Vor Ort einsetzbare, linsenfreie Bildgebungsplattform für die schnelle markierungsfreie Analyse der Aktivierung natürlicher Killerzellen
8. August 2025
Dieses Protokoll beschreibt eine markierungsfreie Methode zur schnellen Einzelzellanalyse der Anzahl und Aktivität von natürlichen Killerzellen (NK) unter Verwendung der linsenfreien Schattenbildgebungstechnologie. Diese Methode quantifiziert morphologische Veränderungen in einzelnen NK-Zellen durch computergestützte Analyse ihrer Beugungsmuster.
Unser Ziel ist es, die Immunfunktion schnell zu bewerten, indem wir die Aktivierung von NK-Zellen in Echtzeit quantifizieren, wobei markierungs- und linsenfreie Bildgebung verwendet wird, um das Immunmonitoring zu verbessern. Wir haben gezeigt, dass der angeborene Immunitätsindex (I3) zuverlässig zwischen der NK-Zellaktivität von gesunden und immungeschwächten Spendern unterscheidet und stark mit den Zytokinen und Durchflusszytometrie-Markern korreliert. Die bestehenden NK-Zellassays erfordern Markierungen, sperrige Instrumente und lange Inkubationszeiten.
Unsere LSIT-Plattform füllt diese Lücke, indem sie eine schnelle, kostengünstige und markierungsfreie Profilierung mit einfacher Optoelektronik ermöglicht. Unsere markierungsfreie LSIT-Plattform differenziert die Aktivierung von NK-Zellen auf Einzelzellebene innerhalb von 30 Sekunden anhand von Schattenparametern, wodurch Färbungen und kostspielige Durchflusszytometrie überflüssig werden. Wir werden LSIT erweitern, um die Aktivierung von T- und B-Zellen zu überwachen und Deep-Learning-Algorithmen für die Hochdurchsatz-Klassifizierung verschiedener Immunzellzustände zu integrieren.
Nehmen Sie zunächst die Kits für die Isolierung von natürlichen Killerzellen (NK) aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie auf Raumtemperatur zwischen 15 und 28 Grad Celsius kommen. Bereiten Sie die erforderliche Ausrüstung vor, indem Sie einen Magnetabscheider und Pipetten mit sterilen Spitzen platzieren und einen Inkubator oder Heizblock auf 37 Grad Celsius einstellen. Geben Sie mit einer Pipette 0,5 Milliliter Vollblut in das grün verschlossene Reaktionsröhrchen, das den Antikörpercocktail enthält.
Mischen Sie den Inhalt vorsichtig, indem Sie das Röhrchen fünf- bis sechsmal auf und ab pipettieren. Inkubieren Sie dann das Röhrchen fünf Minuten lang. Übertragen Sie den gesamten Inhalt des Röhrchens mit grünem Deckel mit einer Pipette in das Separationsröhrchen mit rotem Deckel und mischen Sie es vorsichtig, indem Sie das Röhrchen fünf- bis sechsmal pipettieren.
Legen Sie das Röhrchen mit rotem Deckel auf den Magnetabscheider und inkubieren Sie es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Während Sie den Magneten an Ort und Stelle halten, übertragen Sie mit einer Pipette etwa 1,5 Milliliter des Überstands in das zweite Trennröhrchen mit violettem Deckel. Mischen Sie den Inhalt vorsichtig, indem Sie das Röhrchen fünf- bis sechsmal pipettieren.
Legen Sie nun das violette Röhrchen auf den Magnetabscheider und inkubieren Sie es 10 Minuten lang. Während der Magnet noch an Ort und Stelle ist, geben Sie mit einer Pipette etwa 1 Milliliter des Überstands in ein Auffangröhrchen mit grauem Deckel und mischen Sie den Inhalt vorsichtig durch Pipettieren des Röhrchens. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter der isolierten natürlichen Killerzellsuspension in das Fahrzeugröhrchen und weitere 100 Mikroliter in die Aktivierungsstimulator-Cocktail-Tube (ASC).
Mischen Sie den Inhalt beider Röhrchen vorsichtig mit einem Vortex-Mischer, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Röhrchen im Heizblock oder Inkubator bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Schalten Sie die LSIT-Plattform ein.
Starten Sie die LSIT-Erfassungssoftware. Melden Sie sich an, indem Sie Ihre ID und Ihr Passwort eingeben, und wählen Sie dann Kalibrieren, um den Kalibrierungsmodus zu starten. Drücken Sie die Öffnen-Taste auf dem Touchscreen oder verwenden Sie die physische Schiebetürtaste, um die Schublade zu öffnen.
Wenn sich die Schublade öffnet, entfernen Sie den Kalibrierschieber und bewahren Sie ihn auf. Klicken Sie nun auf Hintergrund festlegen, um die optische Intensität zu kalibrieren. Setzen Sie die Kalibrierschiene wieder in die Schublade ein und schließen Sie die Schublade.
