Aufschluss über die elektromechanische Steuerung der Gewebehomöostase mit einem zweischichtigen mikrofluidischen Gerät

Wir wenden kontrollierte elektrische Felder an, um zu untersuchen, wie Gewebe auf elektrische Signale reagieren, und konzentrieren uns darauf, wie Ströme oder Felder die Zelladhäsion, -proliferation und -extrusion regulieren und sich auf die Gewebehomöostase auswirken. Wir haben herausgefunden, dass die Richtung physiologisch relevanter Ströme den Gewebezustand bestimmt. Das apikale bis das basale Feld induzierte einen proliferativen Phänotyp, während das basale bis apikale Feld die Zellextrusion fördert und eine Modulation der Gesamtzelldichte ermöglicht.

Während sich quantitative bioelektrische Studien lange Zeit auf die Migration über die Schwerkraft konzentriert haben, ist die Homöostase des Gewebes nach wie vor nicht zugänglich. Unser System ermöglicht nun die direkte Untersuchung, wie physiologische Kartons die Organisation und Aufrechterhaltung des Gewebes regulieren. Unser Protokoll integriert Mikrofluidik, elektrische Stimulation von Geweben, Struktur- und Kraftmikroskopie sowie Live-Bildgebung, um die elektromechanische Kontrolle der Gewebehomöostase zu untersuchen.

Unsere Arbeit deckte die wichtigsten elektromechanischen Kopplungsregeln auf. Mit neuen Werkzeugen können wir nun erforschen, wie native bioelektrische Muster entstehen und Gewebe regulieren und ob wir komplexes Gewebeverhalten kontrollieren können, indem wir diese elektromechanischen Signale abstimmen. Legen Sie zunächst eine saubere Schicht einer Polydimethylsiloxan- oder PDMS-Form mit der Vorderseite nach oben auf einen sauberen Kunststoffschalendeckel und geben Sie langsam 500 Mikroliter flüssigen, ultraviolett aushärtenden Klebstoff auf die Form.

Befeuchten Sie mit einem Spachtel vorsichtig alle hervorstehenden Strukturen und entfernen Sie alle Luftblasen, die sich während des Benetzungsprozesses gebildet haben. Drücken Sie vorsichtig einen Deckglas auf die PDMS-Form und entfernen Sie mit einem Laborwischer überschüssigen UV-härtenden Klebstoff, um sicherzustellen, dass die Oberseite des Deckglases sauber und flach bleibt. härten Sie die Struktur teilweise unter gleichmäßig beleuchtetem ultraviolettem Licht mit einer Wellenlänge zwischen 363 und 370 Nanometern aus.

Wischen Sie alle Flecken mit 75%igem Ethanol ab. Halten Sie dann die Struktur fest auf einer ebenen Fläche und schälen Sie die PDMS-Form langsam von der ausgehärteten Schicht eins. Legen Sie dann eine saubere Schicht mit zwei PDMS-Formen nach unten auf eine flache PDMS-Platte, die dicker als 2,5 Millimeter ist.

Klopfen Sie mit einer Pinzette vorsichtig von oben auf die Formmerkmale. Achten Sie auf die Schnittstelle unter den Merkmalen auf Abdunkelung oder optischen Kontrast, um den korrekten Kontakt zu bestätigen. Füllen Sie nun den Raum zwischen der PDMS-Form und der Platte mit flüssigem, ultraviolett aushärtendem Klebstoff durch Kapillarwirkung.

Härten Sie die Struktur 10 Sekunden lang unter ultraviolettem Licht teilweise aus, wie zuvor gezeigt. Verwenden Sie eine weich gepolsterte Pinzette, um die ultraviolett härtende Verbundklebeschicht und die PDMS-Form vorsichtig von der PDMS-Platte zu lösen. Schneiden Sie ggf. die überschüssigen Ränder der ausgehärteten Klebeschicht mit einer scharfen Schere ab.

