Name: Präzise Phagenmutagenese mit NgTET-assistierten CRISPR-Cas-Systemen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-14T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Lernen Sie die präzise Phagenmutagenese mit NgTET-assistierten CRISPR-Cas-Systemen zur effizienten und narbenfreien genetischen Modifikation von Bakteriophagen für biotechnologische und therapeutische Anwendungen.

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<ol><li>Pozhydaieva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+epigenome+modulation+enables+efficient+bacteriophage+engineering+and+functional+analysis+of+phage+DNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Temporal epigenome modulation enables efficient bacteriophage engineering and functional analysis of phage DNA modifications.</a> PLoS Genet. 20 (9), e1011384(2024).</li>
<li>Schroven, K., Aertsen, A., Lavigne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages+as+drivers+of+bacterial+virulence+and+their+potential+for+biotechnological+exploitation%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages as drivers of bacterial virulence and their potential for biotechnological exploitation.</a> FEMS Microbiol Rev. 45 (1), fuaa041(2021).</li>
<li>Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+applications+for+food+production+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage applications for food production and processing.</a> Viruses. 10 (4), 205(2018).</li>
<li>Wolfram-Schauerte, M., Pozhydaieva, N., Viering, M., Glatter, T., Hofer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+omics+reveal+time-resolved+insights+into+T4+phage+infection+of+E.+coli+on+proteome+and+transcriptome+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Integrated omics reveal time-resolved insights into T4 phage infection of E. coli on proteome and transcriptome levels.</a> Viruses. 14 (11), 2502(2022).</li>
<li>Usman, S. S., Uba, A. I., Christina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+genome+engineering+for+phage+therapy+to+combat+bacterial+antimicrobial+resistance+as+an+alternative+to+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage genome engineering for phage therapy to combat bacterial antimicrobial resistance as an alternative to antibiotics.</a> Mol Biol Rep. 50 (8), 7055-7067 (2023).</li>
<li>Vlot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+DNA+glucosylation+impairs+target+DNA+binding+by+type+I+and+II+but+not+by+type+V+CRISPR-Cas+effector+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage DNA glucosylation impairs target DNA binding by type I and II but not by type V CRISPR-Cas effector complexes.</a> Nucleic Acids Res. 46 (2), 873-885 (2018).</li>
<li>Tao, P., Wu, X., Tang, W. C., Zhu, J., Rao, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+bacteriophage+T4+genome+using+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering of bacteriophage T4 genome using CRISPR-Cas9.</a> ACS Synth Biol. 6 (10), 1952-1961 (2017).</li>
<li>Mohanraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+evolutionary+roots+and+mechanistic+variations+of+the+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.</a> Science. 353 (6299), aad5147(2016).</li>
<li>Zemach, A., McDaniel, I. E., Silva, P., Zilberman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+evolutionary+analysis+of+eukaryotic+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide evolutionary analysis of eukaryotic DNA methylation.</a> Science. 328 (5980), 916-919 (2010).</li>
<li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li>
<li>Shitrit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+marine+cyanophages+reveals+integration+but+not+lysogeny+in+T7-like+cyanophages%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of marine cyanophages reveals integration but not lysogeny in T7-like cyanophages.</a> ISME J. 16 (2), 488-499 (2022).</li>
<li>Dedrick, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+bacteriophages+for+treatment+of+a+patient+with+a+disseminated+drug-resistant+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus.</a> Nat Med. 25 (5), 730-733 (2019).</li>