Klicken Sie dann auf Kalibrierung starten, um den Vorgang abzuschließen. Nehmen Sie einen Assay-Objektträger aus der Tasche. Beschriften Sie es mit den Beispieldaten, bevor Sie es auf eine saubere, ebene Oberfläche legen.
Pipettieren Sie 10 Mikroliter der Fahrzeugprobe in die Kanäle A und B und pipettieren Sie dann 10 Mikroliter der ASC-stimulierten Probe in die Kanäle C und D. Drücken Sie nun auf Öffnen, um die Schublade auszuwerfen. Entfernen Sie den Kalibrierschieber und legen Sie ihn in eine Aufbewahrungsbox. Setzen Sie den vorbereiteten Assay-Objektträger in die Schublade ein und drücken Sie Schließen, um ihn zu sichern.
Gehen Sie zurück zum Hauptmenü und wählen Sie auf dem Hauptbildschirm NK Cell Activity and Test aus. Geben Sie die Proben-ID ein oder scannen Sie den Barcode, um das Probenprofil zu laden. Drücken Sie dann auf Aufnahme, um die Bildaufnahme zu starten.
Nachdem Sie das Bild aufgenommen haben, klicken Sie auf Analysieren, um mit der Verarbeitung zu beginnen. Überprüfen Sie den prozentualen Prozentsatz der NK-Zellaktivität und die auf dem Bildschirm angezeigte Zellzahl. Laden Sie die Ergebnisse auf ein USB-Laufwerk herunter oder drucken Sie sie über das Touchscreen-Menü aus.
Wählen Sie Zellzählung und Test auf der LSIT-Hauptschnittstelle aus. Laden Sie 10 Mikroliter der neuen Probe mit einer Pipette in einen frischen Assay-Objektträgerkanal. Setzen Sie die Schiene in die Schublade ein.
Schließen Sie die Schublade über den Touchscreen oder die Taste und geben Sie die Proben-ID auf dem System ein. Geben Sie ggf. den Verdünnungsfaktor auf dem Touchscreen ein und drücken Sie Zählen, um mit der Zellquantifizierung zu beginnen. Zeigen Sie die Ergebnisse als Zellen pro Mikroliter auf dem Bildschirm an.
Öffnen Sie nach der Analyse die Schublade, indem Sie die Öffnen-Taste drücken oder den physischen Schalter umschalten. Nehmen Sie die benutzte Schiene mit behandschuhten Händen aus der Schublade. Setzen Sie abschließend den Kalibrierschieber wieder in die Schublade ein, um den Sensor zu schützen, und schließen Sie die Schublade mit dem Touchscreen oder dem physischen Kippschalter.
Die LSIT-Plattform mit integrierter Software bewertete die NK-Zellaktivierung quantitativ, indem sie die CSP-Werte von aktivierten und unstimulierten Kontrollzellen verglich. Sie lieferte dem Immunitätsbericht eine zusammengefasste statistische Tabelle. Die ASC-Stimulation induzierte deutliche morphologische Veränderungen in NK-Zellen, einschließlich erhöhter Größe und zytoplasmatischer Komplexität, wie bei Hema 3-gefärbten Cytospins nach 30 Minuten und zwei Stunden zu sehen war.
Schattenbilder zeigten, dass ASC-stimulierte Zellen im Vergleich zu Vehikelkontrollen sichtbar komplexere Beugungsmuster aufwiesen, wobei die extrahierten Parameter auf einen erhöhten Peak-to-Peak-Abstand, eine zytoplasmatische Granularität und einen kombinierten Schattenparameter hindeuteten. Kombinierte Schattenparameterwerte ermöglichten eine klare Klassifizierung zwischen gesunden Spendern und Krebspatienten, mit minimaler Überlappung in der Einzelzellverteilung von aktivierten und nicht aktivierten NK-Zellen. Gesunde Spender zeigten nach ASC-Stimulation signifikant höhere Werte des angeborenen Immunitätsindex als Krebspatienten.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine markierungsfreie Methode zur schnellen Einzelzellanalyse der Anzahl und Aktivität natürlicher Killerzellen (NK-Zellen) mittels linsenfreier Schattenabbildungstechnologie. Diese Methode quantifiziert morphologische Veränderungen einzelner NK-Zellen durch computerbasierte Analyse ihrer Beugungsmuster.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Zellbiologie
- Bildgebende Technik
Hintergrund
- Aktuelle NK-Zell-Assays erfordern Markierungen und langwierige Verfahren.
- Bestehende Methoden beinhalten oft sperrige Geräte und lange Inkubationszeiten.
- Es besteht Bedarf an schnellen und kostengünstigen Verfahren zur Immunüberwachung.
- Bildgebung ohne Linsen kann die Beurteilung der Immunfunktion verbessern.
Zweck der Studie
- Schnelle Beurteilung der Immunfunktion durch Quantifizierung der NK-Zellaktivierung in Echtzeit.
- Bereitstellung einer markierungsfreien Methode zur Profilierung von NK-Zellen.
- Unterscheidung der NK-Zellaktivität zwischen gesunden Spendern und immungeschwächten Personen.
