Name: Entwicklungstoxizitäts-Assay basierend auf der Echtzeit-Überwachung der Signalstörung des Fibroblasten-Wachstumsfaktors in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Lernen Sie einen Entwicklungstoxizitäts-Assay mit humanen iPS-Zellen kennen, der FGF-Signalstörungen in Echtzeit überwacht. Diese Methode bietet eine präzise Alternative zum Tierversuch.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhre</td><td>FastGene</td><td>FG-MCT015C</td><td>Chemische Testvorbereitung</td></tr><tr><td>15-mL Zentrifugenröhre</td><td>VIOLAMO</td><td>1-3500-21</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>8-Streifen-PCR-Röhre</td><td>Watson</td><td>137-333C</td><td>Chemische Testvorbereitung</td></tr><tr><td>96 Brunnen weiße/klare Bodenplatte, TC-Oberfläche</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>165306</td><td>Zellkultur- und Lumineszenzmessungen</td></tr><tr><td>Schwarzer Mikroplatten mit flachem Boden 96Well</td><td>ASONE</td><td>3-3321-04</td><td>Zur Lumineszenzmessung in Zytotoxizitätstests</td></tr><tr><td>Atme – LEICHTER</td><td>TOHO</td><td>BERM-2000</td><td>Gasdurchlässiger Dichtungsfilm</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Lumineszente Zell-Viabilitätstest</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>Zytotoxizitätstest</td></tr><tr><td>Zentrifuge 5702 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Zentrifugation</td></tr><tr><td>ClipTip 300, gefiltert, steril, Rack</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>94420513</td><td></td></tr><tr><td>ClipTip 50, gefiltert, steril, Rack</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>94420253</td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 FL Automatisierter Zellenzähler</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Zellzählung</td></tr><tr><td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10312</td><td>Zellzählung</td></tr><tr><td>Culture Sure DMSO&nbsp;</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>031-24051</td><td>Lösungsmittel für Chemikalien</td></tr><tr><td>CultureSure Y-27632</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>036-24023</td><td>ROCK-Inhibitor für iPSC-Seeding</td></tr><tr><td>DMEM/F12 HEPES, kein Phenolrot</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11039-021</td><td>Beschichtung für iPS-Zellkultur</td></tr><tr><td>F1-ClipTip Mehrkanalpipetten, 30 bis 300 & Mikro; L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4661180N</td><td></td></tr><tr><td>F1-ClipTip Mehrkanalpipetten, 5 bis 50 & Mikro; L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4661160N</td><td></td></tr><tr><td>Filterchip</td><td>Watson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-freie Basementmembranmatrix mit reduziertem Wachstumsfaktor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413202</td><td>Beschichtung für iPS-Zellkultur</td></tr><tr><td>HIENAI Mat 01R</td><td>COSMO-BIOGRAFIE</td><td>HMAT01R</td><td>Zur Aufrechterhaltung der Plattentemperaturstabilität während der Zellkulturbehandlung</td></tr><tr><td>HIENAI Röhrenwärmer GX01</td><td>COSMO-BIOGRAFIE</td><td>TWGX013</td><td>Zur Erwärmung mittlerer Wärme während experimenteller Handhabung</td></tr><tr><td>Menschliches wärmestabiles bFGF-rekombinantes Protein</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0367</td><td>FGF-Stimulation für den Reporter-Assay</td></tr><tr><td>Menschlich induzierte pluripotente Stammzellen (iPS)</td><td>201B7 (RCB Cat# HPS0063, RRID: CVCL_A324)</td><td>RIKEN BRC Zellenbank</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplattenschüttler</td><td>TAITEC</td><td>0089532-000</td><td>Plattenschütteln für den Zytotozitätstest</td></tr><tr><td>Multiplate-Leser</td><td>PerkinElmer</td><td>ARVO X4</td><td>Lumineszenzmessung</td></tr><tr><td>Nano-Glo-Endurazin Lebendzell-Substrat</td><td>Promega</td><td>N2571</td><td>Lumineszenzsubstrat</td></tr><tr><td>PBS (-)&nbsp;</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>166-23555</td><td>Zellkuluter</td></tr><tr><td>Parafilim</td><td>ALS EINS</td><td>65-1681-93</td><td>Lagerung für Beschichtungsplatten</td></tr><tr><td>Pipetto</td><td></td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>WSL-1563 KronosHT</td><td>ATTO</td><td>3510140</td><td>Echtzeit-Lumineszenzmesssystem&nbsp;</td></tr><tr><td>Stausee</td><td>BMBio</td><td>BM-0850-1</td><td></td></tr><tr><td>STEMdif APEL2 Medium&nbsp;</td><td>STEMCELL-Technologien</td><td>ST-05275</td><td>Prüfmedium</td></tr><tr><td>StemFlex Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3349401</td><td>Wartungsmedium</td></tr><tr><td>Steriles Wasser, frei von Endotoxinen</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>196-15645</td><td>Feuchtigkeitskontrolle für iPS-Zellkulturen</td></tr><tr><td>Gewebekulturplatte VTC-P6</td><td>VIOLAMO</td><td>2-8588-01</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>TrypL Select Enzyme (1X), kein rotes Phenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563011</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Valproinsäure</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>227-01071</td><td>Testmittel</td></tr></tbody></table>

