Erforschung der Anwendung oberflächenverstärkter Raman-Streuung-basierter Biosensierung einzelner sEVs in der Krankheitsdiagnose und -therapie

Wir nutzen oberflächenverstärkte Raman-Streuung in Kombination mit maschinellem Lernen, um frühe Krebsdiagnostik zu untersuchen und auch biomedizinische Anwendungen bereitzustellen. Eine zentrale experimentelle Herausforderung ist die inhärente Heterogenität in Exosomenproben, die hochkomplexen, hochdimensionalen spektroskopischen Daten, die durch ein geringes Signal-Rausch-Verhältnis zusätzlich verstärkt werden. Zu Beginn pipettieren Sie etwa fünf Mikroliter der kleinen extrazellulären Vesikelprobe auf das vorgesehene plasmonische Substrat.

Lege das Substrat in einen Desikator, damit der Tropfen etwa 15 Minuten vollständig trocknet. Dann wird das getrocknete Substrat auf ein konfokales Raman-Mikroskop übertragen. Beginnen Sie mit der Instrumentensoftware WiRE Version 4.4 die Datenerfassung.

Stellen Sie den Anregungslaser auf 785 Nanometer bei fünf Milliwatt ein und kalibrieren Sie das System. Um Spektren vom Goldsubstrat zu erfassen, führt man einen Scouting-Scan über einen Bereich von 300 mal 300 Mikrometern durch, um einzelne Vesikel im statischen Modus mit einer Schrittweite von 10 Mikrometern, einer Belichtung von 0,1 Sekunden und 50 % Laserleistung zu lokalisieren. Sobald die Vesikel gefunden sind, führen Sie eine hochauflösende Kartierung im statischen Modus innerhalb eines fünf mal fünf Gitters mit einer Schrittweite von einem Mikrometer, 0,2 Sekunden Belichtung pro Punkt und 50 % Laserleistung durch.

Als Nächstes werden Spektren vom Graphensubstrat erfasst, indem folgende Scans durchgeführt werden. Screenen Sie die ursprünglichen rohen Spektren und schließen Sie alle aus, die übermäßiges Rauschen oder abnormale spektrale Formen zeigen. Wenden Sie auf jedes Spektrum einen Savitsk-Golay-Filter an, um den Fluoreszenzhintergrund zu reduzieren und die spektralen Daten zu glätten.

Berechnen Sie das Signal-Rausch-Verhältnis für jedes Spektrum entweder mit der Peak-zu-Baseline-Methode oder der Standardabweichungsmethode. Für jedes Spektrum berechnen Sie das Signal-Rausch-Verhältnis als das Verhältnis der Spitzenintensität nach der Basissubtraktion an einem repräsentativen Ramanband zur Standardabweichung des Rauschens. Schätzen Sie das Rauschen, indem Sie eine Savitsky-Golay-geglättete Version des Spektrums subtrahieren, wobei eine Fenstergröße von 11 und eine Polynomordnung von drei vom ursprünglichen Spektrum verwendet wird.

Alle Spektren in aufsteigender Reihenfolge des Signal-Rausch-Verhältnisses zu bewerten und die Persistenz diagnostischer Spitzen über die gerankten Spektren hinweg zu bewerten, um die Schwelle zu bestimmen. Dann setzen Sie den Schwellenwert an dem Punkt, an dem einer dieser Spitzen in das Basisrauschen übergeht, entsprechend einem Signal-Rausch-Verhältnis von 28. Spektren werden ausgeschlossen, die unter dem Schwellenwert des Signal-Rausch-Verhältnisses von 28 liegen, um sicherzustellen, dass nur hochwertige Spektren für die nachgeschaltete Analyse erhalten bleiben.

Und normalisiere jedes verbleibende Spektrum entweder auf seine maximale Spitzenintensität oder auf die Gesamtfläche unter der Kurve. Geben Sie jeder spektralen Messung basierend auf ihrem Ursprung ein Etikett, wie etwa einem Magenkrebspatienten oder einer gesunden Kontrollgruppe. Geben Sie die beschrifteten Spektraldaten in einen unterstützenden Vektorklassifikator mit einem linearen Kernel ein und wenden Sie eine geschichtete Shuffle Split für fünffache Kreuzvalidierung an, um eine ausgewogene Darstellung in jeder Falte sicherzustellen.

Jetzt werden die Genauigkeitskennzahlen über alle Falten hinweg gemittelt, um die Gesamtmodellleistung zu bewerten. Schließlich wird eine lineare Diskriminantenanalyse, oder LDA, verwendet, um die Dimensionalität des oberflächenverstärkten Raman-Streudatensatzes zur Visualisierung zu reduzieren. Verwenden Sie das trainierte lineare Diskriminantenanalysemodell, um eine direkte Klassifikation zwischen den Stichprobengruppen durchzuführen.

Raman-Spektren mit den entsprechenden durchschnittlichen Spektren zeigten unterschiedliche molekulare Signaturen über jeden Probentyp, die aus einzelnen kleinen extrazellulären Vesikeln aus Gewebe-, Blut- und Speichelproben gewonnen wurden. Die lineare Diskriminantenanalyse zeigte eine klare Clusterung der extrazellulären Vesikeldaten entsprechend ihrem Herkunftsgewebe, Blut oder Speichel. Die binäre Klassifikation mittels einer Unterstützungsvektor-Maschine erzielt die höchste Genauigkeit für Gewebeproben mit 90,1 %, gefolgt von Blut mit 70,9 % und Speichel mit 60,7 % LDA-basierte Klassifikation trennt klar getrennte gesunde und Magenkrebsproben in gewebeabgeleiteten extrazellulären Vesikeldaten.

Ähnliche LDA-basierte Klassifikationsaufteilungen für aus Blut und Speichel abgeleitete extrazelluläre Vesikeldaten zeigten eine weniger optimale Trennung zwischen gesunden und krebsbedingten Proben. Raman-Spektren von Doxorubicin-inkubierten Vesikeln ohne Graphen zeigten konstante Spitzen bei etwa 1.081, 1.206 und 1.440 inversen Zentimetern. Bei Graphen wurden ein zusätzlicher D-Peak bei etwa 1.350 inversen Zentimetern und ein G-Peak bei etwa 1.580 inversen Zentimetern beobachtet, die als interne Standards dienten.

Das Verhältnis des Doxorubicin-Peaks bei 442 inversen Zentimetern zum Graphen-G-Peak stieg mit höheren Wirkstoffkonzentrationen und längeren Inkubationszeiten. Wir haben eine biochemische Fingerabdrückung mit einem einzelnen Vesikel eingerichtet, um Krankheitsquellen zu unterscheiden, die Potenzial für eine frühzeitige Diagnose zeigen. Drei wichtige Vorteile unserer Technik.

Erstens ist es sehr empfindlich. Zweitens, es ist nicht invasiv. und drittens, es erfordert kein Lysieren oder physischen Abbau der Teilchen.

In Zukunft werden wir das spektrale Profil mit dem proteomischen Profil korrelieren, was wiederum helfen würde, den Exominhalt mit bestimmten Funktionen wie Zellkommunikation und Transport zu korrelieren.