Name: Verfeinerung von OnePot PURE und Roh-Ribosomen-Produktion für reproduzierbare zellfreie Proteinsynthese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-22T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Erfahren Sie die optimierte OnePOT PURE-Methode für reproduzierbare zellfreie Proteinsynthese. Standardisierte Wachstumsbedingungen und Glycerolkonzentration minimieren Batch-Variationen und verbessern die Erträge.

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<ol><li>Laohakunakorn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Front Bioeng Biotechnol. 8 (213), 1-26 (2020).</li>
<li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+gene+expression%3A+an+expanded+repertoire+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nat Rev Genet. 21 (3), 151-170 (2019).</li>
<li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat Biotechnol. 19 (8), 751-755 (2001).</li>
<li>Shimizu, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pure+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Pure technology.</a> Methods Mol Biol. 607, 11-21 (2010).</li>
<li>Wang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+in+vivo+His-tagging+of+enzyme+pathways+for+in+vitro+single-pot+multienzyme+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis.</a> ACS Synth Biol. 1 (2), 43-52 (2012).</li>
<li>Shepherd, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+design+and+synthesis+of+a+30-cistron+translation-factor+module%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">De novo design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module.</a> Nucleic Acids Res. 45 (18), 10895-10905 (2017).</li>
<li>Villarreal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+microbial+consortia+enable+rapid+assembly+of+pure+translation+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery.</a> Nat Chem Biol. 14 (1), 29-35 (2018).</li>
<li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+robust%2C+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synth Biol. 8 (2), 455-462 (2019).</li>
<li>Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OnePot+PURE+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">OnePot PURE cell-free system.</a> J Vis Exp. (172), e62625(2021).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+protein+expression+in+the+One-Pot+PURE+system%3A+insights+into+reaction+composition+and+translation+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimizing protein expression in the One-Pot PURE system: insights into reaction composition and translation efficiency.</a> ACS Synth Biol. 14 (5), 1496-1508 (2025).</li>
<li>Yadav, S., Perkins, A. J. P., Liyanagedera, S. B. W., Bougas, A., Laohakunakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+regeneration+from+pyruvate+in+the+PURE+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">ATP regeneration from pyruvate in the PURE system.</a> ACS Synth Biol. 14 (1), 247-256 (2025).</li>
<li>Doerr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+cell-free+RNA+and+protein+synthesis+with+minimal+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Modelling cell-free RNA and protein synthesis with minimal systems.</a> Phys Biol. 16 (2), 025001(2019).</li>
<li>Christodoulou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heteronuclear+NMR+investigations+of+dynamic+regions+of+intact+Escherichia+coli+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Heteronuclear NMR investigations of dynamic regions of intact Escherichia coli ribosomes.</a> PNAS. 101 (30), 10949-10954 (2004).</li>
<li>Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+all-E+coli+TXTL+toolbox+3.0%3A+new+capabilities+of+a+cell-free+synthetic+biology+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">The all-E coli TXTL toolbox 3.0: new capabilities of a cell-free synthetic biology platform.</a> Synth Biol. 6 (1), 1-8 (2021).</li>
<li>Romantseva, E., Alperovich, N., Ross, D., Lund, S. P., Strychalski, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+DNA+template+preparation+on+variability+in+cell-free+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Effects of DNA template preparation on variability in cell-free protein production.</a> Synth Biol. 7 (1), 1-17 (2022).</li>