<li>Marinelli, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRED%3A+a+simple+and+powerful+tool+for+constructing+mutant+and+recombinant+bacteriophage+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">BRED: a simple and powerful tool for constructing mutant and recombinant bacteriophage genomes.</a> PLoS One. 3 (12), e3957(2008).</li>
<li>Adler, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+CRISPR-Cas13a+enables+efficient+phage+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum CRISPR-Cas13a enables efficient phage genome editing.</a> Nat Microbiol. 7 (12), 1967-1979 (2022).</li>
<li>Pozhydaieva, N., Höfer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+Golden+Gate+assembly+to+streamline+CRISPR-Cas%2FNgTET-based+phage+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Utilizing Golden Gate assembly to streamline CRISPR-Cas/NgTET-based phage mutagenesis.</a> Methods Mol Biol. 2850, 329-343 (2025).</li>
<li>Ramírez Rojas, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DuBA.Flow%E2%94%80a+low-cost%2C+long-read+amplicon+sequencing+workflow+for+the+validation+of+synthetic+DNA+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">DuBA.Flow─a low-cost, long-read amplicon sequencing workflow for the validation of synthetic DNA constructs.</a> ACS Synth Biol. 13 (2), 457-465 (2024).</li>
<li>Lagerbäck, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+T4+endonuclease+II%2C+a+promiscuous+GIY-YIG+nuclease%2C+binds+as+a+tetramer+to+two+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage T4 endonuclease II, a promiscuous GIY-YIG nuclease, binds as a tetramer to two DNA substrates.</a> Nucleic Acids Res. 37 (18), 6174-6183 (2009).</li>
<li>Lagerbäck, P., Carlson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+residues+in+the+GIY-YIG+endonuclease+II+of+phage+T4+affecting+sequence+recognition+and+binding+as+well+as+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Amino acid residues in the GIY-YIG endonuclease II of phage T4 affecting sequence recognition and binding as well as catalysis.</a> J Bacteriol. 190 (16), 5533-5544 (2008).</li>
<li>Shembrey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+CRISPR-Cas13+mismatch+intolerance+enable+selective+silencing+of+point-mutated+oncogenic+RNA+with+single-base+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Principles of CRISPR-Cas13 mismatch intolerance enable selective silencing of point-mutated oncogenic RNA with single-base precision.</a> Sci Adv. 10 (51), eadl0731(2024).</li>
<li>Molina Vargas, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+design+strategies+for+ultra-specific+CRISPR-Cas13a-based+RNA+detection+with+single-nucleotide+mismatch+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">New design strategies for ultra-specific CRISPR-Cas13a-based RNA detection with single-nucleotide mismatch sensitivity.</a> Nucleic Acids Res. 52 (2), 921-939 (2024).</li>
<li>Shi, P., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+RNA+targeting+with+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Programmable RNA targeting with CRISPR-Cas13.</a> RNA Biol. 21 (1), 1-9 (2024).</li>
<li>Levin, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+population+and+evolutionary+dynamics+of+phage+and+bacteria+with+CRISPR-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The population and evolutionary dynamics of phage and bacteria with CRISPR-mediated immunity.</a> PLoS Genet. 9 (3), e1003312(2013).</li>
<li>Hershey, A. D., Chase, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+functions+of+viral+protein+and+nucleic+acid+in+growth+of+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage.</a> J Gen Physiol. 36, 39-56 (1952).</li>
<li>Bair, C. L., Rifat, D., Black, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exclusion+of+glucosyl-hydroxymethylcytosine+DNA+containing+bacteriophages+is+overcome+by+the+injected+protein+inhibitor+IPI%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Exclusion of glucosyl-hydroxymethylcytosine DNA containing bacteriophages is overcome by the injected protein inhibitor IPI.</a> J Mol Biol. 366 (3), 779-789 (2007).</li>
</ol>

