Mikrovaskuläres Embolismus-Mausmodell für die In-vivo-Zweiphotonenmikroskopie mit fluoreszierenden Polystyrol-Mikrosphären
21. November 2025
Dieses Protokoll enthält eine ausführliche Beschreibung eines Schritt-für-Schritt-Ansatzes für ein chronisches Schädelfenster- und mikrovaskuläres Embolismus-Mausmodell, das für die in vivo Zweiphotonenmikroskopie mit fluoreszierenden Polystyrol-Mikrosphären optimiert ist.
Mit dieser Mikrosphäreninjektionsmethode wollen wir die kurz- und langfristigen Folgen der Kapillarverstopfung aufklären, um mögliche Mechanismen zur Reinigung des Embolus im zerebralen Kapillarnetzwerk zu untersuchen. Es ermöglicht eine Echtzeit-In-vivo-Bildgebung und Verfolgung fluoreszierender Partikel im kortikalen Kapillarnetzwerk. Die Mikrosphären und die lokalen Folgen können wochenlang nach der Injektion verfolgt werden.
Unsere Studien helfen, lokale Gewebeschäden durch mikrovaskuläre Verschlüsse zu verstehen. Diese Ergebnisse könnten hoffentlich zu neuen Behandlungsstrategien führen. Wir können heute Tag für Tag und wochenlang untersuchen, wie Kapillarverstopfungen Gefäße verändern, Zellen aktivieren, den Blutfluss verändern und die Blut-Hirn-Schranke schädigen.
Zu Beginn kneifen Sie die Zehe einer betäubten Maus, um die Tiefe der Anästhesie zu überprüfen. Machen Sie einen Mittellinienschnitt von etwa 0,5 Zentimetern über der Luftröhre unterhalb des Unterkiefers mit chirurgischer Schere und einer Dissektionszange. Zersezieren Sie das oberflächliche Bindegewebe zur Halsfaserfaszie mit einer Mikronaht-Binde, um die darunterliegenden sternalen Zungenmuskeln freizulegen.
Trennen Sie nun die linke und rechte Zungenbeinmuskulatur, indem Sie das Bindegewebe zwischen ihnen vorsichtig aufreißen. Ziehe den rechten Omohyoidealmuskel kaudallateral mit einem Gewebehaken zurück. Stellen Sie sicher, dass das rechte Halsschlagaderdreieck, einschließlich der Arterie Halsschlagader gemeinsam, der arteria der internen Halsschlagader und der äußeren Halsschlagaderarterie, deutlich sichtbar sind.
Anschließend werden alle verbliebenen Faszien und das Fettgewebe um die arteriale Halsschlagader entfernt. Trennen Sie vorsichtig die Arteria carotis common vom Vagusnerv. Legen Sie zwei 4/0 1,5-Fäden um die Halsschlagader und binden Sie sie locker, damit die Knoten die Blutfluss nicht behindern.
Entfernen Sie Faszie und Fettgewebe aus der arteriösen Halsschlagader interner und der hinteren parietalen Arteria parietal. Dann wird vorübergehend die hintere Parietalarterie und alle inneren Karotis-Seitenzweige, einschließlich der Occipitalarterie, durch das Binden eines Knotens mit einem 4/0 1,5-Faden verbunden. Faszie und Fettgewebe aus der äußeren Halsschlagader und der Temporalarterie entfernen.
Legen Sie zwei lose Knoten um die äußere Halsschlagader und die Temporalarterie mit 4/0 Größe 1,5 Fäden. Positionieren Sie den distalsten Faden so weit wie möglich von der Y-förmigen Bifurkation entfernt und verwenden Sie ihn, um die äußere Halsschlagader und die Temporalarterie dauerhaft zu verbinden. Lass den proximalen Knoten offen.