<li>Thornton, E. L., Boyle, J. T., Laohakunakorn, N., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+as+a+method+to+rapidly+screen+machine+learning-generated+protease+variants%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis as a method to rapidly screen machine learning-generated protease variants.</a> ACS Synth Biol. 14 (5), 1710-1718 (2025).</li>
<li>Laohakunakorn, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLaohakunakorn%2C+N+%22Cell-free+3PGA+energy+solution%22">Cell-free 3PGA energy solution</a>. , Protocols.io. (2020).</li>
<li>Kalpaxis, D. L., Theocharis, D. A., Coutsogeorgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+studies+on+ribosomal+peptidyltransferase%3A+the+behaviour+of+the+inhibitor+blasticidin+S%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Kinetic studies on ribosomal peptidyltransferase: the behaviour of the inhibitor blasticidin S.</a> Eur J Biochem. 154 (2), 267-271 (1986).</li>
<li>Blaha, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+functional+ribosomal+complexes+and+effect+of+buffer+conditions+on+tRNA+positions+observed+by+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of functional ribosomal complexes and effect of buffer conditions on tRNA positions observed by cryoelectron microscopy.</a> Methods Enzymol. 317, 292-309 (2000).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2x YT</td><td>Sigma</td><td>Y2377-250G</td><td></td></tr><tr><td>Aminosäuren</td><td>Sigma</td><td>LAA21-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumacetat RNAse-frei</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>AM9070G</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid</td><td>Sigma</td><td>09718-1KG</td><td></td></tr><tr><td>ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A8351-5G</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) kompetente E. coli</td><td>SCHNABEL</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>Flasche, Zentrifuge (Nalgene)</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>3120-9500</td><td>Polypropylen-Copolymer-Flasche</td></tr><tr><td>Flasche, Glas (Duran) 250 mL, 500 mL, 1 L, 2 L</td><td>VWR</td><td>215-1593, 215-1594, 215-1595, 215-1596</td><td></td></tr><tr><td>Bradford-Test, Quick Start 1x Farbstoffreagenz</td><td>Bio-Rad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>Heraeus Megafuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge, Mikro</td><td>Eppendorf</td><td>5424R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chromatographiesäule</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Kreatinphosphat</td><td>Sigma</td><td>27920</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetten, semi-mikro 1,6 mL</td><td>Fisherbrand</td><td>FB55147</td><td></td></tr><tr><td>Di-Natriumwasserstoff-Orthophophosphatdihydrat</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/4450/60</td><td></td></tr><tr><td>Dialysekassette, Slide-A-Lyzer G3, 2 kDa MWCO, 15 mL</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>A52962</td><td></td></tr><tr><td>Dikaliumwasserstoff-Orthophosphat wasserfrei</td><td>Fisher Chemical</td><td>P/5240/60</td><td></td></tr><tr><td>DTT No-Weighing</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>A39255</td><td></td></tr><tr><td>Filtereinheit, zentrifugale 3kDa MWCO Amicon Ultra 15</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Flasche, 500 mL</td><td>VWR</td><td>214-1133</td><td></td></tr><tr><td>Flasche, mit Baffle 2,5 L&nbspoon;</td><td>Tunair</td><td>SS-5013</td><td></td></tr><tr><td>Folinsäure</td><td>Sigma</td><td>F7878-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hcl</td><td>Fisherbrand</td><td>H/1200/PB17</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-Puffer, 1-M-Lösung pH 7,3</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>BP299</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma</td><td>I2399-500G</td><td></td></tr><tr><td>Brutkasten</td><td>Eppendorf</td><td>New Brunswick Innova&reg; 