Bakteriophagen sind Viren, die es spezifisch auf Bakterien abgesehen haben. Aufgrund ihres immensen Potenzials in der Biotechnologie und Medizin, insbesondere im Kampf gegen multiresistente Bakterien, haben sie großes Forschungsinteresse geweckt 1,2,3. Trotzdem ist die Phagenbiologie noch relativ wenig erforscht. Ein tieferes Verständnis der molekularen Mechanismen der Entführung ihrer bakteriellen Wirte ist unerlässlich, um ihr therapeutisches und biotechnologisches Potenzial voll auszuschöpfen4. Um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der effizienten Phageninfektion zugrunde liegen, und um die Phagen für spezifische Anwendungen zu entwickeln, ist die Fähigkeit, Phagengenome genetisch zu modifizieren, unerlässlich. Dennoch bleibt es eine der größten Herausforderungen auf dem Gebiet der Phagenbiologie 3,5,6.
Phagen-DNA wird oft durch spezifische chemische Veränderungen der Purin- und Pyrimidinbasen modifiziert, z. B. Cytosin-Glykosylierung und Methylierung. Diese Modifikationen schützen das genetische Material der Phagen vor der Erkennung und dem Abbau durch die Nukleasen des Wirts6. Während diese Modifikationen für die Fitness der Phagen entscheidend sind, stellen sie ein erhebliches Hindernis für Phagengenom-Engineering-Ansätze dar, die auf DNA-Targeting-Systemen beruhen 2,3,7.
Bestehende Mutagenese-Strategien, einschließlich Restriktions-Modifikations-Systeme und Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-CRISPR-assoziierte (Cas) Protein-basierte Technologien, stehen bei der Modifikation von Phagen-DNA aufgrund von schützenden epigenetischen Modifikationen wie der Cytosin-Glykosylierung vor erheblichen Herausforderungen8. Die CRISPR-Cas-vermittelte Genom-Editierung, die in bakteriellen und eukaryotischen Zellen hochwirksam ist, beruht auf zwei Schlüsselschritten: der präzisen Spaltung der DNA an bestimmten genomischen Loci durch die Cas-Nuklease, gefolgt von der DNA-Reparatur durch homologe Rekombination mit Spender-DNA, die die gewünschte Mutationträgt 1. In Phagen verhindern DNA-Modifikationen jedoch oft, dass Cas-Nukleasen das Genom binden oder effizient spalten können. Darüber hinaus kann die schnelle und vorübergehende Natur der Phagenreplikation die Effizienz der homologen Rekombination weiter einschränken. Diese Barrieren machen es besonders schwierig, die DNA-gerichtete CRISPR-Cas-Technologie für die Phagenmutagenese anzuwenden. Es wurde gezeigt, dass Phagen-DNA-Modifikationen das Targeting von Phagen-DNA mit CRISPR-Cas sowohl in vitro als auch in vivo beeinträchtigen 6,7.
Um die Herausforderungen zu bewältigen, die sich aus protektiven DNA-Modifikationen in Phagen ergeben, führen wir eine Genom-Mutagenese-Strategie ein, die sich die Aktivität der Zehn-Eleven-Translokation (TET) Methylcytosin-Dioxygenase, insbesondere NgTET, zunutze macht. In Eukaryoten katalysieren TET-Enzyme die schrittweise Oxidation von methyliertem Cytosin durch iterative Prozesse: Methylcytosin (5mdC) wird zunächst in Hydroxymethylcytosin (5hmdC), dann in Formylcytosin (5fdC) und schließlich in Carboxycytosin (5cadC) umgewandelt (Abbildung 1).
In unserem Phagen-Mutagenese-Ansatz wird NgTET verwendet, um die Häufigkeit schützender DNA-Modifikationen vorübergehend zu reduzieren und dadurch die Zugänglichkeit der Phagen-DNA für Genom-Editing-Werkzeuge wie Cas-Enzyme zu verbessern9. NgTET wurde für die Modulation des Bakteriophagengenoms ausgewählt, da zuvor über seine erfolgreiche Expression in aktiver löslicher Form in einem heterologen bakteriellen Wirt, insbesondere E. coli, berichtet wurde. Diese Eigenschaft ist essentiell, da NgTET während einer Phageninfektion aktiv bleiben muss10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69022/69022fig1v2.jpg"> 