entwicklungstoxizitäts-assay basierend auf der echtzeit-Überwachung der signalstörung des fibroblasten-wachstumsfaktors in humanen induzierten pluripotenten stammzellen

Developmental Toxicity Assay Based on Real-Time Monitoring of Fibroblast Growth Factor Signal Disruption in Human Induced Pluripotent Stem Cells

Unserer Erfahrung nach ist die Zellmorphologie nützlich, um festzustellen, ob ein Assay korrekt durchgeführt wurde. Abbildung 2A zeigt typische konfokale Mikroskopiebilder von Zellen unmittelbar vor und nach der chemischen Exposition. Am Ende des Assays ist fast die gesamte Oberfläche der Wells von Zellen bedeckt. Abbildung 2B zeigt Bilder von Färbungen lebender/toter Zellen. Die Anzahl der abgestorbenen Zellen, die mit Propidiumiodid (PI) gefärbt werden, nimmt nach chemischer Exposition zu; die Zellviabilität liegt jedoch bei mindestens 50%, und fast alle Zellen werden mit Calcein-AM gefärbt.
Tabelle 1 listet die Prüfchemikalien auf, die in unseren früheren Studien verwendet wurden 7,8. Diese Studien zeigen, dass Devtox-Chemikalien mit verbesserter Genauigkeit auf der Grundlage der Störung des FGF-Signals in menschlichen iPS-Zellen unterschieden werden können. Eine wichtige Erkenntnis ist, dass eine kontinuierliche Überwachung der Signalaktivität von entscheidender Bedeutung ist, da sie sich im Laufe der Zeit dynamisch ändert. Der Einsatz eines Echtzeit-Lumineszenzmesssystems bietet eine deutlich höhere Zeitauflösung bei geringerem Messaufwand. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das ein Echtzeit-Überwachungssystem verwendet.
Abbildung 3A zeigt Änderungen der Lumineszenzintensität über einen Zeitraum von 48 Stunden in sechs Replikatvertiefungen unter gleichen Bedingungen ohne die Testchemikalie. Die sechs Kurven sind nahezu ausgerichtet, was auf eine gute Well-to-Well-Reproduzierbarkeit hinweist. Obwohl in unseren früheren Studien in manuellen 24-Stunden-Messungen nicht eindeutig identifiziert, treten in 48-Stunden-Echtzeitmessungen zwei unterschiedliche Peaks auf - ein anfänglicher Peak unmittelbar nach der Zugabe des FGF-Liganden und ein zweiter Peak nach etwa 24 Stunden. Abbildung 3B zeigt die Veränderungen der Lumineszenzintensität bei Exposition gegenüber Valproinsäure (VPA), einem bekannten Entwicklungsgift. VPA ist ein Histon-Deacetylase-Hemmer, der Defekte im Neuralrohr, im Herzen und in den Gliedmaßen verursacht¹¹. VPA unterbricht die FGF-Signalübertragung konzentrationsabhängig. Das automatisierte Echtzeit-Messsystem erfasste die Signaldynamik genauer als manuelle Messungen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68910/68910fig1v2.jpg"> 
Abbildung 1: FGF/SRF-Signalstörungs-Assay. (A) Gentechnik von humanen iPS-Zellen zur Erzeugung von FGF/SRF-Signalreporterzellen. Es wurde ein Plasmid konstruiert, das Nluc stromabwärts des Serumreaktionselements, homologe Arme für den gezielten Knock-in und das Puromycin-Resistenzgen unter der Kontrolle des humanen Phosphoglyceratkinase-Promotors enthält. Nach der Puromycin-Selektion wurden SRE-Nluc-Reporterzellen etabliert. (B) Zeitplan für die Analyse. Die Reporterzellen wurden in eine 96-Well-Platte gesät und 4 Tage lang gezüchtet, um die gesamte Oberfläche zu bedecken. Das lumineszierende Substrat und die Prüfchemikalie wurden 3 bzw. 1 h vor Beginn der Messung zugegeben. Die Zeit der Hinzugabe des FGF-Liganden wurde auf 0 h festgelegt, und die Lumineszenzintensität wurde über die folgenden 48 Stunden kontinuierlich gemessen. (C) Datenanalyse. Die Signaldynamik wurde in Zellen aufgezeichnet, die Testchemikalien ausgesetzt und nicht exponiert waren, und auf die Fahrzeugsteuerung normiert, um den Bereich zwischen den Kurven als Maß für die durch eine Chemikalie verursachte Signalstörung zu schätzen. Für jede Chemikalie wurden ABC-Werte in unterschiedlichen Konzentrationen ermittelt und deren Summe berechnet. Zur Bestimmung des Schwellenwerts wurde eine Analyse der Betriebskennlinie des Empfängers unter Verwendung aller bekannten getesteten Entwicklungsgifte durchgeführt. Abkürzungen: iPS = induzierte pluripotente Stammzellen; RLU = Relative Lichteinheit; AUC = Fläche unter der Kurve; FGF = Wachstumsfaktor der Fibroblasten; SRF = Serum-Response-Faktor; SRE = Serum-Response-Element; HA = homologer Arm; L = links; R = rechts; PuroR = Puromycin-Resistenz-Gen; hPGK = humane Phosphoglyceratkinase; Nluc = NanoLuc Luziferase; ROC = Betriebskennlinie des Empfängers; ABC = Fläche zwischen den Kurven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68910/68910fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68910/68910fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Zellmorphologie und Färbung lebender/toter Zellen. (A) Konfokalmikroskopische Aufnahmen von Zellen vor (Tag 4) und nach (Tag 6) Exposition gegenüber einer Prüfchemikalie. Verbleibende Zellen, die nach dem Test fast die gesamte Oberfläche der Wells bedecken, sind ein Indikator für einen erfolgreichen Testlauf. Eine nahezu vollständige Bohrlochabdeckung am Ende des Assays deutet auf einen erfolgreichen Lauf hin. (B) Färbung lebender/toter Zellen vor und nach der Exposition gegenüber einer Prüfchemikalie. Lebende Zellen wurden mit Calcein-AM grün gefärbt, und tote Zellen wurden mit Propidiumiodid (PI) rot gefärbt. wurden mit Calcein-AM (grün) und tote Zellen mit Propidiumiodid (PI, rot) gefärbt. Der Anteil abgestorbener Zellen sollte geringer sein als &lt; 50% der Gesamtzellen. Maßstabsbalken = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68910/68910fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68910/68910fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Typische Beispiele für die Dynamik der Lumineszenzintensität. (A) Die Zeitverlaufslumineszenz ändert den Zeitverlauf der Lumineszenz nach der Stimulation durch FGF-Liganden, gemessen mit einem Echtzeit-Lumineszenzmesssystem. Die Lumineszenzintensität wurde alle 22 Minuten für 48 Stunden überwacht. Die sechs farbigen Linien stellen Signale aus verschiedenen Bohrlöchern dar. (B) Vergleich von manuellen und Echtzeit-Lumineszenzmessungen mit Valproinsäure. Bei beiden Messmethoden wurde eine Signalstörung beobachtet, während das Echtzeit-Monitoring das verstärkte Signal beim zweiten Peak deutlicher erfasste. Abkürzungen: RLU = Relative Light Unit; VPA = Valproinsäure; FGF = Fibroblasten-Wachstumsfaktor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68910/68910fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68910/68910_Table%201.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Prüfchemikalie</td>
			<td>Abkürzung</td>
			<td>Cas NO.</td>
			<td>Tierversuche (vorherige Studie)</td>
			<td>In-vitro-Studie (diese Studie)</td>
			<td>Summe der ABC-Werte</td>
			<td>Maximale Konzentration (μg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>all-trans-Retinsäure</td>
			<td>ATRA</td>
			<td>302-79-4</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>65.9</td>
			<td>0.0100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxyharnstoff</td>
			<td>HU</td>
			<td>127-07-1</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>63.3</td>
			<td>149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyessigsäure</td>
			<td>MAA</td>
			<td>625-45-6</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>225</td>
			<td>683</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylquecksilberchlorid</td>
			<td>MeHg</td>
			<td>115-09-3</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>77.7</td>
			<td>1.20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methotrexat-Hydrat</td>
			<td>MTX</td>
			<td>133073-73-1</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>80.5</td>
			<td>5.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natriumsalicylat</td>
			<td>SA</td>
			<td>54-21-7</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>38.7</td>
			<td>666</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproinsäure</td>
			<td>Freiwilliger Wirtschaftszweig</td>
			<td>99-66-1</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>63.3</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Aminonicotinamid</td>
			<td>6-EIN</td>
			<td>329-89-5</td>
			<td>P</td>
			<td>N</td>
			<td>24.9</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borsäure</td>
			<td>BA</td>
			<td>10043-35-3</td>
			<td>P</td>
			<td>N</td>
			<td>24.2</td>
			<td>250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Brom-2'-Desoxyuridin</td>
