Verwendung von zerebraler Offenfluss-Mikroperfusion zur longitudinalen Sammlung von Zwischenflüssigkeit in einem Tiermodell des Glioblastoms

Wir charakterisieren lösliche Signalkomponenten in der interstitiellen Flüssigkeit des Gehirntumors, die zum Krankheitsverlauf und zur Behandlungsreaktion beitragen. Die Bewertung der absoluten Konzentrationen von gelösten Stoffen im Gehirntumor-Interstitialbereich bleibt eine experimentelle Herausforderung, die den Einsatz ausgefeilter experimenteller Methoden erfordert. Zu Beginn sollte man mit einem sterilen Skalpell einen sagittalen Mittellinienschnitt entlang der Schädeloberfläche machen, beginnend zwischen den Augen und sich kaudal über 8 bis 10 Millimeter erstrecken.

Dann verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die Haut seitlich vom Mittellinienschnitt zurückzuziehen. Stellen Sie sicher, dass sowohl Bregma als auch Lambda sichtbar sind, und verlängern Sie den Schnitt bei Bedarf weiter. Als Nächstes wird mit einem sterilen Skalpell das Periost eingeschnitten und das Gewebe seitlich mit einer Pinzette zurückgezogen.

Tragen Sie 1 % bis 3 % Wasserstoffperoxid mit einem sterilen Applikator mit Baumwollspitze auf, um die Schädeloberfläche zu reinigen. Verwenden Sie nun eine 0,3 bis 1,0 Milliliter Insulinspritze, um 20 bis 40 Mikroliter selbstgravierenden Zahnkleber gleichmäßig auf die Schädeloberfläche aufzutragen. Dann wird es einem Zahnaushärtungslicht ausgesetzt, um den Kleber zu ätzen.

Nach der Aushärtung entfernen Sie überschüssigen Kleber mit sterilen Baumwoll-Applikatoren und Kochsalzlösung. Positioniere den Bohrer auf die cOFM-Führungskoordinate. Stellen Sie den Bohrer auf 15.000 Umdrehungen pro Minute ein und bohren Sie ein Gratloch mit dem DV-Mikromanipulator-Dial.

Überwachen Sie häufig die Schädeldicke während des Bohrens und spülen Sie sie mit physiologischem Kochsalzlösungswasser, um Ablagerungen zu entfernen und Hitze zu reduzieren. Wiederholen Sie das Bohrverfahren an jeder Ankerschraubenkoordinate. Setzen Sie nun Ankerschrauben mit steriler Pinzette und einem sterilen Schraubendreher ein, bis sie ein bis zwei Gewindelängen tief eingesetzt werden.

Dann montiert man die cOFM-Führung und die Dummy-Baugruppe in den Führungshalter und befestigt den Halter am stereotaktischen Rahmen. Positioniere die Führungsspitze über dem Gratloch und senke sie langsam auf die vorgegebene Tiefe mit 1 Millimeter pro Minute. Tragen Sie das Zementmittel in dünnen, gleichmäßigen Schichten auf den Schädel auf, die Bereiche unter und um die cOFM-Führung und Schrauben bedecken.

Verwenden Sie eine Zahnaushärtungslampe, um jede Schicht zu verhärten, bevor Sie die nächste auftragen. Stellen Sie sicher, dass der Zement den gesamten Bereich zwischen den Komponenten bedeckt und dabei den Verriegelungskeil vermeidet. Lösen Sie den Führungshalter vom cOFM-Führer und heben Sie ihn langsam mit dem DV-Knopf des Mikromanipulators an.

Mit einer Pinzette entferne ich den Verriegelkeil von der cOFM-Führung und der Dummy-Baugruppe. Heben Sie vorsichtig die Puppe aus der Führung. Verwenden Sie die ML- und AP-Mikromanipulator-Knöpfe, um die Spritzen-Infusions-Einführungseinheit über der cOFM-Führung auszurichten.

Senken Sie den Infusionseinsatz mit dem DV-Knopf ab und sichern Sie ihn, indem Sie den Verriegelungskeil mit einer Zange fest wieder einsetzen. Jetzt injizieren Sie 3 Mikroliter Zellsuspension aus der Spritze mit 1 Mikroliter pro Minute. Überwachen Sie den Bereich rund um den cOFM-Leit, um sicherzustellen, dass kein Zellsuspensions-Efflux aus der Baugruppe entsteht.

Verwenden Sie eine Pinzette, um den Verriegelungskeil von der Führung und dem Infusionseinsatz zu entfernen. Dann heben Sie vorsichtig den Infusionseinsatz mit dem DV-Verstellknopf aus der Führung. Füllen Sie die Push-and-Pull-Röhrenleitungen mit künstlicher Rückenmarksflüssigkeit mit gasdichten Glasspritzen vor.