Legen Sie als Nächstes die erste Schicht, die an einem rechteckigen Glasabdeckzettel befestigt ist, auf eine ebene Fläche. Richten Sie die zweite Schicht, die noch mit der PDMS-Form verbunden ist, an der ersten Ebene aus, und drücken Sie beide Schichten fest zusammen, bis Schatten unter den Features erscheinen. Härten Sie die ausgerichtete Struktur 10 Sekunden lang unter ultraviolettem Licht aus, um die Schichten eins und zwei zu einem zweischichtigen mikrofluidischen Chip zu verbinden, und schälen Sie dann die PDMS-Form vorsichtig vom geklebten Chip.

Pipettieren Sie sofort 10 Mikroliter Polyacrylamid-Gel-Vorläuferlösung in die Mitte der Geweberegion direkt über dem Schlitz in Schicht zwei. Drücken Sie vorsichtig einen runden Glasdeckglas mit einem Durchmesser von 10 Millimetern auf das Tröpfchen, um ein flaches Gel zu bilden. Beobachten Sie, wie die Gellösung durch den Schlitz in die erste Schicht fließt und an der Reihe der Barrieresäulen anhält.

Härten Sie den zusammengebauten mikrofluidischen Chip sofort fünf Minuten lang unter ultraviolettem Licht aus. Lassen Sie den Chip dann etwa eine Stunde lang ungestört, damit sich das Polyacrylamid-Gel vollständig verfestigen kann. Inkubieren Sie anschließend den mikrofluidischen Chip mindestens eine Stunde lang in 0,1 molaren HEPES-Puffer bei pH 7,4, um das Gel mit Feuchtigkeit zu versorgen und die Adhäsion zwischen dem Gel und dem Deckglas zu verringern.

Entfernen Sie dann vorsichtig mit einer scharfen Pinzette den Deckslip von der Geloberfläche. Legen Sie eine Kartusche aus medizinischem Polycarbonat mit der Unterseite nach oben auf eine ebene Fläche und richten Sie einen getrockneten Chip mit der Vorderseite nach unten auf die Kartusche aus. Pipettieren Sie UV-härtenden Klebstoff in die Spalten zwischen Chip und Kartusche, füllen Sie diese per Kapillareffekt und härten Sie ihn unter UV-Licht aus.

Sterilisieren Sie die hergestellten mikrofluidischen Geräte, indem Sie sie unter ultraviolettem Licht bei 200 bis 280 Nanometern in einer Biosicherheitswerkbank platzieren. Bereiten Sie das erforderliche Volumen von 50 Mikrogramm pro Milliliter Kollagen eine Arbeitslösung in 1X DPBS auf Eis vor. Bereiten Sie die Sulfo-SANPAH-Arbeitslösung auf Eis vor, indem Sie zwei Mikroliter Sulfo-SANPAH-Stammlösung verdünnen, die zuvor in wasserfreiem Dimethylsulfoxid in 80 Mikrolitern kaltem 0,1-molaren HEPES-Puffer bei einem pH-Wert von 7,4 gelöst und bei vier Grad Celsius gelagert wurde.

Tupfen Sie die Ränder des Polyacrylamid-Gels mit Labortüchern ab, um es im Gerät zu trocknen. Pipettieren Sie 80 Mikroliter Sulfo-SANPAH-Arbeitslösung auf die Geloberfläche, stellen Sie ein vollständiges Eintauchen sicher, und setzen Sie den Chip fünf Minuten lang unter ultraviolettes Licht, um das Sulfo-SANPAH zu aktivieren. Spülen Sie das Gel dreimal mit kaltem 0,1 molaren HEPES-Puffer bei pH 7,4 aus.

Wiederholen Sie die Sulfo-SANPAH-Behandlung, indem Sie 80 Mikroliter SS-Arbeitslösung über das Gel pipettieren und es fünf Minuten lang unter ultraviolettem Licht bestrahlen. Spülen Sie das Gel dieses Mal dreimal mit kaltem 1X DPBS aus. Zum Schluss pipettieren Sie 100 Mikroliter Kollagen eine Lösung auf das Polyacrylamid-Gel, um eine vollständige Abdeckung zu gewährleisten, und lassen Sie es eine Stunde lang einwirken.