Abbildung 1: Schrittweise Oxidation von 5-Methylcytosin durch TET-Dioxygenase1. Die TET-Dioxygenase katalysiert die sukzessive Oxidation von 5-Methyl-2'-Desoxycytidin (5mdC) zu 5hmdC, 5-Formyl-2'-Desoxycytidin (5fdC) und schließlich zu 5-Carboxyl-2'-Desoxycytidin (5cadC). Das Endprodukt, 5cadC, kehrt entweder spontan oder enzymatisch zu unmodifiziertem Cytosin (dC) zurück und trägt so zur dynamischen epigenetischen Regulation bei. Dieser mehrstufige Prozess ist für die aktive DNA-Methylierung in Eukaryoten von zentraler Bedeutung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69022/69022fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Da Methylcytosin und Hydroxymethylcytosin häufige Vorläufer von Phagen-DNA-Hypermodifikationen sind, einschließlich sperriger Schutzstrukturen wie Glykosylierungen, kann die oxidative Aktivität der TET-Dioxygenase genutzt werden, um die Bildung dieser DNA-Hypermodifikationen zu verhindern9. In diesem TET-basierten Genommutagenese-Ansatz exprimieren wir NgTET heterolog rekombinant in E. coli, um hydroxymethylierte Cytosine im Phagengenom nach einer Infektion zu oxidieren und dadurch die Bildung einer sperrigen Glykosylierung zu verhindern. Durch die Verringerung der Häufigkeit dieser sperrigen DNA-Modifikationen kann unser Ansatz die Zugänglichkeit der Phagen-DNA zu CRISPR-Cas-Nukleasen erhöhen. Diese verbesserte Zugänglichkeit ermöglicht eine effiziente Zielerkennung, eine präzise DNA-Spaltung und die Einführung narbenloser Punktmutationen in das Phagengenom und unterscheidet es von herkömmlichen Phagenmutagenesemethoden, die auf Gendeletionen, Reportergen-Insertionen oder der Integration künstlicher Verbindungen für die PCR-basierte Mutantenselektion beruhen 1,11. Diese konventionellen Strategien waren bisher die einzigen verfügbaren Werkzeuge für die gezielte Mutagenese im Phagengenom und stellen daher eine wichtige Grundlage für die hier vorgestellte Methode dar. Einzelne Phagenproteine können jedoch mehrere Funktionen besitzen. Die Deletion des gesamten Gens, das für ein Protein von Interesse kodiert, stört alle damit verbundenen Funktionen. Im Gegensatz dazu ermöglicht die gezielte Einführung von Punktmutationen die selektive Inaktivierung spezifischer Funktionen, die eine detaillierte Analyse ihrer Rolle ermöglichen. Bisher sind die Funktionen vieler Phagenproteine weitgehend uncharakterisiert; So können wir zusätzliche Aktivitäten übersehen, die mit einem bestimmten Gen verbunden sind. Daher wird ein minimalistischer Ansatz bevorzugt, der darauf abzielt, nur eine einzige Funktion zu entfernen und gleichzeitig minimale Veränderungen am Gesamtprotein zu verursachen12,13. Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht präzise genetische Modifikationen, ohne die gesamte genomische Organisation oder Funktion zu stören. Eine weitere große Herausforderung früherer Phagen-Mutagenese-Methoden war ihre geringe Effizienz, die typischerweise zu Mutationsraten von etwa 0,1 %1,11 führte. Mit dieser Technik stellen wir die erste Mutagenese-Strategie vor, die in der Lage ist, Single-Codon-Veränderungen einzuführen und so eine bemerkenswerte siebenfache Steigerung der Targeting-Effizienz zu erzielen. Durch die Kombination mit einer ONT-basierten Hochdurchsatz-Screening-Methode wird der Nachweis von Punktmutationen vereinfacht, wodurch die Notwendigkeit entfällt, große Phagenpopulationen zu screenen, um eine Mutante zu isolieren. Die hier beschriebene TET-basierte Mutagenese-Strategie behebt eine seit langem bestehende Einschränkung in diesem Bereich und ermöglicht eine zuverlässigere Genom-Editierung14.
Insgesamt kann diese Methode nicht nur dazu beitragen, unser Verständnis der Infektionsmechanismen von Bakteriophagen zu verbessern, sondern ist auch vielversprechend für die synthetische Biologie. Durch die Ermöglichung eines präzisen und effizienten Phagen-Genom-Engineerings ebnet es den Weg für die Anpassung der Phagen an spezifische Anwendungen und erhöht so ihr Potenzial für biotechnologische und medizinische Anwendungen.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Reaktionsgefäße</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Kanonialröhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Dünnwandige Polypropylen-Röhrchen mit offenem Oberkörper</td><td>Beckman Coulter Biowissenschaften</td><td>361706</td><td>16 mm x 95 mm (für Ultrazentrifugation)</td></tr><tr><td>50 mL kanonische Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>5x GC-Puffer</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>F519L</td><td></td></tr><tr><td>6x TriTrack DNA-Ladefarbstoff&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Nr. R1161</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Meridian BIOSCIENCE</td><td>BIO-41025</td><td>Molekulare Qualität</td></tr><tr><td>Avanti J-30I Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter Biowissenschaften</td><td>kein