Homogenisieren und sonikieren Sie die 10-Mikrometer-Mikrosphären, um eine gleichmäßige Suspension einzelner Partikel zu erhalten. Fügen Sie 20 Mikroliter homogenisierte Mikrosphären zu 140 Mikrolitern FITC-Dextran hinzu, um ein endgültiges Volumen von 160 Mikrolitern Gemisch zu erhalten, das 1,44 mal 10 Potenz von fünf Mikrosphären enthält. Ziehen Sie die Spritze, die mit dem Katheter verbunden ist, kurz zurück, um eine Luftschleuse zu schaffen.
Dann tauchen Sie die Katheterspitze in die vorbereitete FITC-Dextran/Tween20/Microsphere-Mischung ein und ziehen Sie die Spritze langsam zurück, bis die Mischung im Katheter ist. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen im Katheter vorhanden sind. Setzen Sie die Spritze mit dem geladenen Katheter in die Spritzenpumpe.
Stellen Sie die Pumpe auf 10 Mikroliter pro Minute ein und lassen Sie sie laufen, bis ein kleiner Tropfen Mikrosphärengemisch an der Katheterspitze erscheint. Setzen Sie nun einen Gefäßclips auf die arterie halsschlagader interner und ziehen Sie einen der zuvor vorbereiteten proximalen Knoten um die arterie halsschlagader fest. Mit einer Mikroschere wird ein kleiner diagonaler Schnitt in der äußeren Halsschlagader etwa 0,5 Millimeter entfernt vom Ligaturfaden gemacht, wobei die Schnittgröße etwas kleiner als der Katheterdurchmesser ist.
Nehmen Sie Blut mit einem sterilen Tuch auf. Starten Sie kurz die Spritzenpumpe, um an der Katheterspitze einen Tropfen Mikrosphärengemisch zu bilden, um sicherzustellen, dass keine Luft mehr in der Katheterspitze verbleibt. Öffnen Sie den externen Halsschlagaderschnitt und führen Sie den Katheter mit einer feinen Mikropinzette ein.
Dann sichern Sie den Katheter in der äußeren Halsschlagader, indem Sie die proximale Naht um die äußere Halsschlagader anziehen. Pumpen Sie allmählich mit 10 Mikrolitern pro Minute, bis sich die Arterie sichtbar vergrößert und der grüne FITC-Farbstoff die äußere Halsschlagader füllt, um die erfolgreiche Injektion zu bestätigen. Als Nächstes wird die Gefäßklammer aus der inneren Halsschlagader entfernt.
Dann erhöhen Sie den Durchfluss der Spritzenpumpe auf 20 Mikroliter pro Minute. Bestätigen Sie die erfolgreiche Mikrosphäreninjektion, indem Sie überprüfen, dass die interne Karotisarterie distal zur Bifurkation der hinteren parietalen Arteria mit FITC-Farbstoff gefüllt ist. Nach erfolgreicher Injektion wird der Faden entfernt, der die arterie Halsschlagader verbindet, damit das Mikrosphärengemisch in die arterie halsschlagader intern fließen kann.
Während der Injektion kann der FITC-Farbstoff weiterhin in der äußeren Halsschlagader beobachtet werden. Schalten Sie die Spritzenpumpe aus, sobald das Gemisch im Katheter die 80-Mikroliter-Marke erreicht, um die Injektion zu stoppen. Dann wird die Arteria Halsschlagader gesamentut, die innere Halsschlagader abgeschnitten und der Katheter vorsichtig entfernt, während der Sicherungsfaden an Ort und Stelle bleibt.
Binden Sie die äußere Halsschlagader dauerhaft ab, indem Sie den Faden festziehen, der den Katheter gesichert hat. Entfernen Sie den Gefäßclip und die Fäden um die arteriöse Halsschlagader gemeinsam, die arteriöse innere Halsschlagader und die hintere parietale Arteria zur Wiederherstellung der Durchblutung. Der Erfolg der mikrovaskulären Embolie-Operation wurde vier Tage nach der Operation durch vollständige und vollständige Hirn-Post-Mortem-Bildgebung in situ bestätigt.