42</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>R0392</td><td></td></tr><tr><td>KOH-Pellets</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>P1767-500G</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutaminsäure-Hemimagnesiumsalz-Tetrahydrat</td><td>Sigma</td><td>49605-250G</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutaminsäure-Monokaliumsalz-Monohydrat</td><td>Sigma</td><td>49601-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumacetattetrahydrat</td><td>Sigma</td><td>M5661-50G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Fluka</td><td>63020-1L</td><td></td></tr><tr><td>Magnetisches Rührsystem</td><td>Stuart</td><td>US152</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>NEBExpress Ni-NTA Mag-Perlen</td><td>SCHNABEL</td><td>S1423S</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7543-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Pipette, Mehrkanal-Eppendorf Research Plus 30-300 & Mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3125000052</td><td></td></tr><tr><td>Plattenklebedichtung für Plattenleser</td><td>ExcelScientific</td><td>STR-SEAL-PLT (Steril)</td><td></td></tr><tr><td>Plattenatmungsdichtung</td><td>Starlab</td><td>E2796-3005</td><td></td></tr><tr><td>Plattenfoliendichtung</td><td>ExcelScientific</td><td>FCS-25</td><td></td></tr><tr><td>Kennzeichenleser</td><td>BioTek</td><td>Synergie H1</td><td></td></tr><tr><td>Plattenschüttler</td><td>Allsheng</td><td>MBI100-4A</td><td></td></tr><tr><td>Plattenzeichen, 384 Brunnen</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>242764</td><td></td></tr><tr><td>Platte, 96 tiefe Bohrung 1 mL</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>736-0601</td><td></td></tr><tr><td>Platten, 96 tiefe Brunnen 2 ml</td><td>Sarstedt</td><td>82.1972.002</td><td></td></tr><tr><td>Platte 96 Brunnen PCR</td><td>Sarstedt</td><td>721,978</td><td></td></tr><tr><td>Platten, optisches 96-Bohrloch</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>10057581</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma</td><td>P5405-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogen-Orthophosphat</td><td>Fisher Chemical</td><td>P/4800/53</td><td></td></tr><tr><td>Proteinextraktionsreagenz (BugBuster)</td><td>EMD Millipore</td><td>70584-3</td><td></td></tr><tr><td>Proteinreinigungsharz (cOmplete)</td><td>Roche</td><td>5893682001</td><td></td></tr><tr><td>Rotisserie-Shaker</td><td>Starlab</td><td>RM-Multi 1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/3105/70</td><td></td></tr><tr><td>Sonikationssonde, FisherBrand 15-50 mL</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>12931181</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Jenway</td><td>Genova Plus</td><td></td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma</td><td>S2626-1G</td><td></td></tr><tr><td>TCEP 0,5 M</td><td>Supelco</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Fisher NTP, Tris gepuffert</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>R1481</td><td></td></tr><tr><td>tRNA von E. coli MRE600</td><td>Roche</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Formedium</td><td>TRP02</td><td></td></tr><tr><td>Röhre, 0,2 mL PCR-Qualität</td><td>Sarstedt</td><td>72,737,002</td><td></td></tr><tr><td>Röhre, Bioux Sterilin 7 mL Polystyrol</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>129A</td><td></td></tr><tr><td>Röhre, konisch (Falcon) 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Röhre, konisch (Falcon) 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Röhre, Mikrozentrifuge (Eppendorf) 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Röhre, Mikrozentrifuge (Eppendorf) 2 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.695.700</td><td></td></tr><tr><td>Röhre, S100-Zentrifugation&nbsp;</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355619</td><td></td></tr><tr><td>Röhren, S30-Zentrifugation&nbsp;</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>3118-0050</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Optima XPN-100</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifugenrotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>70Ti Rotor mit festem Winkel</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-freies destilliertes Wasser</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>10977049</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>VWR</td><td>444-2791</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Oxoid</td><td>LP0021T</td><td></td></tr></tbody></table>

