Schnelle Optimierung eines lichtinduzierbaren Systems zur Kontrolle der Genexpression von Säugetieren

Dieses Projekt zielt darauf ab, eine Hochdurchsatzmethode zur Optimierung und Charakterisierung eines multikomponenten optogenetischen Werkzeugs namens LACE zur Genexpression von Säugetieren zu entwickeln. Zu Beginn stellen Sie eine Zellkulturflasche mit HEK 293 T-Zellen in einen Biosicherheitsschrank. Verwenden Sie eine serologische Pipette, um das verbrauchte Medium zu aspirieren.

Pipettieren Sie 10 Milliliter DPBS in eine Ecke des Kolbes und wirbeln Sie vorsichtig, um die Zellen zu waschen. Dann wird die Waschlösung abgesaugt und sowohl das DPBS als auch der Aspirator in den Abfallbehälter entsorgt. Gib jetzt 1,5 Milliliter 0,05 % Trypsin-EDTA in die Flasche, um die Oberfläche zu bedecken, und inkubiere sie.

Klopfen Sie sanft auf die Flasche, um die Zellen von der Oberfläche zu lösen. Als Nächstes pipettieren Sie 8,5 Milliliter frisches DMEM in die Flasche. Aspirieren Sie die Lösung nach oben und unten, bis keine Aggregate mehr sichtbar sind, um die Zellen wieder zu suspendieren.

Dann werden neun Milliliter der Zellsuspension in ein 15-Milliliter-konisches Rohr übertragen. Gib neun Milliliter frisches DMEM in die Flasche. Inkubieren Sie die Suspension bis zur Zusammenfluss unter 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius.

Mische nun 10 Mikroliter der suspendierten Zellen mit 10 Mikrolitern Trypsin-Farbstoff im Verhältnis eins zu eins, um die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer zu berechnen. Säen Sie etwa 35.000 Zellen in 100 Mikrolitern in jede Welle einer Hochleistungsplatte mit Nummer 1,5, schwarz, 96 Bohrungen, Glasboden. Stellen Sie die Platte für 24 Stunden in einen Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid eingestellt ist.

Für die Transfektion werden zunächst 11 Mikroliter warmes, serumfreies DMEM in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr für einen Brunnen und 10 % Überschuss gegeben. Bereite verschiedene Plasmid-Massenverhältnisse des CRY2-verstärkten grünen fluoreszierenden Proteins zu CIBN-Guide-RNA/Aliquot 110 Nanogramm pro Bohrloch der vorbereiteten Lösungen in jede Röhre vor, die das serumfreie Medium aliquots enthält. Dann pipettieren Sie für jede Bohrmulde weitere 11 Mikroliter serumfreies DMEM in separate Röhren zur Verdünnung des Transfektionsreagens.

Fügen Sie das verdünnte Transfektionsreagenz der DNA-Medienmischung hinzu und inkubieren Sie die Transfektionskomplexe. Anschließend pipettieren Sie 20 Mikroliter des vorbereiteten Transfektionskomplexes zu jedem Brunnen der 96-Well-Platte, die die HEK 293 T-Zellen enthält. Wickle die 96-Well-Platte in Alufolie und setze sie in einen Inkubator mit 37 Grad Celsius bei 5 % Kohlendioxid für 24 Stunden.

Um den Aktivierungsprozess zu beginnen, modifizieren Sie den Mikrocontroller-Eingabecode, um die gewünschten Wells mit den angegebenen Skriptzeilen zu beleuchten. Stellen Sie die Lichtdiodenintensität auf 9,27 Milliwatt pro Quadratzentimeter anhand der angegebenen Codelinien ein. Stellen Sie die Pulslänge auf eine Sekunde ein und stellen Sie dann die Pulsfrequenz auf 0,067 Hertz, was allen 15 Sekunden entspricht.

Besprühe den 3D-gedruckten Deckel des OptoPlate mit 70%-Ethanol. Lass es dann in einem Biosicherheitsschrank trocknen. Jetzt mach eine rote Lichtlampe im Dunkelraum an.

Setze die 96-Well-Platte in den Biosicherheitsschrank. Ersetze den Tellerdeckel durch den getrockneten, 3D-gedruckten Deckel. Setzen Sie die 96-Well-Platte auf das LED-Array, um das Aktivierungsgerät zusammenzubauen.