Verwendete Methoden
- Linsenfreie Schattenabbildungstechnologie (LSIT).
- Computerbasierte Analyse von Beugungsmustern.
- Echtzeitüberwachung der Aktivierung natürlicher Killerzellen.
- Integration von Deep-Learning-Algorithmen zur Klassifizierung von Immunzellzuständen.
Hauptergebnisse
- LSIT differenziert die NK-Zellaktivierung auf Einzelzell-Ebene innerhalb von 30 Sekunden.
- Der Index der angeborenen Immunität (I3) korreliert mit Zytokinen und Markern der Durchflusszytometrie.
- Die Eliminierung von Färbungen und der kostspieligen Durchflusszytometrie steigert die Effizienz.
- Möglichkeit, LSIT zur Überwachung der T- und B-Zellaktivierung zu erweitern.
Schlussfolgerungen
- Die LSIT-Plattform bietet eine schnelle, kostengünstige und markierungsfreie Profilierungsmethode.
- Diese Methode verbessert die Fähigkeiten zur Immunüberwachung.
- Zukünftige Anwendungen könnten die Hochdurchsatz-Klassifizierung verschiedener Immunzellzustände umfassen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Schnelle, markierungsfreie Quantifizierung der NK-Zellaktivierung mittels linsenfreier Schattenabbildungstechnologie (LSIT) behebt einen kritischen Engpass bei der Beurteilung der Immunfunktion für translations- und präklinische Forschung. Durch die Ermöglichung eines echtzeitfähigen, quantitativen Immunprofils ohne Notwendigkeit von Färbungen oder Durchflusszytometrie verbessert diese Plattform das Vorhersagevertrauen und die betriebliche Effizienz an entscheidenden Punkten der Entdeckung und Validierung. Der Ansatz unterstützt ein skalierbares Immunmonitoring und erleichtert risikoadjustierte Portfolioentscheidungen in immunologisch getriebener Forschung und Entwicklung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die quantitative Untersuchung der NK-Zell-Aktivierung als funktionellen immunologischen Endpunkt.
- Unterstützt die biologische Risikominimierung durch Unterscheidung zwischen Reaktionen gesunder Spender und immungeschwächter Spender.
- Liefert schnelle, markierungsfreie Daten zur Unterstützung der Zielvalidierung und mechanistischen Studien.
- Erleichtert die Vorhersage der Beteiligung immunologischer Signalwege mit höherer Zuverlässigkeit.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert standardisierte, reproduzierbare Einzelzell-Aktivierungsmetriken, die für die Assay-Entwicklung geeignet sind.
- Reduziert die Durchlaufzeit des Assays, indem Färbungen und komplexe Instrumente entfallen.
- Ermöglicht ein Hochdurchsatz-Profilen von Immunzellen für Verbindungsscreening-Workflows.
- Unterstützt die Skalierbarkeit und Wiederverwendbarkeit der Plattform über verschiedene Immunzelltypen hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt Metriken der Immunaktivierung mit funktionellen, krankheitsrelevanten Endpunkten.
- Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Immunüberwachung.
- Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung basierend auf quantitativen Immunfunktionen.
- Unterstützt die Entwicklung translationaler Biomarker für die angeborene Immunität.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die LSIT-Plattform ist in den Fortschritt von der Entdeckung bis zur präklinischen Phase integriert, indem sie schnelle, quantitative Daten zur Aktivierung von Immunzellen liefert, die sowohl die frühe Zielvalidierung als auch die anschließende translationsmedizinische Forschung unterstützen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt Hypothesentests und die Aufklärung von Signalwegen durch die Echtzeit-Messung der NK-Zellaktivierung.
- Screening: Bietet reproduzierbare, quantitative Ergebnisse zur Beurteilung der Eignung immunzellbasierter Assays.
- Analytik: Liefert statistische Kenngrößen wie den Index der angeborenen Immunität (I3) und den kombinierten Schattenparameter (CSP) für belastbare Vergleiche unter verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckungsforschung mit der präklinischen Validierung durch krankheitsrelevante Immunprofiling-Methoden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine skalierbare, markierungsfreie Plattform bereit, die an zusätzliche Immunzelltypen und funktionelle Assays angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei der Beurteilung der Immunfunktion.
- Operationaler Wert: Optimiert Arbeitsabläufe durch Standardisierung, schnelle Durchlaufzeiten und minimale Probenvorbereitung.
- Strategischer Wert: Ermöglicht schnellere Go/No-Go-Entscheidungen und verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem die Abhängigkeit von arbeitsintensiven Assays reduziert wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung immunologisch fokussierter Assets.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Isolierung von Immunzellen und der quantitativen Bildanalyse.
- Hängt von dem Zugang zu LSIT-Geräten und integrierter Analyse-Software ab.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über verschiedene Arbeitsgruppen hinweg bei der Probennahme und Datenauswertung.
- Anpassbar an verschiedene Typen von Immunzellen bei Optimierung des Protokolls.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit proprietärer Aktivatoren und plattformspezifischer Reagenzien.