verfeinerung von onepot pure und roh-ribosomen-produktion für reproduzierbare zellfreie proteinsynthese

Refinement of OnePot PURE and Crude Ribosome Production for Reproducible Cell-free Protein Synthesis

Verfeinerung von OnePot PURE und Roh-Ribosomen-Produktion für reproduzierbare zellfreie Proteinsynthese

Recent advances have enabled the Protein synthesis Using Recombinant Elements (PURE) cell-free system to be produced in individual laboratories ...

Wir verfeinerten das OnePOT PURE-System und die grobe Ribosom-Präparation, um die Reproduzierbarkeit und Zugänglichkeit zu verbessern, sodass mehr Labore robuste, zellfreie Systeme für die Forschung in der synthetischen Biologie bauen und beheben konnten. Experimentelle Herausforderungen umfassen Batch-zu-Charge-Variabilität, Instabilität von Expressionsvektoren und langsam wachsende Stämme, die alle die Reproduzierbarkeit und eine konstante Leistung bei der Vorbereitung interner PURE-Systeme behindern. Wir stellten fest, dass eine sorgfältige Kontrolle von Stammwachstum, Impfung und Glycerolkonzentration die Reproduzierbarkeit und Erträge in OnePOT PURE- und Ribosompräparaten bei Nutzern und biologischen Replikaten signifikant verbessert.Wir gehen auf das Fehlen eines reproduzierbaren, zugänglichen Protokolls zur Hausherstellung von PURE und Ribosomen ein und helfen Laboren, technische Hürden zu überwinden und Selbstresistenz für die Forschung in der synthetischen Biologie zu übernehmen. Unser Protokoll verbessert die Reproduzierbarkeit und Flexibilität, indem es die Wachstumsbedingungen und den Glycerolverbrauch standardisiert und die Ribosomenzubereitung nur durch Ultrazentrifugation vereinfacht, wodurch komplexere oder kostspieligere Reinigungsmethoden vermieden werden. Zu Beginn tauen Sie die gefrorenen BL21-Zellpellets auf Eis auf und geben Sie 50 Milliliter Ribosom-Puffer A in ein sauberes konisches Rohr.Mit einer Pipette nehmen Sie 100 Mikroliter Ribosomenpuffer A aus dem konischen Rohr und geben Sie es in ein No-Weight-DTT-Fläschchen. Aspirieren Sie vorsichtig, bis das DTT-Pellet vollständig gelöst ist, um eine 0,5-molare DTT-Stocklösung zu erzeugen. Dann pipettiert man 100 Mikroliter der 0,5-molaren DTT-Stocklösung zurück in das 50-Milliliter-konische Rohr und legt das Rohr auf Eis.Mit einem Wirbelmischer wird jedes aufgetaute Zellpellet in Ribosomenpuffer A mit DTT in einem Verhältnis von zwei Millilitern pro Gramm Zellpellet wieder suspendiert. Kombinieren Sie die resuspendierten Proben zu einem konischen Röhrchen und prüfen Sie, ob das gesamte Schlammvolumen 10 Milliliter beträgt. Teilen Sie nun den 10-Milliliter-Schlamm gleichmäßig in zwei separate Fünf-Milliliter-Proben in beschrifteten konischen Röhren.Sichern Sie die konischen Schläuche in einem Stand und lysieren Sie die Zellen mit einer gekühlten Sonikationssonde in einem Eiswasserbad. Stellen Sie den Sonicator auf 30 % Amplitude mit einem Zyklus von 20 Sekunden ein- und 20 Sekunden aus, insgesamt 10 Zyklen. Nach der Sonikation füllen Sie jede lysierte Probe mit Ribosome Buffer A mit DTT auf 25 Milliliter auf 25 Milliliter auf und Kurzzeit, um zu mischen.Übertragen Sie die 25-Milliliter-Lysationsproben in zwei vorgekühlte S30-Zentrifugationsröhren. Setzen Sie die Röhren in eine Zentrifuge und drehen Sie sie eine Stunde lang bei 30.000 G bei vier Grad Celsius. Anschließend werden bis zu 75 % des pelletfreien Supernatants aus jedem S30-Rohr sorgfältig gewonnen, um eine Membrankontamination zu verhindern.