Herstellung und Verwendung von anpassbaren Agaroseformen für die gerüstfreie Ovarialfollikelkultur von Mäusen

Unsere Forschung zielt darauf ab, anpassbare, physiomimetische und gerüstfreie Follikelkulturmethoden zu entwickeln, um festzustellen, ob sie die Qualität von in vitro gezüchteten Follikeln und der daraus entstehenden Eizellen verbessern können. Derzeit verwendet die fortschrittlichste Kulturmethode ein hydrogel-umschlossenes, in vitro Follikelwachstumssystem, das es den Follikeln ermöglicht, während der Follikogenese ihre dreidimensionale Architektur beizubehalten. Die Wasserstoffkapselung ist technisch anspruchsvoll, aufwendig, hat wenig Durchsatz und ist leider nicht mit automatischen Bildgebungsmethoden kompatibel.

Zusätzlich bietet die 3D-Verkapselung eine einheitliche Unterstützung, die die Physiologie von in vivo nicht nachahmt. Wir haben 3D-gedruckte, biokompatible Formen entwickelt, die hochsensible Zellen der Eizellen unterstützen. Follikel, die in der gerüstfreien Umgebung gezüchtet wurden, zeigten ein verbessertes Wachstum und einen verbesserten Eisprung, ohne die Hormonproduktion im Vergleich zu etablierten Techniken zu beeinträchtigen.

Wir gehen auf den Bedarf eines benutzerfreundlichen und anpassbaren Kultursystems ein, das die natürliche Umgebung der Follikel besser nachahmen kann. Zeitrafferbildgebung ermöglicht außerdem Live-Tracking und Analyse der Follikelleistung. Starten Sie zunächst die CAD-Software auf einem Computersystem.

Öffnen Sie die 24-Wellen-Master-Formbasis-Design-Schrittdatei in der Software. Wählen Sie die Innenfläche des Objekts aus. Dann gehe zum Tab Solid im Designarbeitsbereich und wähle Skizzen erstellen, um das gewünschte Mikroformdesign einzufügen.

Führen Sie nun die gewünschten x- und y-Dimensionen sowie die Anzahl der Mikrobrunnen ein. Dann wähle in der Symbolleiste Skizze fertigstellen. Erstellen Sie die 800 Mikrometer tiefen Mikrobohrungen mit der Extrudierungsfunktion, indem Sie sequentiell Feststoff, Erstellen und Extrudieren auswählen.

Wählen Sie nun ein Fillet mit 0,1 Millimeter Radius für die Oberseite der Mikrowells, indem Sie auf Design, Solid, Modify und Fillet klicken. Füge ein Abfiltung mit 0,25 Millimetern Radius hinzu, um ein rundes Mikrowell-Becken zu schaffen. Speichere das neue Masterformdesign und exportiere eine Kopie im Schrittformat, indem du Datei auswählst und Exportieren drückst.

Öffnen Sie die 24-Wellen-Silikonguss-Behälter-Ein-Schritt-Datei. Fügen Sie dann das neue Masterformdesign als externe Komponente ein, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die gespeicherte Datei klicken und in das aktuelle Design einfügen auswählen. Als Nächstes klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die eingefügte Komponente und wählen Sie Break Link, um die Referenz auf das Masterformdesign zu entfernen.

Zentriere das neue Masterform-Design in der 24-Wellen-Silikonguss-Behälter auf einer Oberfläche, damit sie nach innen zeigt. Wählen Sie OK, um die Objekte auszurichten. Wählen Sie die Schnitt-Operation, wobei der Behälter als Zielkörper und die Hauptform als Werkzeugkörper dient, um die Silikonformhöhle zu erzeugen.

Speichere und exportiere die neue 24-Well-Siliziumformform als STL- und Schrittdateien. Öffnen Sie die STL-Dateien der neuen 24-Wellen-Silikonformform eins und 24-Wellen-Silikongussbehälter zwei mit 3D-Druckvorbereitungssoftware. Orientiere den Druck mit Mikrosäulen, die nach oben zeigen, und nutze die Bohrlochfunktion, um eine einen Millimeter breite Öffnung an der Seite des Drucks zu schaffen.

Drucken Sie beide Behälterdesigns mit einer Schichtdicke von 25 Mikrometern. Waschen Sie die fertigen Drucke gemäß den Anweisungen des Herstellers. Dann sprühen Sie den Mikrosäulenabschnitt ausgiebig mit 95 % Isopropanol ein.

Entfernen Sie restliches Ethanol mit Druckluft. Nach dem Trocknen und Aushärten inspizieren Sie jeden Druck mit einem Stereomikroskop. Achten Sie sorgfältig darauf, dass alle Mikrosäulen getrennt und gleichmäßig in Größe und Aussehen sind.