			<td>BrdU</td>
			<td>59-14-3</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>83.9</td>
			<td>50.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,5-Dimethyl-2,4-oxazolidindion</td>
			<td>DMO (Englisch)</td>
			<td>695-53-4</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>50.3</td>
			<td>840</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium-Clorid</td>
			<td>LiCl</td>
			<td>7447-41-8</td>
			<td>P</td>
			<td>N</td>
			<td>29.8</td>
			<td>250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluorouracil</td>
			<td>5-FU</td>
			<td>51-21-8</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>92.4</td>
			<td>2.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophosphamid-Monohydrat</td>
			<td>CPA</td>
			<td>6055-19-2</td>
			<td>P</td>
			<td>N</td>
			<td>19.1</td>
			<td>400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imatinib-Mesylat</td>
			<td>IMA</td>
			<td>220127-57-1</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>42.4</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenalidomid</td>
			<td>LEN</td>
			<td>191732-72-6</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>94.7</td>
			<td>35.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pomalidomid</td>
			<td>POM</td>
			<td>19171-19-8</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>50.9</td>
			<td>2.50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thalidomid</td>
			<td>THA</td>
			<td>50-35-1</td>
			<td>P</td>
			<td>P</td>
			<td>53.3</td>
			<td>12.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamid</td>
			<td>AcA</td>
			<td>79-06-01</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>37.1</td>
			<td>454</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Kampfer</td>
			<td>NOCKE</td>
			<td>464-49-3</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>27.5</td>
			<td>50.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphenhydraminhydrochlorid</td>
			<td>DHM</td>
			<td>147-24-0</td>
			<td>N</td>
			<td>P</td>
			<td>68.2</td>
			<td>262</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylpthalat</td>
			<td>DMP (Englisch)</td>
			<td>131-11-3</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>24.4</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G Natriumsalz</td>
			<td>Peng</td>
			<td>69-57-8</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>22.1</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natriumsaccharin</td>
			<td>BEUTEL</td>
			<td>82385-42-0</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>34.0</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetaminophen</td>
			<td>APAP</td>
			<td>103-90-2</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>22.3</td>
			<td>20.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amoxicillin-Trihydrat</td>
			<td>AMX</td>
			<td>61336-70-7</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>28.4</td>
			<td>25.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cimetidin</td>
			<td>ZENTIMETER</td>
			<td>51481-61-9</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>25.3</td>
			<td>30.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythromycin</td>
			<td>ERY</td>
			<td>114-07-8</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>20.0</td>
			<td>15.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochlorothiazid</td>
			<td>HCTZ</td>
			<td>58-93-5</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>21.9</td>
			<td>20.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfasalazin</td>
			<td>SSZ</td>
			<td>599-79-1</td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>30.8</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemisch</td>
			<td>AUC</td>
			<td>Schwelle</td>
			<td>Empfindlichkeit</td>
			<td>Spezifität</td>
			<td>Genauigkeit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 Substanzen</td>
			<td>0.819</td>
			<td>37.9</td>
			<td>0.778</td>
			<td>0.917</td>
			<td>0.833</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Devtox- und Nicht-Devtox-Chemikalien, die in Tierversuchen klassifiziert wurden, und Ergebnisse, die mit und ohne FGF-Signalstörung geschätzt wurden. Abkürzungen: P = positiv (Devtox); N = negativ (nicht-Devtox).