Katalog&nbsp; Zahl</td><td>Serien-Nr. JKY14M01, https://www.beckman.de/centrifuges/ultracentrifuges/optima-xe</td></tr><tr><td>Borsäure&nbsp;</td><td>Merck</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF v2</td><td>SCHNABEL</td><td>Nr. R3733S</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Hexahydrat</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>7774-34-7</td><td>97 %, extra rein&nbsp;</td></tr><tr><td>Zelldichte-Messgerät</td><td>Harvard Biochrom&nbsp;</td><td>80211630</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>12003154</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>Küvetten</td><td>Sarstedt</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Nr. D4540</td><td></td></tr><tr><td>Di-Natriumhydrogenphosphat</td><td>neoFroxx GmbH</td><td>7558-79-4</td><td>Pharma-Qualität</td></tr><tr><td>Einweg-Pasteur-Pipetten aus Glas</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td>ca. 230 mm</td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>10 U/&micro; L</td></tr><tr><td>dNTP-Mix (10 mM pro dNTP) &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72004</td><td></td></tr><tr><td>DS_SPcas_ModA</td><td>Hauseigenes Produkt.</td><td>https://github.com/MaikTungsten/CRISPRT4/tree/main/Plasmid_maps</td><td>Plasmidkonstrukt, das CRISPR-Cas12/ModA sgRNA enthält</td></tr><tr><td>DS-spCas (CRISPR-Cas9-System)</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>48645 (Addgene-Zubehörnummer)</td><td>Plasmid zur Konstruktion von spacerhaltigen CRISPR-Cas Plasmiden (CRISPR-Cas9 System) für die Phagenmutagenese (Schritt 3.2)</td></tr><tr><td>E. coli B-Stamm Stamm wurde für T4-Infektionen verwendet</td><td>DSMZ</td><td>kein Katalog&nbsp; Zahl</td><td>Escherichia coli (Migula 1895) Castellani und Chalmers 1919 (DSM 613, ATCC 11303)</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3) Expressionsstamm, kompetente Zelle</td><td>Invitrogen</td><td>C600003</td><td>Expressionsstamm, kompetente Zellen.</td></tr><tr><td>E. coli DH5&alpha; Klonierungsstamm, kompetente Zellen</td><td>Invitrogen</td><td>18265017</td><td>Klonierender Stamm, kompetente Zellen.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (absolut)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>200-578-6</td><td></td></tr><tr><td>Flongle-Durchflusszelle</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>kein Katalog&nbsp; Zahl</td><td>R10.4.1. Chemie, https://nanoporetech.com/document/flongle</td></tr><tr><td>Gene JET Plasmid Miniprep Kit&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>10242490</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA-Leiter</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Nr. SM1331</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler ULR DNA-Leiter&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Nr. SM1213</td><td></td></tr><tr><td>Gradient Master 108</td><td>BIOCOMP</td><td>kein Katalog&nbsp; Zahl</td><td>https://biocompinstruments.com/our-approach/gradient-forming</td></tr><tr><td>Heraeus Pico 17 Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002410</td><td></td></tr><tr><td>Infors HT Inkubator Minitron</td><td>Infors AG</td><td>kein Katalog&nbsp; Zahl</td><td>https://infors-ht.com/de/produkte/inkubationsschuettler/minitron#productspecs</td></tr><tr><td>Isopropyl-&beta;-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Carl Roth</td><td>Nr. T832.1</td><td></td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td>Carl-Roth</td><td>X969.1</td><td></td></tr><tr><td>LB-mittel (Luria/Miller)&nbsp;</td><td>Carl-Roth</td><td>X968.1</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>MinION-Gerät&nbsp;</td><td>Oxfrod Nanoporen-Technologien</td><td>kein Katalog&nbsp; Zahl</td><td>https://store.nanoporetech.com/eu/minion.html</td></tr><tr><td>ModA-E165A_fw</td><td>IDT</td><td>GAATTAGTTTCAGATGA ACAAGCGGTAATGATAC CAGCT</td><td>Forward Primer zur Einführung der Punktmutation für ModA E165A und zur Einführung von Sticky Ends für die Golden Gate Klonierung (Schritt 3.1)</td></tr><tr><td>ModA-E165A_rev</td><td>IDT</td><td>CATATTACGATAACGA TGACTATCCGGAAAC</td><td>Reverse Primer zur Einführung der Punktmutation für ModA E165A und zur Einführung von Sticky Ends für die Golden Gate Klonierung (Schritt 3.1)</td></tr><tr><td>ModA_sgRNA_Cas12_fw</td><td>IDT</td><td>TCTTGTTCATCTACAAC AGTAGAAATTAATTAA