Ein sagittaler Hirnschnitt zeigte eine Verlagerung von Mikrosphären im Gehirn. Entfernte Mausehirne, die einen Tag nach der Operation abgebildet wurden, zeigten, dass Mikrosphären überwiegend in der ipsilateralen Hemisphäre im Flussbereich der mittleren und vorderen Großhirnarterie angelagert sind. Die Mikrosphärenzahlen in Gehirnschnitten stiegen signifikant, als Tween20 der Mikrosphärenmischung hinzugefügt wurde.
Mäuse verloren weniger Gewicht und erholten sich nach der Operation schneller, wenn sie mit einer Mikrosphärenmischung injiziert wurden, die Tween20 enthielt. Fluoreszenzmikroskopische Bilder des Hirnrindes, aufgenommen 0,5 Stunden nach der Operation, zeigten einzelne weiße Punkte, die Mikrosphären darstellen, die Kapillaren verschließen. Zwei-Photonen-Z-Stack-Projektionsbilder zeigten Mikrosphären, die zerebrale mikrovaskuläre Embolismen mit beeinträchtigter Perfusion verursachten.
Embolismen verursachen außerdem eine Störung der Blut-Hirn-Schranke, da sichtbare Farbstoffe aus den Gefäßen austreten.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt einen detaillierten, schrittweisen Ansatz zur Erstellung eines chronischen Schädel-Fensters und eines Mausmodells für mikrovaskuläre Embolien, das für die In-vivo-Zwei-Photonen-Mikroskopie optimiert ist. Die Methode nutzt fluoreszierende Polystyrol-Mikrosphären, um die Auswirkungen von Kapillarverstopfungen zu untersuchen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Mikrovaskuläre Forschung
- In-vivo-Bildgebungsverfahren
Hintergrund
- Das Verständnis der Folgen von mikrovaskulären Okklusionen ist entscheidend für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien.
- Mittels Echtzeit-Bildgebung ist es möglich, fluoreszierende Partikel im kapillaren Netzwerk des Gehirns zu verfolgen.
- Frühere Studien haben gezeigt, dass eine Kapillarverstopfung zu lokalen Gewebeschäden führen kann.
- Ziel dieser Forschung ist es, die Mechanismen der Embolusbeseitigung im Gehirn aufzuklären.
Zweck der Studie
- Untersuchung der kurz- und langfristigen Auswirkungen von Kapillarverschlüssen.
- Verständnis, wie mikrovaskuläre Okklusionen den Blutfluss und die Blut-Hirn-Schranke beeinflussen.
- Erforschung potenzieller Behandlungsstrategien für Erkrankungen, die mit mikrovaskulären Schäden in Zusammenhang stehen.
Verwendete Methoden
- Erstellung eines chronischen Schädel-Fensters bei Mäusen zur Bildgebung.
- Injektion fluoreszierender Mikrosphären zur Induktion eines mikrovaskulären Embolismus.
- Verwendung der Zwei-Photonen-Mikroskopie für die Echtzeit-Bildgebung.
- Bildgebung nach der Operation zur Bestätigung der Einlagerung der Mikrosphären im Gehirn.
Hauptergebnisse
- Die Mikrosphären lagerten sich vorwiegend in der kontralateralen Hemisphäre ein.
- Mit der Zugabe von Tween20 wurden erhöhte Anzahlen an Mikrosphären beobachtet.
- Mäuse, die Tween20 injiziert bekommen hatten, zeigten eine schnellere Erholung nach der Operation.
- Die Fluoreszenzmikroskopie zeigte eine Verstopfung der Kapillaren durch Mikrosphären.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode ermöglicht eine detaillierte Untersuchung mikrovaskulärer Okklusionen in vivo.
- Die Ergebnisse könnten zu neuen Erkenntnissen über Behandlungsstrategien bei zerebralen mikrovaskulären Erkrankungen führen.