Spülen Sie nicht anhaftendes Kollagen dreimal mit 1X DPBS ab und lassen Sie das Gel dann bis zur weiteren Verwendung in 1X DPBS getaucht. Befestigen Sie die Geräte mit Schrauben an den Einsätzen. Befestigen Sie dann bis zu vier Geräteeinsatzbaugruppen an der Halterung, die für die Montage auf einem Mikroskoptisch vorgesehen ist.

Geben Sie zwei Milliliter Nährmedium in jede Hauptvertiefung der Geräte und durch die Abfallentsorgungskanäle, um das 1X DPBS auszuspülen und auszutauschen. Führen Sie dann die Platinelektroden in das Röhrchen mit 45 Millilitern Medium ein und stellen Sie sicher, dass sie vollständig in das Medium eingetaucht sind. Ziehen Sie das Kulturmedium mit einer Spritze durch den Tygon-Schlauch und klemmen Sie es fest.

Verbinden Sie ein Ende des mediumgefüllten Schlauchs mit der Elektrodenkammer und das andere Ende mit dem Gerät. Bereiten Sie nun eine Zellsuspension vor, indem Sie die Empfehlungen zur Vorbereitung der Trypsinisierung oder Zellsuspension befolgen und 0,1 Millionen Zellen in die Hauptvertiefung säen. Montieren Sie das Setup mit den Elektrodenkammern an den Seiten auf das Mikroskop und verbinden Sie das Quellenmessgerät mit der Elektrodenkammer.

Verwenden Sie drei Geräte mit identischem Kanalwiderstand. Weisen Sie eine Gruppe als Kontrollgruppe zu. Wenden Sie apikalen auf basalen Strom auf das zweite Gerät und basalen auf apikalen Strom auf das dritte Gerät an.

Erzeugen Sie ein elektrisches Signal im Stromzangenmodus und liefern Sie einen Gesamtstrom von 20 Mikroampere. Wählen Sie eine 20-fach-Objektivlinse für die Bildgebung des gesamten Gewebes mit einem Epifluoreszenzmikroskop. Wählen Sie schließlich Kanal 561 für rote Fluoreszenz- und Hellfeldkanäle.

Wählen Sie ein einstündiges Zeitintervall während der Langzeitbildgebung aus. Die elektrische Stimulation wurde senkrecht zu den Zellen angewendet, um das transepitheliale Potenzial zu stören und seine Rolle im Gewebeverhalten unter verschiedenen Strömungsrichtungen zu untersuchen. Unter Phasenkontrastbildgebung führten apikale zu basale oder ATB-Ströme zu einer Aufhellung der Zellübergänge innerhalb von 10 Minuten nach der Anwendung, während die Kontroll- und Basal-zu-apikalen BTA-Bedingungen einen geringen Kontrast und flache apikale Oberflächen zeigten.

ATB-Ströme erzeugten eine nach außen gerichtete Konvexität an der apikalen Zelloberfläche. Die Gelverformung war stark von der Strömungsrichtung abhängig. ATB-Ströme zogen das Gel nach oben, während BTA-Ströme das Gel nach unten komprimierten.

Die junktionale E-Cadherin-Intensität nahm unter BTA-Strömen zu, nahm aber unter ATB-Strömen im Vergleich zur Kontrolle signifikant ab. Die Intensität des junktionalen Aktins nahm unter ATB-Strömen ab, stieg jedoch unter BTA-Strömen im Vergleich zur Kontrolle nicht signifikant an. ATB-Ströme lösten mehrzellige Extrusionen lebender Zellen über die Monoschicht aus, während BTA-Ströme die Monolagenstruktur beibehielten, ähnlich wie bei der Kontrolle.

Die räumliche Heterogenität in der Zellverteilung war unter ATB-Strömen signifikant höher, blieb aber unter BTA- und Kontrollbedingungen niedrig und einheitlich. Die Zellproliferationsraten stiegen unter ATB-Stimulation an, wobei die Teilungsraten im Laufe der Zeit höher waren. Im Gegensatz dazu induzierten BTA-Ströme mehr Zelltodereignisse.