Übertragen Sie das wiedergewonnene Supernatant in zwei saubere, vorgekühlte S30-Röhren. Nach einer erneuten 30-minütigen Zentrifugation der Röhren gewinnen Sie bis zu 75 % des pelletfreien Supernators zurück und geben Sie es in zwei saubere 50-Milliliter-komische Röhren um. Gib jedem Rohr Ribosomenpuffer A mit DTT hinzu, bis das Volumen 25 Milliliter erreicht.Übertragen Sie die 25-Milliliter-Proben in zwei saubere, vorgekühlte S100-Ultrazentrifugenröhren. Laden Sie die Röhren in die Ultrazentrifuge und drehen Sie 100.000 G für vier Stunden bei vier Grad Celsius. Nach der abschließenden S100-Zentrifugation entsorgen Sie das Überstandsmittel.Verwenden Sie eine Pipette, um eventuelle Pufferreste zu entfernen, während Sie schnell arbeiten und so verhindern, dass das Pellet trocknet. Dann geben Sie 400 Mikroliter eiskaltes Ribosomenpuffer C mit DTT in jedes S100-Rohr mit dem Ribosompellet. Inkubieren Sie die Röhren über Nacht auf Eis in einem kalten Raum, damit das Ribosom-Pellet im Puffer einweichen kann.Am folgenden Tag verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette und sanftes Wirbeln, um das klare Halo-Ribosom-Pellet vollständig im Puffer wieder aufzuhängen. Achten Sie darauf, dass nur der klare Halo gelöst ist, und vermeiden Sie etwas, das gelbe unlösliche Pellet zu stören. Anschließend wird die resuspendierte Ribosomenlösung in zwei sterile Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhren übertragen.Zentrifugieren Sie die Röhren bei 20.000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um unlösliches Material zu entfernen. Übertragen Sie das pelletfreie Supernatant vorsichtig in ein sauberes Mikrozentrifugenrohr und legen Sie es auf Eis. Die notwendigen Aliquoten von PURE-Systemproteinen, Ribosomen, Energielösung und Matrixlösung auf Eis auftauen.Stellen Sie eine Mastermischung für dreifache Reaktionen zusammen, indem Sie Energielösung, PURE Proteine, Ribosomen, Matrixlösung und nukleasefreies Wasser in der angegebenen Reihenfolge hinzufügen. Stellen Sie eine Pipette auf 5,1 Mikroliter ein und saugen Sie die Hauptmischung fünf bis sechs Mal an, um sicherzustellen, dass die Lösung gut vermischt und homogen ist. Mit der auf 5,1 Mikroliter eingestellten Pipette gibt man die Hauptmischung in drei separate Öffnungen einer 384-Bohrloch-optischen Platte, wobei Blasen vermieden werden.Versiegeln Sie die 384-Well-Platte mit einer Klebeplatte. Alle vier von Nutzer 1 vorbereiteten PURE-Reaktionschargen zeigten eine konstante GFP-Fluoreszenzkinetik mit einem Spitzenwert von etwa zwei Stunden und waren vergleichbar mit dem GFP-Signal der unabhängig vorbereiteten Charge von Nutzer 2.1, während keine Fluoreszenz in der negativen Kontrolle ohne DNA beobachtet wurde. Zum Zeitpunkt der Zwei-Stunden-Zeit war die GFP-Fluoreszenz für alle vom Nutzer vorbereiteten PURE-Chargen ähnlich hoch, während die Kontrolle der Minus-DNA nahe dem Ausgangspunkt blieb.Bei Ribosompräparaten variierte die GFP-Produktion über die Zeit etwas stärker zwischen den Nutzern, wobei Nutzer 1.2 die höchste Aktivität zeigte, gefolgt von den Nutzern 2.1 und 3.1, während Nutzer 1.1 die niedrigste unter den aktiven Chargen aufwies. Nach 1,5 Stunden erzielte die Ribosom-Vorbereitung von Nutzer 1.2 die höchste GFP-Fluoreszenz, während Nutzer 2.1 und 3.1 ähnliche, aber etwas niedrigere Werte hatten. Nutzer 1.1 hatte den niedrigsten Wert unter den aktiven Proben, und die Minus-DNA-Kontrolle blieb nahezu null.Die Gesamtvariation zwischen den Nutzern 1,1 und 1,2 beträgt etwa 30 %: Die GFP-Produktion bei CFPS-Reaktionen nimmt schrittweise ab, wobei die Glycerolkonzentrationen über 0 % steigen, wobei 6 % die niedrigste Expression zeigen.