GTTCTTAGACCCG</td><td>Forward Primer zur Generierung von Spacer für CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 Systeme zur Phagenmutagenese und Gegenselektion (Schritt 3.2 und Schritt 4.1)</td></tr><tr><td>ModA_sgRNA_Cas12_rev</td><td>IDT</td><td>AGTAATGATAAAGAACT TTAAATAATTTCTACTGT TGTAGATGCTAC</td><td>Reverse Primer zur Erzeugung von Spacer für CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 Systeme zur Phagenmutagenese und Gegenselektion (Schritt 3.2 und Schritt 4.1)</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 Spektralphotometer&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AZY2019944</td><td></td></tr><tr><td>NucleoMag Bausatz&nbsp;</td><td>Machery Nagel</td><td>REF 744970.50</td><td></td></tr><tr><td>Nukleosid-Aufschluss-Mix&nbsp;</td><td>Neuengland Biolabore</td><td>M0649S</td><td></td></tr><tr><td>pBA560 (CRISPR-Cas13-System)</td><td>Addgene</td><td>186236 (Addgene-Zubehörnummer)</td><td>Plasmid-kodierendes CRISPR-Cas13-System für die Gegenselektion (Schritt 4.1)</td></tr><tr><td>pCpfl-sp-Plasmid (CRISPR-Cas12-System)</td><td>Addgene</td><td>122186</td><td></td></tr><tr><td>pCpfl-sp-Plasmid (CRISPR-Cas12-System)</td><td>Addgene</td><td>122186 (Addgene-Zubehörnummer)</td><td>Plasmid zur Konstruktion von spacerhaltigen CRISPR-Cas-Plasmiden (CRISPR-Cas12-System) für die Phagenmutagenese (Schritt 3.2)</td></tr><tr><td>PCR-Reaktionsgefäße</td><td>Sarstedt</td><td>72.991.002</td><td></td></tr><tr><td>PeqGREEN</td><td>VWR</td><td>732-3196</td><td></td></tr><tr><td>pET28a_NgTET&nbsp;</td><td>Hauseigenes Produkt.</td><td>kein Katalog&nbsp; Zahl</td><td>Plasmid ist auf Anfrage erhältlich, die Plasmidkarte finden Sie unter den folgenden https://zenodo.org/records/10615143&nbsp;</td></tr><tr><td>pET28a_NgTET&nbsp;</td><td>Hauseigenes Produkt.</td><td>kein Katalog&nbsp; Zahl</td><td>Plasmid für die Konstruktion von pET28a_NgTET_donor DNA mittels Golden Gate Klonierung (Schritt 3.1), Plasmid&nbsp; ist auf Anfrage erhältlich, die Plasmidkarte finden Sie unter den folgenden https://zenodo.org/records/10615143&nbsp;</td></tr><tr><td>Petriplatten</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td>92 x 16 mm mit Nocken</td></tr><tr><td>Phusion DNA-Polymerase&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>F-530XL</td><td>2 U/&Mikro; L</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td>Monobasic</td></tr><tr><td>PowerPac Universal-Netzteil</td><td>Bio Rad</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K&nbsp;</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>7528.1</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>28506</td><td></td></tr><tr><td>Quantus Fluormeter, QuantiFluor dsDNA-System</td><td>Promega</td><td>Nr. E2670</td><td></td></tr><tr><td>RNase A/T1&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0551</td><td>mischen Sie 2 mg/ml RNase A 5000 U/ml RNase T1&nbsp;</td></tr><tr><td>Roti-Aqua P/C/I für die DNA-Extraktion&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>Nr. X985.1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>SQK-LSK109 Ligations-Sequenzierungskit</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>kein Katalog&nbsp; Zahl</td><td>https://nanoporetech.com/document/gDNA-q-sqk-lsk109</td></tr><tr><td>Steritop Filter, 0,22 &Mikro; M Porengröße</td><td>Millipore</td><td>S2GPT05RE</td><td>250 mL und 500 mL</td></tr><tr><td>Streptomycin 50 mg/L</td><td>Carl Roth</td><td>HP66.1</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>NeoFroxx GmbH</td><td>57-50-1</td><td>für Molekularbiologie&nbsp;</td></tr><tr><td>Schwingschaufel Aluminiumrotor&nbsp;</td><td>Beckman Coulter Biowissenschaften</td><td>JS[1]24.15</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase 5 U/&micro; L</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>T4-DNA-Ligase-Puffer</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Nr. B69</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzgläser, dickwandig, randlos</td><td>Karl Hecht GmbH</td><td>42775054</td><td>100 mm x 18 mm</td></tr><tr><td>Thermocycler, T100</td><td>Biorad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer comfort&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Basis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad, VWB2&nbsp;</td><td>VWR</td><td>462-0557</td><td>12 L Volumen</td></tr></tbody></table>