Nach dem Aushärten wird die Außenseite des Drucks mit Parafilm abgedeckt, falls der Bohrkanal nicht gefüllt ist, und bis zum weiteren Gebrauch aufbewahrt. Als Nächstes werden das vorbereitete Silikon fünf Minuten lang in einen Vakuum-Desiccator gelegt, um Luftblasen zu entfernen. Gießen Sie die Silikonmischung mit gleichmäßigem Fluss in die 3D-gedruckte Form, wobei Sie sicherstellen, dass das Niveau zur Oberfläche der Form passt oder leicht unter der Oberfläche der Form liegt.

Entferne die eingeschlossene Luft mit einer P200-Pipettenspitze und entgase bei Bedarf erneut. Härte das Silikon mindestens fünf Stunden oder vorzugsweise über Nacht bei Raumtemperatur in einem Desiccator aus. Nach dem Aushärten entferne ich das Silikon aus der Form und begutachte die Mikroformen unter einem Stereomikroskop.

Entfernen Sie überschüssiges Material aus dem Bohrkanal und entsorgen Sie Formen mit Brücken- oder beschädigten Bohrungen. Als Nächstes werden die Silikonform für den zweiten Formschritt in Silikonformbehälter zwei gelegt und darauf geachtet, dass die Seitenöffnung ausgerichtet ist. Besprühen Sie die Silikonform leicht mit embryonatalem Mineralöl.

Entfernen Sie überschüssige Öle aus den Mikrobrunnen mit Druckluft. Wiederholen Sie das Silikonmischverfahren und gießen Sie die neue Mischung in den zweiten Behälter, wobei der Stand auf oder unter der Formoberfläche gehalten wird. Am nächsten Tag trennt man das Silikon von der 3D-gedruckten Form und den Silikonformen eins und zwei voneinander.

Nach mikroskopischer Inspektion entsorgen Sie die Formen mit beschädigten Mikrosäulen oder überschüssigem Öl in den Brunnen. Jetzt waschen Sie die Silikonform mit 70%-Ethanol. Lassen Sie es 30 Minuten in einer laminaren Flusshaube an der Luft trocknen.

Nach dem Trocknen geben Sie die Form vor dem Autoklavieren in einen Sterilisationsbeutel. Biegen Sie die Stripperspitze leicht, um die Präzision beim Follikeltransfer zu erhöhen. Transplantieren Sie die Follikel schnell, um pH- oder Temperaturschwankungen zu vermeiden.

Unter einem Mikroskop verwenden Sie eine 200-Mikrometer-Abzieherspitze, um 10 mehrschichtige sekundäre Follikel pro Mikroform zu übertragen und in benachbarte Mikrowellen zu legen. Bestätigen Sie, dass alle 10 Follikel ähnlich groß sind, bevor Sie die Einrichtung finalisieren. Setzen Sie als Nächstes eine Lichtfokussierkappe auf ein Handmikroskop.

Setze das Mikroskop mit Halterung in einen Inkubator ein und verbinde es mit der Software an einen Laptop. Positioniere und richte die Kultur gut unter dem Mikroskop aus und stelle Höhe und Fokus so an, dass alle Follikel sichtbar sind. Verwende Auto-Weißabgleich, AWB und LED-Steuerung.

Schalte Autobelichtung, AE aus und wähle die optimale Belichtungszeit aus. Beginnen Sie mit Zeitraffer-Bildgebung mit einer Dauer von acht Tagen und einem Abstand von 30 Minuten. Wählen Sie das Foto aus und schalten Sie die LED aus, wenn Sie keine Bilder aufnehmen.

Follikel, die in Agarose-Mikroformen kultiviert wurden, zeigten kontinuierliches Wachstum und Geweishöhlenbildung. Nach der Induktion des Eisprungs ergaben in Agarose-Mikroformen kultivierte Follikel mehr ovulierte Eizellen als in Alginat. Zur weiteren Demonstration der Biokompatibilität unterschied sich die Spindelmorphologie der M2-Eier nicht signifikant zwischen den Gruppen.

Alginat-gekapselte Follikel hielten ihre Position während der Kultur nicht und sind mit Zeitrafferbildgebung unvereinbar. Während der Zeitrafferbildgebung konnte die individuelle Follikelmorphologie, einschließlich Feret-Durchmesser, Zirkularität und Seitenverhältnis, während der gesamten Kulturperiode sofort erfasst und gemessen werden. Die optische Kohärenztomographie ermöglichte eine 3D-Visualisierung interner Follikelstrukturen und erfasste zudem dynamische Follikelrupturen während des Eisprungs.

Agarose-Mikroformen ermöglichten eine histologische Analyse mehrerer Follikel in derselben Ebene nach Paraffineinbettung und -schnitt, wodurch die Identifikation von Gewebeanwesenheit oder -fehlen und die H&E-Färbung unterstützt wurde. Um die Anpassbarkeit dieser Methode zu demonstrieren, wurde eine hochdurchsatzfähige Version mit 96 Wells entwickelt, die 10 Mikrowellen pro Form aufwies und erfolgreich gefertigt wurde. Wie beim 24-Well-Design war es mit Zeitrafferbildgebung von Follikeln kompatibel.