Entwicklungstoxizitäts-Assay basierend auf der Echtzeit-Überwachung der Signalstörung des Fibroblasten-Wachstumsfaktors in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Developmental toxicity (Devtox) is typically evaluated in animal models. However, there are challenges in ensuring accuracy, such as false negatives due ...

developmental-toxicity-assay-based-on-real-time-monitoring-fibroblast

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir zeigen das Protokoll für die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Lentivirus-vermittelte Lieferung der menschlichen Faktoren Oct4, Sox2, Nanog und Lin28. Pluripotenz von Morphologie und die Anwesenheit von embryonalen Stammzellen (ES) Zell-spezifische Marker bestätigt.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung menschlichen Fibroblasten mit dem Stemgent Menschliche TF Lentivirus Set

Wir präsentieren ein Protokoll für die effiziente Reprogrammierung von menschlichen Körperzellen in die menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) mit retroviralen Vektoren kodieren Oct3 / 4, Sox2, Klf4 und c-Myc (OSKM) und Identifizierung von richtig umprogrammiert hiPSC durch Live-Färbung mit Tra- 1-81 Antikörper ist.

Selektieren und Isolieren Colonies of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus adulten Fibroblasten Umprogrammierte

Die Qualität von embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) durch die rechte Mausstamm wie CF-1 bestimmt. Pluripotenz-unterstützende MEFs und konditionierte Medien (CM) aus diesen gewonnenen Erkenntnisse sollten den optimalen Konzentrationen von Activin A, Gremlin und TGFß1 für die Activin / Nodal und FGF Signalwege erforderlich, um kooperativ zu halten Selbsterneuerung und Pluripotenz enthalten.

Vorbereitung von embryonalen Maus-Fibroblasten-Zellen zum Kultivieren von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen

Die Protokolle beschreiben zwei In-vitro-Testsysteme Entwicklungstoxizität (UKK und UKN1) auf der Grundlage humaner embryonaler Stammzellen und Transkriptom-Studien. Die Testsysteme voraussagen menschlichen Entwicklungstoxizität Gefahren und kann dazu beitragen, Tierversuche, die Kosten und die Zeit für die Stoffsicherheitstests zu reduzieren.