- Die Studie vertieft das Verständnis der Dynamik von Blutfluss und Gewebeschäden im Gehirn.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Modelle der mikrovaskulären Embolie unter Verwendung fluoreszierender Mikrosphären und der in-vivo-Zwei-Photonen-Mikroskopie bieten eine robuste Plattform zur Aufklärung der Mechanismen und Folgen zerebraler Mikrookklusionen. Dieser Ansatz ermöglicht eine hochauflösende, longitudinale Verfolgung vaskulärer Ereignisse und Gewebeantworten und stützt die Vorhersagesicherheit bei der Validierung neurovaskulärer Zielstrukturen in frühen Entwicklungsstadien. Aufgrund ihrer Reproduzierbarkeit und quantitativer bildgebender Ausgabedaten stellt die Methode ein wertvolles Instrument für die Portfolio-Priorisierung und die mechanistische Risikominimierung in der Entdeckung neurovaskulärer Arzneimittel dar.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Überprüfung von Hypothesen zur neurovaskulären Verletzung durch gezielte Induktion von Mikrookklusionen.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung durch die Visualisierung von Gefäß-, Zell- und Blut-Hirn-Schrankenreaktionen über die Zeit.
- Erleichtert die funktionelle Target-Validierung, indem Embolienereignisse mit nachgeschalteten Gewebeschäden und Clearance-Dynamiken verknüpft werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein validiertes In-vivo-System zur quantitativen Beurteilung der mikrovaskulären Okklusion und Reperfusion.
- Liefert reproduzierbare, informationsreiche Bildgebungsdaten, die für die Standardisierung von Assays und den Vergleich zwischen Studien geeignet sind.
- Ermöglicht das Screening von potenziellen therapeutischen Maßnahmen zur Auflösung von Embolien oder zum Schutz des neurovaskulären Systems.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Übereinstimmung mit krankheitsrelevanten Modellen zerebraler mikrovaskulärer Verletzungen für die translationale Biomarkerforschung.
- Ermöglicht durch die Durchführung langzeitlicher Ergebnisverfolgung eine lückenlose Unterstützung vom Entdeckungsstadium bis zur präklinischen Validierung.
- Ergänzt risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung, indem Gewebe- und vaskuläre Reaktionen auf Mikrookklusionen quantifiziert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Modell ist in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Forschung integriert und verbindet mechanistische Studien mit translationsorientierter Forschung in der Neurovaskularbiologie.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung zu mikrovaskulären Verletzungen und Clearance-Mechanismen mittels Echtzeit-Bildgebung.
- Screening: Bietet quantitative, reproduzierbare Messgrößen zur Bewertung potenzieller Therapeutika in vivo.
- Analytik: Ermöglicht den statistischen Vergleich von Embolismuslast, Gewebeschädigung und Erholung zwischen experimentellen Gruppen.
- Translationale Forschung: Verbindet mechanistische Erkenntnisse mit krankheitsrelevanten Endpunkten und der Entwicklung von Biomarkern.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine standardisierte, wiederverwendbare Plattform für neurovaskuläre Forschung und die Prüfung von Interventionen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vorhersagevertrauen bei der Validierung neurovaskulärer Zielstrukturen und der mechanistischen Risikominimierung.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch standardisierte Bildgebungs- und Injektionsprotokolle.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem quantitative, longitudinale Daten zu vaskulären und Gewebeergebnissen bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung neurovaskulärer Programme auf der Grundlage robuster in-vivo-Evidenz.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Mikrochirurgie, In-vivo-Bildgebung und quantitativer Analyse vaskulärer Ereignisse.
- Setzt Zugang zu einer Zwei-Photonen-Mikroskopie und einer Infrastruktur für postmortale 3D-Bildgebung voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Forschungsteams bei Injektionsgemischen und Bildgebungsprotokollen, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Kann auf verschiedene Mausmodelle übertragen werden, erfordert jedoch möglicherweise eine Optimierung für unterschiedliche vaskuläre Versorgungsgebiete.
- Mögliche Einschränkungen umfassen die technische Komplexität sowie die Notwendigkeit einer longitudinalen Überwachung der Tiere.
