Präzise Phagenmutagenese mit NgTET-assistierten CRISPR-Cas-Systemen

Wir untersuchen Phageninfektionen auf molekularer Ebene. Das ist wirklich Grundlagenforschung. Wir betreiben jedoch nicht nur Grundlagenforschung, sondern sind auch daran interessiert, diese Grundlagenforschung in Anwendungen umzusetzen, in denen wir dieses Wissen nutzen, um die Phageninfektion zu untersuchen und es für das Phagen-Engineering und für therapeutische Anwendungen zu nutzen.

Eine der jüngsten Entwicklungen auf dem Gebiet der Phagenforschung ist die Entdeckung eines bakteriellen Immunsystems. Dieses Immunsystem ist in allen Bakterien vorhanden und sie haben Werkzeuge identifiziert oder generiert, um den Phagen wirklich zu bekämpfen. Allerdings ist der Phagen ziemlich schlau.

Ein Phage war in der Lage, auch Werkzeuge zu identifizieren und Werkzeuge zu entwickeln, die es ihm ermöglichen, diesem Immunsystem zu entkommen. Und ein Werkzeug ist tatsächlich die Modifikation seiner DNA durch Modifikation. Und das ist speziell für uns wirklich interessant, denn die chemische Natur dieser DNA-Modifikationen zu untersuchen, die Phagen erzeugt haben, um dem Immunsystem zu entkommen, ist wirklich interessant und ermöglicht es uns auch, ein Werkzeug zu werden, um den Phagen am Ende zu manipulieren.

In den letzten 10 Jahren wurden wunderbare Technologien von tollen Kollegen rund um den Globus entwickelt. Eine dieser Technologien ist zum Beispiel das Next Generation Sequencing. Basierend auf dieser Technologie können wir wirklich Phagen, aber auch das gesamte Wirtsgenom auf molekularer Ebene sequenzieren.

Auf der anderen Seite wurde die Massenspektrometrie, also so etwas wie Proteomik, entwickelt. CRISPR ist ein wunderbares Werkzeug, das mittlerweile in verschiedenen Lebensbereichen eingesetzt wird. Und wir nutzen das jetzt auch, um das Phagengenom zu manipulieren.

Dies sind nur einige der wunderbaren Technologien, die die Art und Weise, wie wir heute über Phagen denken, verändert haben. Wenn wir über aktuelle Herausforderungen sprechen, sehen wir eine der Herausforderungen darin, das technische Bio-CRISPR eines Phagengenoms zu entwickeln. Das Phagengenom ist vollständig mit DNA-Modifikationen modifiziert, und die CRISPR-Kern-ACEs sind tatsächlich nicht in der Lage, die DNA zu spalten.

Das ist also wirklich eine Herausforderung, die wir meistern müssen, wenn wir die Genome von bakteriellen Phagen manipulieren wollen. Meine Gruppe hat einen völlig neuen Baustein von RNAs entdeckt. Wir haben entdeckt, dass spezifische Transkripte an ihrem fünf Primus, dem sogenannten Redox-Spektrum, Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid, kurz NAD, tragen, und wir haben dies auch kürzlich zum ersten Mal in E-coli T4-Phagen-Interaktionen entdeckt.

Basierend auf dieser Entdeckung haben wir auch herausgefunden, dass RNAs und Proteine auf völlig neuartige Weise miteinander interagieren können. Wir entdeckten, dass dieses NAD, das ich zuvor beschrieben habe, wie ein Molekülkleber funktioniert, um RNAs und Proteine miteinander zu verbinden. Diese RNA-Hochstimmung ist eine völlig neue Art und Weise, wie RNAs und Proteine in der Natur miteinander interagieren.

Und wir haben diese Entdeckung in der Öko-Anti-Phagen-Interaktion gemacht. Wir sind jetzt auch daran interessiert, diese Grundlagenforschung in Anwendungen zu überführen, zum Beispiel im Bereich der RNA-basierten Therapeutika. Behandeln Sie zunächst 500 Mikroliter Phagensuspension mit 20 Einheiten DNA 1.

Geben Sie zwei Mikroliter RNAs AT1 gemischt in das Röhrchen. Inkubieren Sie die behandelte Mischung 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Laden Sie anschließend 500 Mikroliter der behandelten Phagenlösung auf einen vorbereiteten Saccharosegradienten.

Zentrifugieren Sie den Gradienten bei 70.000 g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Beleuchten Sie das Zentrifugationsröhrchen von unten, um die trübe Phagenbande im Gradienten sichtbar zu machen. Entfernen Sie dann mit einer stumpfen Kanüle vorsichtig die Phagen-haltige Fraktion in ein neues Ultra-Ultrazentrifugationsröhrchen.

Geben Sie nun 30 Milliliter eiskalten TM-Puffer in das Röhrchen und zentrifugieren Sie. Dann wird das Pellet in 500 Mikrolitern TM-Puffer resuspendiert, nachdem der Überstand verworfen wurde. Lagern Sie die resuspendierten Phagen in einem Glasfläschchen bei vier Grad Celsius über Nacht.

Geben Sie ein Mikrogramm Proteinase K zu den resuspendierten Phagen. Inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie dann ein gleiches Volumen an Phenol, Chloroform, Isoamylalkohol zu der Probe.

