Standardisierter SDS-PAGE-Workflow für personalisiertes Protein-Corona-Profiling bei der frühen Krebserkennung

Wir untersuchen, wie Nanopartikel mit dem Blut interagieren, um frühe Krebssymptome aufzudecken, mit dem Ziel eines einfachen, reproduzierbaren und überwiegend nicht-invasiven Diagnosetests. Zu Beginn verdünnen Sie die vier Milligramm pro Milliliter Standardlösung von Graphenoxid-Nanoplatten in ultrareinem Wasser auf die gewünschte Konzentration. Sonikieren Sie die verdünnte Lösung zwei Minuten lang bei 28 % Amplitude mit einer Pulseinstellung von acht Sekunden an und sechs Sekunden aus, um eine gleichmäßige Dispersion sicherzustellen.

Quantifizieren Sie die Konzentration der dispergierten Lösung mittels ultravioletter sichtbarer Spektroskopie. Anschließend wird die hydrodynamische Größe und das Zeta-Potenzial der Lösung mittels dynamischer Lichtstreuung mit einem 633-Nanometer-Helium-Neon-Laser gemessen. Verdünnen Sie die Probe in ultrareinem Wasser gemäß den QVet-Detektionsgrenzen.

Als Nächstes wird das kommerziell lyophilisierte menschliche Plasma bei Bedarf mit ultrareinem Wasser verdünnt. Zentrifugieren Sie das rekonstituierte Plasma bei 18.620 G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie das Supernatant und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung.

Quantifizieren Sie nun die Proteinkonzentration mit dem Bicinchoninsäure-Test, um die Plasmaverdünnung anzupassen und das optimale Nanopartikel-zu-Plasma-Verhältnis zu bestimmen. Mische das ausgewählte Volumen der Nanopartikel mit Plasma, um das Zielverhältnis zwischen beiden zu erreichen. Inkubieren Sie die Mischung eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Um die Proteinkorona zu isolieren, zentrifugieren Sie die Nanopartikelplasmaproben bei 18.620 G bei vier Grad Celsius für 15 Minuten. Waschen Sie das resultierende Pellet mit 200 Mikrolitern ultrareinem Wasser. Dann wieder suspendieren und erneut zentrifugieren.

Nach der abschließenden Waschung wird das Vorhandensein eines kompakten Pellets als Beweis für die Isolierung eines Nanopartikel-Proteinkomplexes bestätigt. Als Nächstes mischen Sie das Reduktionsmittel, den Ladepuffer und das Wasser, um das berechnete Volumen des Ladepuffers zu erreichen. Das Pellet wird im vorbereiteten Ladepuffer wieder aufgehängt.

Dann koche ich die Suspension 10 Minuten lang bei 100 Grad Celsius. Zentrifugiere die gekochte Probe bei 18.620 g bei vier Grad Celsius für 15 Minuten. Sammeln Sie das Supernatant in ein neues Rohr.

Bereiten Sie nun die Proteinleiter vor, indem Sie den Molekulargewichtsstandard im ungefärbten Puffer mit dem gefärbten Puffer verdünnen. Verdünne 10 x Tris-Glycin-SDS laufenden Puffer auf eine x Konzentration. Bauen Sie die Elektrophoresekammer mit einem Freiverlauf-Gel von vier bis 20 % Farbe zusammen.

Gießen Sie dann den laufenden Puffer ein, bis der vom Hersteller empfohlene Stand erreicht ist. Laden Sie 10 Mikroliter Probe in jedes Bohrloch. Dann pipettieren Sie sieben Mikroliter Leiter in jeden Brunnen.

Lasse das Gel etwa 90 Minuten bei Zimmertemperatur bei 150 Volt laufen. Speichere das Gel-Bild als TIFF-Datei im selben Ordner wie die Skripte. Dann öffne die Gel-Verarbeitung.

Ich bin in MATLAB. Geben Sie den Namen des Gel-Bildes als Bildname ein. Dann geben Sie den Index einer Leiterspur als Indexmarker ein.

Lies das Skript durch. Der Abschluss der Schritte wird im Befehlsfenster angezeigt und vier Fenster erscheinen auf dem Bildschirm. Öffne nun die Figur eins mit dem ursprünglichen Gelbild oben und der Korrektur für den schrägen Spureneffekt unten.

Ändern Sie die Werte für Linkskorrektur und Rechtskorrektur, um die Korrekturparameter abzustimmen. Öffne Figur zwei. Es enthält oben das für den schräge Lane-Effekt korrigierte Bild und unten das entfernte Hintergrundbild.