refinement-onepot-pure-crude-ribosome-production-for-reproducible

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Die Kontamination von Zubereitungen der eukaryotischen Ribosomen mit herkömmlichen Methoden durch Co-Reinigung Nukleasen und Proteasen gereinigt negativ auf die nachgelagerten biochemische und strukturelle Analysen. Eine schnelle und einfache chromatographische Reinigungsverfahren wird verwendet, um dieses Problem unter Verwendung von Hefe Ribosomen als Modellsystem zu lösen.

Chromatographische Reinigung von hoch aktiven Hefe Ribosomen

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die Kosten und die notwendige Ausrüstung für E. Colizu generieren-basierte Zellextrakte und in-vitro- Protein Synthesereaktionen innerhalb von 4 Tagen oder weniger zu implementieren. Um die flexiblen Charakter dieser Plattform für breite Anwendungen nutzen zu können, diskutieren wir Reaktionsbedingungen, die angepasst und optimiert werden können.

Escherichia coli-basierte zellfreie Proteinsynthese: Protokolle für eine robuste, flexible und zugängliche Plattform-Technologie

Dieses Protokoll beschreibt die Methode, Materialien, Ausrüstung und Schritte zur Bottom-up-Vorbereitung von RNA und Protein produzierenden synthetischen Zellen. Das innere wässrige Fach der synthetischen Zellen enthielt das in einer Lipid-Bilayer (d. h. stabile Liposomen) eingekapselte S30-Bakterienlysat, das mit einem Wasser-in-Öl-Emulsionstransferverfahren verkapselt war.

Herstellung von Proteinproduktion synthetischer Zellen mit zellfreien bakteriellen Extrakten, Liposomen und Emulsionstransfer

Wir präsentieren eine schnelle und kostengünstige Methode zur Herstellung des rekombinanten PURE zellfreien TX-TL-Systems mit Standard-Laborgeräten.

OnePot PURE Zellfreies System

Die Studie beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung großer (μg-mg) Mengen an DNA für Protein-Screening-Kampagnen aus synthetischen Genfragmenten ohne Klonen oder Verwendung lebender Zellen. Die minimale Schablone wird enzymatisch verdaut und zirkuliert und dann mit isothermer Rollkreisamplifikation amplifiziert. Zellfreie Expressionsreaktionen könnten mit dem ungemeinigten Produkt durchgeführt werden.

Schnelle, enzymatische Methoden zur Amplifikation minimaler, linearer Templates für das Protein-Prototyping mit zellfreien Systemen

Diese Arbeit beschreibt die Herstellung von Zellextrakt aus Escherichia coli (E. coli ) gefolgt von zellfreien Proteinsynthesereaktionen (CFPS) in weniger als 24 Stunden. Die Erläuterung des CFAI-Protokolls (Cell-Free Autoinduction) beschreibt Verbesserungen, die vorgenommen wurden, um die Aufsicht der Forscher zu reduzieren und die Mengen des erhaltenen Zellextrakts zu erhöhen.

Von der Zelle zur zellfreien Proteinsynthese innerhalb von 24 Stunden mit zellfreiem Autoinduktions-Workflow

Dieses Protokoll beschreibt das System der zellfreien Proteinsynthese (CFPS), das beim Aufbau synthetischer Zellen verwendet wird. Es skizziert Schlüsselphasen mit repräsentativen Ergebnissen in verschiedenen Mikrokompartimenten. Das Protokoll zielt darauf ab, Best Practices für verschiedene Labore in der synthetischen Zellgemeinschaft zu etablieren und den Fortschritt in der Entwicklung synthetischer Zellen voranzutreiben.

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Wir stellen die Synthese eines Split-Intein-vermittelten Protein-Hydrogel. Die Bausteine ​​dieser Hydrogel zwei Copolymeren, die jeweils eine Protein-Untereinheit eines trimeren Protein, das als Vernetzer und eine Hälfte eines getrennten Inteins dient enthält. Das Mischen der beiden Protein-Copolymere löst eine Intein Transspleißreaktion, wodurch ein Polypeptid Einheit, die Selbstorganisation zu einem Hydrogel. Dieses Hydrogel ist stark pH-und temperaturstabil mit organischen Lösungsmitteln...

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Erfahren Sie die optimierte OnePOT PURE-Methode für reproduzierbare zellfreie Proteinsynthese. Standardisierte Wachstumsbedingungen und Glycerolkonzentration minimieren Batch-Variationen und verbessern die Erträge.

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