Zum Mischen umdrehen und zentrifugieren. Die wässrige Phase in ein neues Reaktionsgefäß überführen und die Extraktion dreimal wiederholen. Führen Sie drei Chloroform-Rückextraktionen mit einem gleichen Volumen Chloroform durch, um restliches Phenol zu entfernen.

Dann fällen Sie die DNA aus, indem Sie 0,1 Volumen dreimolares Natriumacetat bei einem pH-Wert von 5,5 und 2,5 Volumen Ethanol hinzufügen. Inkubieren Sie die Mischung über Nacht bei minus 20 Grad Celsius. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Probe eine Stunde lang bei 15.000 g bei vier Grad Celsius, um die DNA zu pelletieren.

Waschen Sie das DNA-Pellet zweimal mit 200 Mikrolitern 70%igem Ethanol. Schütteln Sie das Röhrchen vorsichtig und zentrifugieren Sie erneut. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.

Dann Reanimation, suspendieren Sie die gereinigte DNA in ultrareinem Wasser. Lagern Sie die DNA bis zur weiteren Verwendung bei minus 20 Grad Celsius. Escherichia coli BL 21D 3-Zellen werden inokuliert, die sowohl mit dem PET 28 NGTet-Plasmid als auch mit einem CAS 12- oder CAS 9-Expressionsplasmid transformiert wurden.

Wachsen Sie die Kultur in LB-Medium mit entsprechenden Antibiotika bei 37 Grad Celsius unter Schütteln. Induzieren Sie die NG-TED-Expression durch Zugabe von 0,05 millimolaren IPTG und inkubieren Sie weitere zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Vergleichen Sie als Kontrolle E.coli BL 21 D3-Stämme mit und ohne NgTET-Überexpression.

300 Mikroliter der E.coli-Kulturen in ein steriles Röhrchen überführen. Infizieren Sie die Kultur entweder mit T4-Wildtyp oder NgTET-behandelten Phagen bei einer Infektionsmultiplizität von 0,01. Vorsichtig mischen, um eine gleichmäßige Verteilung der Phagen zu gewährleisten, und dann erneut inkubieren.

Geben Sie die Bakterien-Phagen-Mischung in vier Milliliter LB Soft Schnecke mit 0,75 % Schnecke und Antibiotika. Gründlich, aber vorsichtig mischen, um Blasenbildung zu vermeiden. Gießen Sie die weiche Schneckenmischung auf eine vorgewärmte LB-Schneckenplatte.

Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur kurz fest erstarren und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Zählen Sie am nächsten Tag die Plaques, um die Anzahl der plaquebildenden Einheiten zu bestimmen. Für die Indikatorauswahl infizieren Sie den E.coli Cast 13 A Spacer mit den Phagen, die als Zähler ausgewählt werden sollen.

Führen Sie die Indikatorauswahl unter den gleichen Bedingungen durch, die für die Mutagenese verwendet werden. Nach der Inkubation filtrieren Sie das SUP-Material durch einen 0,45-Mikrometer-Filter, um bakterielle Ablagerungen zu entfernen. Verwenden Sie die zählerselektierten und filtrierten Phagen für einen Plaque-Assay an einem E.coli B-Stamm, um einzelne Plaques für die nachgelagerte Validierung zu isolieren.

Die Phagenbande war deutlich sichtbar, wenn die T4-Phagenprobe ausreichend konzentriert war. Die Expression des NgTET-Proteins in E. coli wurde durch SDS-Phagen bestätigt, die sein Vorhandensein sowohl in löslichen als auch in unlöslichen Fraktionen nach Zelllyse und Zentrifugation zeigten. Chromatogramme zeigten, dass die relativen Häufigkeiten von Dioxiadenosin, Dijodhydroxychinolin und Thymidin zwischen Wildtyp- und NgTET-behandelter T4-Phagen-DNA unverändert waren.

Die Häufigkeit modifizierter Cytosinderivate war in der mit NgTET behandelten Phagen-DNA im Vergleich zur unbehandelten Probe signifikant reduziert. Ein Plasmid, das das NgTET-Gen und Homologieregionen für die gezielte Mutagenese enthält, wurde mittels Golden-Gate-Klonierung konstruiert. Das PCR-Screening bestätigte die erfolgreiche Amplifikation des Zielgens Stute in den Bahnen zwei bis neun des Agros-Gels, was auf positive Treffer bei den ausgewählten Plaques hinweist.

In der Wildtyp-T4-Phagen-DNA war die relative Häufigkeit von 5-Glykosylhydroxyethyl-2-Primdeoxidin hoch. In NgTET-behandelter T4-Phagen-DNA waren die Spiegel von 5 Glykosylhydroxyethyl 2-Prime-Deoxidin im Vergleich zum Wildtyp stark reduziert. T4-Phagen-DNA, die mit der katalytisch inaktiven Mutante NgTET D234 A behandelt wurde, behielt hohe Spiegel von 5-Glykolhydroxyethyl-2-Primdeoxidin auf.

Geborgene T-4-Phagen-Nachkommen zeigten im Vergleich zum Wildtyp nahezu wiederhergestellte Spiegel von 5-Hydroxymethyl-2-Primdeoxidin.