Menschliche pluripotente Stammzelle Basierend Entwicklungstoxizität Assays für chemische Sicherheit Screening und Systembiologie Datengenerierung

Dieses Protokoll bietet eine einfache und effiziente Möglichkeit, humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) zu vermehren, indem nur konditionierte Medien aus der menschlichen Plazenta in einer mit Gelatine überzogenen Schale verwendet werden, ohne zusätzliche exogene Supplementierung oder hPSC-spezifische synthetische Substrate.

A Novel Kultur Modell für menschliche pluripotente Stammzelle Propagation auf Gelatine in Placenta Anlage Medien

Menschliche induzierte pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) gelten als ein leistungsfähiges Werkzeug für die Arzneimittel- und Chemikalien-Screening und für die Entwicklung neuer in vitro- Modelle für die Toxizitätstests, einschließlich Neurotoxizität. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Differenzierung von hiPSCs in Neuronen und Glia beschrieben.

Protokoll zur Differenzierung von human induzierten pluripotenten Stammzellen in Mischkulturen von Neuronen und Glia für Neurotoxizitätstests

Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt eine Plattform zur Identifizierung von kleiner Molekülen für die Behandlung von Lebererkrankungen. Eine schrittweise Beschreibung präsentiert Details wie iPSCs in Zellen mit Hepatozyten Eigenschaften in 96-Well Platten zu differenzieren und die Zellen verwenden, um Bildschirm für kleine Moleküle mit möglichen therapeutischen Tätigkeit.

Menschen mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten-ähnliche Zellen für die Wirkstoffforschung

Hier beschreiben wir eine klinisch relevante, hohem Wirkungsgrad, Feeder-free Methode, um menschliche primäre Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen mit modifizierten mRNAs codieren Neuprogrammierung Faktoren neu zu programmieren und Reife MicroRNA-367/302 imitiert. Ebenfalls enthalten sind Methoden zur Beurteilung der Neuprogrammierung Effizienz klonalen iPSC Kolonien zu erweitern, und Ausdruck der Pluripotenz Markierung TRA-1-60 zu bestätigen.

RNA-basierten Reprogrammierung von menschlichen primäre Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen

Die Zellumprogrammierung erfordert die Einführung von Schlüsselgenen, die den pluripotenten Zellzustand regulieren und aufrechterhalten. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Bildung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen dermalen Fibroblasten ohne virale/integrierende Methoden, aber unter Verwendung nicht modifizierter RNAs (NM-RNAs) in Kombination mit Immunumgehungsfaktoren, die die zellulären Abwehrmechanismen reduzieren.

Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Human-induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) haben sich als vielversprechendes In-vitro-Modell für das medikamenteninduzierte Kardiotoxizitätsscreening und die Krankheitsmodellierung herausgestellt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der Kontraktilität und Elektrophysiologie von hiPSC-CMs.

Technische Anwendungen von Mikroelektrodenarray- und Patch-Clamp-Aufnahmen an humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Humane induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) bieten eine Alternative zur Verwendung von Tieren für das präklinische Kardiotoxizitäts-Screening. Eine Einschränkung für die weit verbreitete Einführung von hiPSC-CMs im präklinischen Toxizitätsscreening ist der unreife, fetale Phänotyp der Zellen. Hier werden Protokolle für eine robuste und schnelle Reifung von hiPSC-CMs vorgestellt.

Hochdurchsatz-Kardiotoxizitäts-Screening unter Verwendung von reifen, humaninduzierten pluripotenten Stammzell-Kardiomyozyten-Monoschichten

Lernen Sie einen Entwicklungstoxizitäts-Assay mit humanen iPS-Zellen kennen, der FGF-Signalstörungen in Echtzeit überwacht. Diese Methode bietet eine präzise Alternative zum Tierversuch.

Entwicklungstoxizitäts-Assay basierend auf der Echtzeit-Überwachung der Signalstörung des Fibroblasten-Wachstumsfaktors in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (Video) | JoVE Journal

Entwicklungstoxizitäts-Assay basierend auf der Echtzeit-Überwachung der Signalstörung des Fibroblasten-Wachstumsfaktors in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

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