Evaluierung therapeutischer Interventionen im SHIP-defizienten Mausmodell der Morbus Crohn-ähnlicher Ileitis und Fibrose

Wir verwenden SHIP-defiziente Mäuse, um die Mechanismen zu untersuchen, die Darmentzündungen und -fibrose bei Morbus Crohn antreiben, und um neue Medikamente oder therapeutische Strategien zur Behandlung von Morbus Crohn zu evaluieren. Deshalb haben wir dieses Modell in präklinischen Studien verwendet, um die Wirksamkeit von Glykogen-IBD-Medikamenten für gezielte Arzneimittelabgabe zu zeigen. Unser Protokoll verwendet SHIP-defiziente Mäuse, die auf natürliche Weise eine ileale Entzündung und Fibrose entwickeln, was ein physiologisch relevanteres Modell bietet als traditionelle chemisch induzierte oder verletzungsbasierte Modelle.

Unsere Ergebnisse belegen SHIP-defiziente Mäuse als robustes Modell für ileale Entzündung und Fibrose, was mechanistische Studien und präklinische Tests von Therapien für Morbus Crohn ermöglicht. Zu Beginn fasten Sie die Mäuse vier Stunden, bevor Sie den Test durchführen. Lösen Sie vier Kilodalton FITC-Dextran in sterilem PBS auf, um eine Endkonzentration von 80 Milligramm pro Milliliter zu erreichen.

Als Nächstes wird jede Maus vorsichtig festgehalten und 150 Mikroliter der FITC-dextran-Lösung über orale Gavage verabreicht, anschließend weitere vier Stunden ohne Nahrung gehalten. Nach der Einschläferung der Maus führen Sie eine Herzpunktion mit einer 25-Gauge-Nadel und einer Ein-Milliliter-Spritze durch, um Blut zu entnehmen. Fügen Sie sofort 10 Mikroliter Säure-Citrat-Dextrose-Lösung zu je 100 Mikrolitern gesammeltem Blut als Antikoagulans hinzu.

Rühren Sie gründlich, indem Sie das Rohr mehrmals umdrehen. Zentrifugieren Sie die gesammelten Blutproben bei 1.500 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie das Plasma vorsichtig auf beschriftete 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhren.

Bewahren Sie alle Proben auf Eis und vor Licht geschützt, bis sie zur Analyse bereit sind. Verdünnen Sie nun jede Plasmaprobe im Verhältnis eins zu zwei und eins zu zehn mit PBS. Fügen Sie 100 Mikroliter jeder Plasmaverdünnung in eine undurchsichtige 96-Well-Platte hinzu und setzen sie in doppelte Bohrungen.

Führen Sie ein bis zwei serielle Verdünnungen der ursprünglichen 80 Milligramm pro Milliliter FITC-dextran-Material mit PBS durch, um verschiedene Konzentrationen der Lösung herzustellen. Fügen Sie 100 Mikroliter jeder Verdünnung in doppelte Brunnen der 96-Bohrloch-Platte hinzu. Anschließend wird die Fluoreszenz mit einem Mikroplattenleser gemessen, der auf 485 Nanometer für Anregung und 535 Nanometer für die Emission eingestellt ist.

Nach der Blutentnahme für den FITC-dextran-Test entferne sorgfältig den gesamten Dünndarm von der Maus. Entfernen Sie vorsichtig anhaftendes Fett und Bindegewebe aus dem Darm. Legen Sie den gereinigten Darm flach auf ein Blatt blankes weißes Papier, um den visuellen Kontrast zu verbessern.

Untersuchen Sie das Gewebe visuell auf makroskopische Anzeichen einer Erkrankung, wobei Sie besonders auf die distalen 10 Zentimeter bei SHIP-Knockout-Mäusen achten, wo häufig Entzündungen auftreten. Richten Sie den Darm neben einem Lineal aus, um einen Maßstab zu erzeugen, und fotografieren Sie das gesamte Exemplar, um eventuelle grobe pathologische Befunde zu dokumentieren. Spülen Sie das Darmlumen vorsichtig mit PBS mit einer Spritze, um den Darminhalt zu entfernen, wobei übermäßige Kraft vermeidet wird, um eine Verzerrung der Zocken- und Kryptarchitektur zu verhindern.

Identifizieren Sie den Bereich des distalen Ileums, der am besten für die Makropathologie repräsentativ ist, und entfernen Sie etwa einen Zentimeter Gewebe. Legen Sie das entfernte Gewebe flach in eine Histologiekassette und legen Sie es zwischen zwei Schwämme, um ein Falten während der Fixierung zu verhindern. Bei der Hämatoxylin- und Eosin-Färbung sowie der Masson-Trichrom-Färbung fixieren Sie das Gewebe in 10 % neutralem gepuffertem Formalin mit 10- bis 20-fachem Gewebevolumen über Nacht bei vier Grad Celsius.