Passen Sie den Wert von BKG par X im Skript an, um die Hintergrundentfernung abzustimmen. Beachten Sie, dass alle identifizierten Spuren in Abbildung Zwei als vertikale weiße Linien markiert sind. Öffnen Sie nun Abbildung Drei, die das Intensitätsprofil der Markierungsspur mit den detektierten Spitzen links und einer nichtlinearen Anpassung mit R-Quadratwert rechts enthält.

Überprüfen Sie doppelt, ob die erwartete Anzahl der Bänder in der Leiterspur mit der Anzahl der für das Fitting verwendeten Spitzen übereinstimmt. Dann öffne Abbildung Vier, die die normalisierten Intensitätsprofile aller detektierten Spuren im Gel enthält. Setzen Sie den Exportparameter auf eins, um die Intensitätsprofile als Funktionen von Molekulargewichten in einer Excel-Datei zu exportieren.

Lies das Skript durch. Nach Abschluss wird im Arbeitsordner eine Excel-Tabelle erstellt, die die absoluten und normalisierten Profile als Funktionen des Molekulargewichts in der ersten Spalte enthält. Dann öffne die Gel Profiles Pro M-Datei und führe das Skript aus.

Vier Fenster erscheinen auf dem Bildschirm. Öffne Abbildung Fünf, die die absoluten Intensitätsprofile oben und die entsprechenden Gesamtintensitäten unten für jede Spur enthält. Und Abbildung Sechs, die die normalisierten Intensitätsprofile für jede Spur enthält.

Mit der Molekulargewichtsachse entsprechend den im Skript als Reg angegebenen Bereichen. Setze die Exportdaten auf eins, um die absoluten und normalisierten Integralflächen zu exportieren. Lies das Skript durch.

Nach Abschluss wird im Arbeitsordner eine Tabelle erstellt, die die exportierten absoluten und normalisierten Bereiche innerhalb der angegebenen Molekulargewichtsbereiche enthält. Zum Schluss öffne die Figur sieben und acht. Sie enthalten das Histogramm der absoluten und normalisierten Flächen für jede Spur, gruppiert nach Spur bzw. nach Fläche.

Das hier vorgestellte Protokoll etabliert einen standardisierten und reproduzierbaren Workflow zur Isolierung und Charakterisierung der Proteinkorona, die nach der Inkubation mit Plasma auf Nanopartikeln gebildet wird. Diese Methode liefert hochkonsistente SDS-Seitenprofile, die biologisch bedeutsame und diagnostisch relevante Merkmale jeder personalisierten Korona erfassen können. Die über alle Erkrankungen erhaltenen SDS-Seitenprofile waren hochgradig reproduzierbar.

Erhöhte Plasmakonzentrationen von 5 % auf 50 % führten zu stärkeren Signalintensitäten im Bereich von 30 bis 80 Kilodalton der SDS-Seitenprofile. Der automatisierte Pipettierungs-Workflow lieferte nahezu identische elektrophoretische Profile. Graphenoxid erzeugte konstant gut aufgelöste, stabile Koronaprofile, was auf seine hohe Oberfläche und geladenen Eigenschaften zurückzuführen ist.

Die Größenverteilungen von kleinen, mittleren und großen Graphenoxidproben waren schmal, nicht überlappend und konzentrierten sich auf 100, 300 bzw. 750 Nanometer. SDS-Seitenprofile von Protein-Coronas, die auf Graphenoxid gebildet wurden, waren in verschiedenen Größen ähnlich. Während deutliche Unterschiede zwischen verschiedenen Verdünnungen beobachtet wurden, führten niedrigere Plasmakonzentrationen zu intensiveren Bändern in spezifischen Molekulargewichtsbereichen, die auf selektive Proteinanreicherung hindeuten.

Bei intermediären Plasmaverdünnungen zeigten die Dichtemetrikprofile krankheitsspezifische Unterschiede, insbesondere im Bereich von 20 bis 30 Kilodalton, wo PDAC-Proben eine verminderte Signalintensität zeigten. Das SDS-seitenbasierte Profiling-Modell identifizierte allein sowohl PDAC- als auch Kontrollproben korrekt mit 83%iger Genauigkeit sowie ausgewogener Sensitivität und Spezifität. Das kombinierte Diagnosemodell, das SDS-Seiten-Koronaprofile und CA 19 bis neun Niveaus einbezieht, erreicht die höchste Genauigkeit, Sensitivität und Spezifität bei der Klassifikation von PDAC-Patienten.

Wir nutzen automatisierte Arbeitsabläufe, nicht-technologiebasierte Techniken und KI-gesteuerte Werkzeuge, um die krebsdiagnostische Forschung voranzutreiben. Unser Protokoll ist schnell, benutzerfreundlich und WHO-konform und gewährleistet standardisierte, reproduzierbare Protein-Corona-Fingerabdrücke mit hoher diagnostischer Relevanz.