präzise phagenmutagenese mit ngtet-assistierten crispr-cas-systemen

Precise Phage Mutagenesis with NgTET-Assisted CRISPR-Cas Systems

Identifizierung der Phagenbande im Gradienten. Die Sichtbarkeit der Phagenbande im Gradienten hängt von der Phagenkonzentration in der Ausgangsprobe ab, die auf dem Gradienten geladen ist. Wenn der Phagen ausreichend konzentriert ist (~&gt;1 × 1011 PFU/ml), kann die Bande deutlich gesehen werden, indem der Gradient von unten mit einer Lichtquelle beleuchtet wird (siehe Abbildung 3).
Bei niedrigen Phagenkonzentrationen kann es jedoch ...

Präzise Phagenmutagenese mit NgTET-assistierten CRISPR-Cas-Systemen

Bacteriophages, viruses that specifically target their bacterial hosts, hold significant potential for biotechnology and medicine, especially in combating ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Die Genotypisierung hier beschriebene Technik, die Paare fluoreszierende Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Gelelektrophorese Kapillare ermöglicht eine Hochdurchsatz-Genotypisierung von Nuklease-vermittelte knockout-Klone. Es umgeht die von anderen Genotypisierung Techniken konfrontiert Einschränkungen und kostengünstiger als Sequenzierungsverfahren ist.

Mit Hilfe eines Fluoreszenz-PCR-Kapillar-Gel-Elektrophorese-Technik CRISPR zum Genotyp / Cas9 vermittelte Knock-out Mutanten in einem Hochdurchsatz-Format

Jüngste Fortschritte in der Fähigkeit, somatische Zelllinien genetisch zu manipulieren, haben großes Potenzial für grundlegende und angewandte Forschung. Hier präsentieren wir zwei Ansätze für CRISPR / Cas9-produzierte Knockout-Produktion und Screening in Säugetierzelllinien, mit und ohne Verwendung von selektierbaren Markern.

Selektionsabhängige und unabhängige Erzeugung von CRISPR / Cas9-vermittelten Gen-Knockouts in Säugetierzellen

Dieses Protokoll beschreibt den Workflow eines CRISPR/Cas9-basierte Gens editing-System für die Reparatur von Punktmutationen in Säugetierzellen. Hier verwenden wir einen kombinatorischen Ansatz zur gen Bearbeitung mit einer detaillierten Follow-on experimentelle Strategie zur Messung von Indel Bildung an die Ziel-Site-Analyse im Wesentlichen vor-Ort-Mutagenese.