Nach der Fixierung werden die Kassetten zu 70 % Ethanol zur Lagerung umgefüllt und bis zur Verarbeitung vollständig untergetaucht. Bei der Färbung von Alcian Blue und periodischer Säure – Schiff – fixieren Sie das Gewebe in Carnoys Lösung über Nacht bei vier Grad Celsius. Nach der Fixierung werden die Kassetten zu 100 % Ethanol umgewandelt, um sie bis zur Verarbeitung zu lagern.

Anschließend werden die fixierten Gewebe in Paraffin eingebettet und in fünf Mikrometerscheiben für die spätere Färbung geschnitten. Bewerten Sie die mit Hämatoxylin und Eosin gefärbten Ilealschnitte mit einer 16-Punkte-Skala nach definierten histopathologischen Kriterien. Bewerten Sie die trichrom gefärbten Querschnitte des Masson mit einer Sechs-Punkte-Skala basierend auf vordefinierten Kriterien.

Berechnen Sie den endgültigen Fibrose-Wert als Median der von zwei unabhängigen Gutachter vergebenen Bewertungen, die für die experimentellen Bedingungen blind sind. Nach der Sektion und Entnahme der Histologieprobe wird der verbleibende Teil der distalen 10 Zentimeter des Ileums gesammelt. Tupfen Sie das gesammelte Gewebe mit einem Küchenpapier oder einem fusselfreien Tuch trocken ab und zeichnen Sie dann das Gewebegewicht mit einer kalibrierten Waage auf.

Das Gewebe vor der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius in flüssigem Stickstoff einfrieren, um später zu verarbeiten. Wenn Sie bereit zur Verarbeitung sind, entnehmen Sie das gefrorene Gewebe und legen Sie es immer auf Eis. Wiegen Sie dann die Gewebeproben erneut, um die genaue Masse zu bestätigen.

Bereiten Sie den Homogenisierungspuffer vor, indem Sie PBS einen Proteaseinhibitor hinzufügen. Verwenden Sie 10 Mikroliter Puffer pro Milligramm Gewebe. Mit einem Laborhomogenisator homogenisieren Sie das volldicke ileale Gewebe in einem eiskalten Homogenisierungspuffer.

Fahren Sie fort, bis das Homogenat gleichmäßig und frei von sichtbaren Gewebefragmenten ist. Spülen Sie die Homogenisatorspitze zwischen den Proben gründlich mit PBS, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Zentrifugieren Sie das Gewebe bei 10.000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Kaliquotieren Sie die geklärten Supernatanten in kleinere Volumen, um Gefrier-Tau-Zyklen zu verhindern, und lagern Sie sie dann bei minus 80 Grad Celsius für zukünftige Analysen. Die histologische Analyse zeigte signifikant größere Darmschäden bei SHIP-defizienten Mäusen im Vergleich zu SHIP-Kontrollen. Die Behandlung mit Dexamethason reduzierte den histologischen Schaden bei SHIP-mangelnden Mäusen, obwohl der Rückgang statistisch nicht signifikant war.

Massons Trichromfärbung zeigte eine signifikant erhöhte Kollagenablagerung bei SHIP-defizienten Mäusen im Vergleich zu SHIP-Kontrollen, was auf höhere Fibrosewerte hinweist. Die Behandlung mit Dexamethason reduzierte die Fibrose bei SHIP-defizienten Mäusen deutlich und brachte die Ergebnisse näher an SHIP-positive Kontrollgruppen. Alcian-blaue und PAS-Färbung bestätigten die Hyperplasie der Becherzellen bei SHIP-defizienten Mäusen, die nach der Behandlung mit Dexamethason sichtbar reduziert wurde.

Die IL-1-Beta-Konzentrationen waren bei SHIP-defizienten Mäusen im Vergleich zu SHIP-Kontrollen signifikant erhöht. Dexamethason reduzierte signifikant die IL-1-Beta-Konzentrationen bei SHIP-mangelnden Mäusen. Die MPO-Konzentrationen waren bei SHIP-mangelnden Mäusen im Vergleich zu SHIP-Kontrollen signifikant erhöht, und dieser Anstieg wurde durch Dexamethason reduziert, ohne die statistische Signifikanz zu erreichen.

Die LCN-2-Konzentrationen waren ebenfalls bei SHIP-defizienten Mäusen erhöht, aber hohe Werte wurden durch Dexamethason nicht konstant gesenkt. Die IL-1-Beta-Konzentrationen korrelierten positiv mit histologischen Schadenswerten und Fibrosewerten, was auf einen Zusammenhang zwischen Entzündung und Gewebeschädigung hinweist. Histologische Schadenswerte korrelierten positiv mit Fibrose-Scores, was darauf hindeutet, dass Gewebeschäden und fibrotische Remodellierung parallel fortschreiteten.