Kombinierte Rekombinase-Polymerase-Amplifikation CRISPR/Cas12a-Assay zum Nachweis von Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4

Wir sind an der schnellen und genauen Erkennung des Fusarium-Welkens des Bananenpathogens, bekannt als Foc TR4, interessiert. Die kombinierte Verwendung von Rekombinase-Polymerase-Verstärkung und CRISPR macht den Einsatz teurer Maschinen überflüssig und verbessert die Genauigkeit der Stromassays. Zu Beginn übertragen Sie 250 Milligramm jedes Stücks des symptomatischen Pseudostamms in einen separaten Extraktionsbeutel.

Geben Sie zwei Milliliter 0,5 molare Natriumhydroxid-Polyvinylpyrrolidon-Lösung in jeden Extraktionsbeutel mit Pflanzenmaterial. Mit einer manuellen Mühle, wie einem Stößel, mahlen Sie die infizierten Gefäße gründlich im Extraktionsbeutel. Dann geben Sie 195 Mikroliter 100 millimolare Tris-HCl-Puffer mit pH acht in ein 1,5-Milliliter-Rohr.

Pipettieren Sie fünf Mikroliter des Pflanzenextrakts aus dem Extraktbeutel in das 1,5-Milliliter-Rohr mit Tris-HCl-Puffer, um den Extrakt 40-fach zu verdünnen. Vortexen lassen Sie das Rohr 15 bis 30 Sekunden vortexen und lagern Sie es bei minus 20 Grad Celsius bis zur weiteren Benutzung. Mit dem RNA-Transkriptionskit werden die gegebenen Komponenten in ein 0,2-Milliliter-PCR-Rohr gegeben.

Inkubieren Sie das vorbereitete Rohr bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad oder einer PCR-Maschine für mindestens vier Stunden. Verwenden Sie nun ein Spektrophotometer, um die transkribierte RNA zu quantifizieren. Verdünnen Sie die RNA auf eine Konzentration von 250 Nanogramm pro Mikroliter in einem Endvolumen von 40 Mikrolitern mit nukleasefreiem Wasser.

Anschließend behandeln Sie die RNA-Probe mit DNase, die ich im RNA-Reinigungskit bereitgestellt habe, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Anschließend reinigen Sie die RNA-Probe mit dem RNA-Reinigungsset. Verwenden Sie ein NanoDrop-Gerät, um die Menge und Qualität der gereinigten CRISPR-RNA zu bestimmen.

Anschließend wird die RNA mit nukleasefreiem Wasser auf 100 Nanogramm pro Mikroliter verdünnt. Erhitze nun die CRISPR-RNA, die mit RNA-Ladefarbe gemischt ist, auf 70 Grad Celsius für 10 Minuten in einem Wasserbad und führe die Probe mit einem 1,5%igen Agarosegel aus, um die CRISPR-RNA durch Elektrophorese sichtbar zu machen. Bereiten Sie 20 Mikroliter Cas12a-Reaktionsgemisch in einem separaten 0,5-Milliliter-Rohr mit den angegebenen Komponenten vor.

Als Nächstes bereiten Sie 9,5 Mikroliter RPA-Reaktionsgemisch in einem separaten 0,5-Milliliter-Rohr mit den hier gezeigten Komponenten vor. Legen Sie einen Acht-Tube-Streifen in ein auf Eis gestelltes Röhrengestell und übertragen Sie die 20 Mikroliter Cas12a-Reaktionsmischung in die Basis jedes Rohrs im Streifen. Anschließend werden die 9,5 Mikroliter RPA-Reaktionsmischung in den Deckel jedes Röhrchens im Streifen übertragen.

Gib 0,5 Mikroliter 280 nanomolare Magnesiumacetat zur RPA-Mischung im Deckel und rühre durch Pipettieren auf und ab. Gib als Nächstes 0,5 Mikroliter deionisiertes Wasser zum Deckel des nicht-vorgeführten Steuerrohrs und schließe es vorsichtig, um eine Vermischung der RPA- und Cas12a-Reaktionsmischungen zu verhindern. Fügen Sie nun 0,5 Mikroliter Template-DNA zu den 10 Mikrolitern RPA-Reaktionsmischung mit Magnesiumacetat im Tube Strip-Deckel hinzu.

Mischen Sie den Inhalt, indem Sie auf und ab pipetten. Schließen Sie vorsichtig alle Rohrstreifendeckel, um sicherzustellen, dass sich die Reaktionsmischungen von RPA und Cas12a nicht vermischen. Anschließend schalten Sie das portable Fluorimeter ein und erstellen Sie ein Laufprofil für den RPA Cas12a-Test.

Öffnen Sie das gespeicherte Laufprofil und legen Sie den Röhrenstreifen in das Fluorimeter, damit er 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert. Nach 30 Minuten wird der Röhrenstreifen vom Fluorimeter entfernt, sechsmal umgedreht, um die RPA- und Cas12a-Reaktionen zu mischen, und den Streifen kurz in einer Mini-Zentrifuge für fünf Sekunden gedreht. Dann stecken Sie den Röhrenstreifen zurück in das Fluorimeter und inkubieren Sie weitere 30 Minuten bei 37 Grad Celsius mit dem gespeicherten Laufprofil.

Interpretieren Sie die durchschnittlichen relativen Fluoreszenzeinheiten, die auf dem tragbaren Fluorimeter gemessen werden. Schließlich visualisieren Sie die Reaktionsröhren unter LED-blauem Licht bei einer Anregungswellenlänge von 465 Nanometern mit einem Blaulichttransilluminator und nehmen Bilder des fluoreszenten Signals mit einer Telefonkamera auf. Positive Proben erzeugten sichtbare Fluoreszenz im tragbaren Fluorimeter Genie III nach der Erkennung von Foc TR4-DNA durch RPA Cas12a, während negative Proben eine niedrige Endpunkt-Fluoreszenz zeigten.

Bei LED-Blaulicht zeigten die Probenröhren mit DNA aus Foc TR4-infiziertem Pflanzenmaterial sichtbare Fluoreszenz, während Röhrchen mit DNA aus nicht infiziertem Gewebe keine Fluoreszenz zeigten. Wir haben den ersten Assay entwickelt, der CRISPR-Technologie zur Erkennung von Foc TR4 verwendet. Nach der Optimierung bietet der Test eine schnellere und genauere Erkennung auf günstigen Maschinen als bestehende kommerzielle Tests.

Unsere weitere Arbeit wird einen smartphone-gekoppelten Fluoreszenzdetektor untersuchen, der mit dem Test kombiniert werden soll.