Eine Standardmethodik, vor-Ort-Mutagenität als Funktion der Punktmutation Reparatur katalysiert durch CRISPR/Cas9 und SsODN in den menschlichen Zellen zu untersuchen

Unter Verwendung einer vormontierten Cas9 ist Ribonucleoprotein Komplex (RNP) eine leistungsfähige Methode für präzise und effiziente Genom-Bearbeitung. Hier heben wir ihre Nützlichkeit in einem breiten Spektrum von Zellen und Organismen, einschließlich der primären humanen Zellen und sowohl klassische und neue Modellorganismen.

Verbesserte Genom Bearbeitung mit Cas9 Ribonucleoprotein in verschiedenen Zellen und Organismen

Hier präsentieren wir eine Methode, um das Genom von C. Elegans Ingenieur CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins und Homologie abhängigen Reparatur Vorlagen.

Eine schnelle und Facile Pipeline für die Erzeugung von Genomic Punkt Mutanten in C. Elegans verwenden CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR-Cas ist eine leistungsstarke Technologie, die komplexe Genome von Pflanzen und Tieren zu entwickeln. Hier zeigen wir ein Protokoll, das menschliche Genom mit verschiedenen Cas jedoch effizient zu bearbeiten. Wir markieren wichtige Überlegungen und Design-Parameter zur Optimierung der Bearbeitung Effizienz.

Genom-Bearbeitung in Säugetieren Zelllinien mit CRISPR-Cas

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Optimierung der CRISPR-Cas9 um eine höhere Spezifität verlustfrei auf-Aktivität zu erreichen. Wir verfolgen einen gerichteten Evolution genannt Sniper-Bildschirm, um einen Mutant Cas9 mit den gewünschten Eigenschaften zu finden. Sniper-Cas9 ist kompatibel mit gekürzten Single-Guide RNAs und Lieferung in einem Ribonucleoprotein Format, bekannte Strategien zur Erreichung höherer Besonderheiten.

Verwendung von Sniper-Cas9, Off-Target Auswirkungen von CRISPR-Cas9 ohne den Verlust der Zielaktivität durch gerichtete Evolution

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur nahtlosen Genbearbeitung in humanen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung eines piggyBac-basierten Donorplasmids und der Cas9-Nickase-Mutante. Zwei Punktmutationen wurden in Exon 8 des Hepatozyten-Kernfaktor-4-alpha-Locus (HNF4α) in humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) eingeführt.

Einführung von Punktmutationen in humane pluripotente Stammzellen durch nahtlose Genom-Editierung

Ziel dieses Protokolls ist es, eine nahtlose CRISPR/Cas9-Bearbeitung des C. elegans-Genoms unter Verwendung von zusammengesetzten Ribonukleoproteinkomplexen und dem dpy-10-Co-CRISPR-Marker für das Screening zu ermöglichen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine Vielzahl von genetischen Modifikationen in C. elegans vorzunehmen, einschließlich Insertionen, Deletionen, Genersatz und Codon-Substitutionen.

CRISPR/Cas9-Editierung des C. elegans rbm-3.2-Gens mit dem dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker und Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

Diese Arbeit liefert ein systematisch optimiertes Verfahren zur CRISPR/Cas9-Ribonuklease-basierten Konstruktion homozygoter Heuschreckenmutanten sowie eine detaillierte Methode zur Kryokonservierung und Reanimation der Heuschreckeneier.

Konstruktion homozygoter Mutanten der Wanderheuschrecke mittels CRISPR/Cas9-Technologie

Ein wesentliches Hindernis für Technologien wie CRISPR sind die Off-Target-Ereignisse, die lebenswichtige Gene stören können. "Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing" (CIRCLE-seq) ist eine Technik zur Identifizierung unbeabsichtigter Spaltstellen. Diese Methode bildet die genomweite Aktivität von CRISPR-Cas9 mit hoher Sensitivität und ohne Verzerrung ab.

CIRCLE-Seq zur Abfrage von Off-Target-Gen-Editing

Lernen Sie die präzise Phagenmutagenese mit NgTET-assistierten CRISPR-Cas-Systemen zur effizienten und narbenfreien genetischen Modifikation von Bakteriophagen für biotechnologische und therapeutische Anwendungen.

Präzise Phagenmutagenese mit NgTET-assistierten CRISPR-Cas-Systemen

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