamkeit spannender neuer Lungenkrebsbehandlungen präklinisch zu bewerten, und hoffen, dass sie zu einer zukünftigen Patientenversorgung führen kann. Zu Beginn setzen Sie die betäubte Maus in einen Nasenkegel in Bauchlage auf ein Wärmgerät und tragen Sie Ophthalmsalbe auf beide Augen der Maus auf. Sobald die Anästhesie bestätigt ist, verwenden Sie einen elektrischen Scher, um das Fell aus einem rechteckigen Bereich von zwei mal drei Zentimetern auf der linken Rückenseite der Maus zu entfernen.

Abrasieren Sie von der Wirbelsäule medial, seitlich, die letzte Rippe nach unten und die obere Kante des Schulterblatts zum Kopf hin, bis kein Fell mehr sichtbar ist. Platziere die Maus in einen leeren Käfig auf einem Wärmegerät. Beobachten Sie das Atemmuster, bis die Maus wieder wachsam ist, und bringen Sie sie dann zurück in ihren Stammkäfig bis zur Operation.

Am Tag der Zellentnahme geben Sie drei bis vier Stunden vor der Entnahme frisches Medien, das 50 Milligramm Gentamycin pro Milliliter enthält. Aspiriere das Medium von der Kulturplatte und wasche die angeschlossenen Zellen mit 1x PBS. Dann inkubieren Sie die Zellen mit einer Trypsin-EDTA-Lösung für ein bis zwei Minuten bei 37 Grad Celsius.

Fügen Sie frisches Medium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Verteilt die Zellen durch sanftes Klopfen oder Pipettern der Platte. Dann sammeln Sie die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-konisches Rohr.

Jetzt zentrifugiere das konische Rohr bei 1.200 G für drei Minuten bei Raumtemperatur. Nachdem Sie das Vorhandensein eines kompakten Pellets am Boden bestätigt haben, aspirieren Sie das Überlagerungsmittel und waschen Sie das Pellet mit PBS. Lassen Sie das gewaschene Zellpellet in PBS erneut suspendieren, um eine Konzentration von etwa ein bis 2 Millionen Zellen pro Milliliter zum Zählen zu erreichen.

Filtern Sie die Federung vor der Fahrt durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb. Anschließend werden 10 Mikroliter der Zellsuspension mit 10 Mikrolitern Trypanblau kombiniert. Laden Sie die gefärbte Probe in ein Hämozytometer und zählen Sie die Zellen.

Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen und die Lebensfähigkeit der Zellen. Zentrifugiere die Zellen erneut bei 1.200 G für drei Minuten bei Raumtemperatur und sauge das PBS ab, das das Pellet verlässt. Setzen Sie das Zellpellet in 0,5 Milligramm pro Milliliter Metra-Gel in PBS wieder auf.

Stellen Sie die gewünschte Zellzahl in einem Gesamtinjektionsvolumen von 50 Mikrolitern ein. Lassen Sie die Zellsuspension auf Eis, um die Verhärtung der Matrigel zu verhindern. Reinigen Sie die Operationsstelle des narkosierten Tieres dreimal mit steriler Mullbinde, abwechselnd zwischen Betadin und 70 % Ethanol.

Es wird sterilisiertes fenestriertes chirurgisches Vorhang mit einer drei mal vier Zentimeter großen Öffnung über der Maus gelegt und Autoklav-Operationsinstrumente auf dem Vorhang ausgebreitet. Bestimmen Sie mit einer Zange den Schädelrand des Schulterblatts und den Spitzenrand des Brustkorbs. Indem die Haut zwischen Daumen und Zeigefinger des Chirurgen straff gehalten wird, machen Sie mit einer Skalpellklinge der Größe 10 einen oberflächlichen fünf-Millimeter-Hautschnitt direkt unterhalb des Schulterblatts.

Dann verwenden Sie eine 115-Millimeter-Schere, um das subkutane Fett stumpf von den Rippen und Zwischenrippenmuskeln wegzuschneiden, ohne sie durchzuschneiden. Um eine durch Kapillarschäden verursachte Lichtblutung zu stoppen, drücken Sie einen sterilisierten Applikator mit Baumwollspitze leicht auf die blutende Stelle. Halte den Schnitt mit Mikro-Ads und Pinzetten offen.

Beginnend bei der siebten echten Rippe verwenden Sie eine gebogene mittelste Spitzzang, um nach oben zu zählen und die vierte und fünfte Rippe zu lokalisieren. Markiere diesen Bereich als Injektionsstelle. Nun wenden Sie das Zellsuspensionsrohr vorsichtig drei- bis viermal um, um zu mischen.

Kurz vor der Injektion ziehen Sie 50 Mikroliter der Suspension in eine sterile 300-Mikroliter-Acht-Millimeter-Insulinspritze mit 31 Gauge, wobei Sie darauf achten, dass keine Blasen vorhanden sind. Legen Sie einen vier Millimeter dicken Streifen sterilisiertes Metallband an die Spritze an, um als Stopper zu dienen und die Einspritztiefe zu kontrollieren. Injizieren Sie die 50-Mikroliter-Zellsuspension in einem 90-Grad-Winkel in den Zwischenrippenraum zwischen Rippen vier und fünf direkt unter der vierten Rippe und halten Sie die Nadel zwei bis drei Sekunden in Position.

Ziehen Sie die Nadel langsam im gleichen Winkel heraus, in dem sie eingesetzt wurde, und werfen Sie sie in einen scharfen Behälter weg. Schließen Sie schließlich den Hautschnitt mit zwei bis drei quadratischen Knotennähten und tragen Sie veterinärchirurgischen Kleber über die Nähte auf, um den Wundverschluss zu verstärken. Die Biolumineszenzbildgebung erkannte tumorassoziierte Signale bei den experimentellen Mäusen bereits einen Tag nach der Injektion, und die Strahlung nahm im Laufe der Zeit sichtbar bei 25.000 bis 50.000 Zellen pro Mausgruppe zu, wobei in der 50.000-Zellgruppe eine höhere Intensität beobachtet wurde.

Der totale Tumorfluss stieg exponentiell sowohl in 25.000 als auch in 50.000 Zellgruppen an und erreichte bis Tag 21 in der 50.000-Zellgruppe über das 10-fache 10 mit einer Potenz von acht Photonen pro Sekunde. Scheinmäuse zeigten keine Leuchtkraft oder sichtbaren Tumor in dissektionierten Lungen, während experimentelle Mäuse hohe Leuchtkraft und rote Tumormassen im Lungengewebe aufwiesen. 21 Tage nach der Injektion zeigten die eingeschlossenen Mäuse Tumore im linken Lungenlappen ohne Invasion in die umliegenden Bereiche.