Installieren Sie den peristaltischen Abschnitt des Rohrs in den Pumpenkopf der Mikroperfusionspumpe. Verbinden Sie den Perfusatbeutel mit einem Luer-Lock-Anschluss an das Push-Rohr. Anschließend verbindet man den Probeeinsatz mit dem Schlauch mit Flanschverbindern.

Befestigen Sie die längere Einlasswelle am Ausgangsende des Schubrohrs und die kürzere Auslasswelle am Eingangsende des Zugrohrs. Setzen Sie den verbundenen Probeeinsatz in ein steriles Mikrozentrifugenrohr mit 750 Mikrolitern künstlicher Liquenmarksflüssigkeit. Verbinden Sie die Fraktionssammelnadel mit der Ausgangsleitung des Ziehrohrs über einen geflanschten Rohranschluss.

Führen Sie dann eine 20-minütige Spülung mit 10 Mikrolitern pro Minute durch, um Luftblasen zu beseitigen. Als Nächstes wird die Zugleitung vorgefüllt mit künstlicher Rückenmarksflüssigkeit mit gasdichten Spritzen. Setzen Sie den peristaltischen Schlauch wieder in den Pumpenkopf der Mikroperfusionspumpe ein.

Verbinden Sie den Probeneinsatz erneut mit Flanschrohranschlüssen. Schließen Sie den Einlass am Ausgangsende des Zugrohrs an und den Auslass am Eingangsende des Zugrohrs. Setzen Sie den Einsatz in ein steriles Mikrozentrifugenrohr mit 750 Mikrolitern künstlicher Liquenmarksflüssigkeit.

Führen Sie eine weitere 20-minütige Spülung des Tubing-Systems mit 10 Mikrolitern pro Minute durch, um eventuelle Restluftblasen zu entfernen. Legen Sie ein betäubtes Tier in eine passende Jacke. Ziehen Sie die Vordergliedmaßen vollständig durch die Armlöcher und schließen Sie die Jacke sicher am Rücken des Tieres.

Verwenden Sie eine Pinzette, um den Verriegelungskeil von der Führung und der Dummy-Baugruppe zu entfernen. Dann heben Sie vorsichtig den Dummy-Einsatz aus der Führung. Setzen Sie den Probeeinsatz vorsichtig in die Führung ein und setzen Sie den Verriegelungskeil wieder ein.

Nehmen Sie das Tier aus der Narkose und legen Sie es in das rotierende Käfigsystem. Befestige die Käfigleine an der Tierjacke und aktiviere das rotierende Käfigsystem. Nach der cOFM-Probenahme deaktivieren Sie das rotierende Käfigsystem und lösen Sie das Käfigband vom Tierjacken.

Jetzt verwenden Sie eine Pinzette, um den Verriegelungskeil von der Führung und dem Probeeinsatz zu entfernen. Heben Sie vorsichtig den Probeeinsatz aus der Führung, setzen Sie den Dummy-Einsatz vorsichtig zurück in die Führung und setzen Sie den Verriegelungskeil wieder ein. Lösen Sie die Verschlüsse auf der Rückseite der Tierjacke und entfernen Sie die Jacke vorsichtig vom Tier.

Biolumineszente Bildgebung bestätigte das Vorhandensein von Tumoren bei Tieren mit cOFM-geleiteter vermittelter Tumorzellentransplantation. Die proteomische Hauptkomponentenanalyse der cOFM-beprobten interstitiellen Flüssigkeit zeigte eine deutliche Trennung zwischen temozolomidbehandelten und dimethylsulfoxid-behandelten Tiergruppen. Globale metabolomische Signalverteilungen überlappten nahezu perfekt zwischen Temozolomid- und Dimethylsulfoxidproben.

Trotz Signalüberschneidungen zeigte die metabolomische Vulkananalyse eine deutliche, durch Temozolomid getriebene Verschiebung. Quantitative Vergleiche metabolomischer Werte derselben Tiere zeigten, dass rezirkulierte Konfigurationen die Analytenkonzentrationen verbesserten, während die relativen Metabolitenanteile erhalten blieben. Die relative Nährstoffverfügbarkeit im Mikroumfeld des Gehirntumors ist weiterhin schlecht verstanden.

Dieses Protokoll wird verwendet, um diese Lücke zu schließen. Die Charakterisierung der Nährstoffverfügbarkeit und -signalisierung im Tumormikroumfeld kann Mechanismen des Gliomprogressions und der adaptiven Resistenz gegen die Behandlung aufklären.