Stellen Sie das vollständig montierte LED-Array-Gerät in einen Inkubator ein, der für 24 Stunden auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid eingestellt ist. Schließen Sie den Mikrocontroller, die Leuchtdiode und die Lüfteranschlüsse an eine Stromquelle an. Um Durchflusszytometrie durchzuführen, führen Sie das Systemstartprogramm auf der Website-Expertensoftware aus.

Laden Sie zwei Milliliter deionisiertes Wasser in den Probenladeer. Führen Sie die Qualitätskontrolle mit den bereitgestellten Qualitätskontrollperlen durch. Richten Sie die Probenbrunnen für die Erfassung ein und spezifizieren Sie sie an.

Erstellen Sie die Diagramme und Tabellen für Seitenstreuung versus Vorwärtsstreuung, Seitenstreuhöhe versus Seitenstreufläche, Seitenstreufläche versus FITC-A sowie die FITC-A-Statistiktabelle. Jetzt schnappen Sie die V-untere 960-Well-Platte in den Plattenlader des Zytometers. Wähle einen nicht transfektierten Brunnen aus und klicke auf Initialisieren, gefolgt von Ausführen.

Passen Sie die Seitenstreuung und FITC-Spannungen an, um die interessierende Population im SSC-A- versus FSC-A-Diagramm zu zentrieren. Klicken Sie auf Run und wählen Sie dann ein CMV-verstärktes grünes fluoreszierendes Protein aus, das gut transfectiert ist. Stellen Sie die FITC-Spannung so an, dass sowohl autofluoreszierende als auch fluoreszierende Zellen im SSC-A- versus FITC-A-Diagramm enthalten sind.

Erstelle ein Polygon, um die gesunde Zellpopulation zu sperren. Ein zweites Polygon, das für die Doublet-Diskriminierung im SSC-H versus SSC-A-Diagramm gesperrt werden kann. Erstellen Sie ein Polygongatter, um fluoreszierende Zellen von nicht-fluoreszierenden zu unterscheiden, wobei das Tor der nicht transfizierten Zellen als Referenz dient.

Automatische Aufzeichnung von Proben mit 60 Mikrolitern pro Minute, bis entweder 200 Sekunden vergangen sind oder 10.000 Ereignisse erreicht wurden. Exportiere dann die mittleren FITC-Werte als CSV-Datei und analysiere die Daten. Reinigen Sie das Durchflusszytometer, indem Sie die Option Tagesreinigung wählen.

Die Fluoreszenzbildgebung zeigte, dass bei einem Massenverhältnis von eins zu neun die Aktivierung von blauem Licht eine niedrigere maximale eGFP-Expression induzierte im Vergleich zum Fünf-zu-Fünf-Verhältnis, was ebenfalls eine erhöhte Leckigkeit im dunklen Zustand aufwies. Die Flusszytometrie zeigte, dass über 95 % der gegierten Ereignisse in P1 über alle Erkrankungen hinweg Singlets waren. Und untransfektierte Zellen hatten weniger als 0,1 % eGFP-positive Population.

Die CMV-eGFP-Kontrolle hatte etwa 99 % eGFP-positive Zellen, während 2pLACE-transfektierte Zellen etwa 57 % aufwiesen. Es bestätigte außerdem die erfolgreiche Transfektion von 2pLACE und die Aktivierung der eGFP-Expression unter blauem Licht mit geringerer Expression als CMVeGFP. Eine dreifache Erhöhung der eGFP-Expression wurde in lichtaktivierten 2pLACE-Proben im Vergleich zu dunklen Bedingungen beobachtet.

Der Prozentsatz der eGFP-positiven Zellen in 2pLACE-Transfektierten Proben betrug etwa 60 %. Das Drei-zu-Sieben-Massenverhältnis führte zu der höchsten mittleren Fluoreszenzintensität und Dynamikumfang. Dieses Protokoll ermöglicht die Hochdurchsatzbewertung von Proben und technische Replikation, wobei die OptoPlate verwendet wird, um unterschiedliche Lichtbedingungen und Pulsfrequenzen zu programmieren.