Name: Epigenetisches Engineering von K562-Zellen: Dual-Vektor-Episomalstrategie für eine stabile gezielte DNA-Methylierung mit dCas9-DNMT3A- und -HDAC1-Fusionsproteinen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit einem dualen CRISPR/dCas9-Effektorsystem gezielte DNA-Methylierung in K562-Zellen durchführen. Diese episomale Methode ermöglicht stabile epigenetische Modifikationen ohne Genomintegration.

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<ol><li>Firdaus, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+explorations+of+neurological+disorders%2C+the+identification+methods%2C+and+therapeutic+avenues%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic explorations of neurological disorders, the identification methods, and therapeutic avenues.</a> Int J Mol Sci. 25 (21), 11658(2024).</li>
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<li>Nuñez, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+programmable+transcriptional+memory+by+CRISPR-based+epigenome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing.</a> Cell. 184 (9), 2503-2519.e17 (2021).</li>
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<li>Hofacker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+effector+domains+for+targeted+DNA+methylation+with+reduced+off-target+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Engineering of effector domains for targeted DNA methylation with reduced off-target effects.</a> Int J Mol Sci. 21 (2), 502(2020).</li>
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<li>Stavrou, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B2-globin+replicator+greatly+enhances+the+potential+of+S%2FMAR+based+episomal+vectors+for+gene+transfer+into+human+haematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The β-globin replicator greatly enhances the potential of S/MAR based episomal vectors for gene transfer into human haematopoietic progenitor cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 40673(2017).</li>
<li>Hagedorn, C., Antoniou, M. N., Lipps, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+cis-acting+sequences+improve+expression+and+establishment+of+a+nonviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Genomic cis-acting sequences improve expression and establishment of a nonviral vector.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 2 (8), e118(2013).</li>
<li>Stehle, I. M., Rupprecht, S., Cremer, T., Jackson, D. A., Lipps, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+mitotic+stability+of+an+extra-chromosomal+mammalian+replicon%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment and mitotic stability of an extra-chromosomal mammalian replicon.</a> BMC Cell Biol. 8, 33(2007).</li>
<li>Lufino, M. M. P., Manservigi, R., Wade-Martins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+S%2FMAR-based+infectious+episomal+genomic+DNA+expression+vector+provides+long-term+regulated+functional+complementation+of+LDLR+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An S/MAR-based infectious episomal genomic DNA expression vector provides long-term regulated functional complementation of LDLR deficiency.</a> Nucleic Acids Res. 35 (15), e98(2007).</li>
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<table><tbody><tr><td>Absolute Q DNA Digital PCR Master Mix (5x)</td><td>Angewandte Biosysteme</td><td>A52490</td><td></td></tr><tr><td>AgeI-HF&nbsp;</td><td>NEB</td><td>R3552</td><td></td></tr><tr><td>AscI</td><td>NEB</td><td>R0558</td><td></td></tr><tr><td>AseI</td><td>NEB</td><td>R0526</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>R3136</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Melodiezell-Sortierer</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bglll</td><td>NEB</td><td>R0144</td><td></td></tr><tr><td>BspEI</td><td>NEB</td><td>R0540</td><td></td></tr><tr><td>Desoxynukleotid (dNTP) Lösungsmischung (jeweils 10 mM)</td><td>NEB</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose mit stabilem Glutamin und Natriumpyruvatmedium</td><td>Biowest</td><td>L0103</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Polymerase I, großes (Klenow-)Fragment</td><td>NEB</td><td>M0210</td><td></td></tr><tr><td>DNMT3A (CD), HDAC1-Sequenzen</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq DNA-Polymerase&nbsp;</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>EP0712</td><td></td></tr><tr><td>EpiTect</td><td>Qiagen</td><td>59104</td><td>Bisulfit-Umwandlungskit&nbsp;</td></tr><tr><td>Epitect Bisulfit-Kit</td><td>Qiagen</td><td>59104</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I</td><td>NEB</td><td>R0734</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin-selektives Antibiotikum (G418-Sulfat)</td><td>Gibco</td><td>11811031</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000 Transfektionsset</td><td>Invitrogen</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>NEB&reg; &nbsp; 5-alpha Competent&nbsp;E. coli&nbsp; (Hohe Effizienz)</td><td>NEB</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>NEB&reg; &nbsp; 5-alpha F'Iq&nbsp; Competent&nbsp;E. coli&nbsp; (Hohe Effizienz)</td><td>NEB</td><td>C2992H</td><td></td></tr><tr><td>Nukleospin-Gewebe&nbsp;</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952.50</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 10x-Lösung pH 7,4</td><td>Lonza</td><td>BE17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung 100x</td><td>Biowest</td><td>L0022</td><td></td></tr><tr><td>pGuide-Vektor</td><td>OriGene Technologien</td><td>GE100042</td><td></td></tr><tr><td>Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol 25:24:1 Gesättigt mit 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td></td></tr><tr><td>Primer, sgRNAs&nbsp;</td><td>Eurofins</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Assay Design&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>Version 2.0</td><td>Bisulfit-Primer-Designtool&nbsp;</td></tr><tr><td>PyroMark Gold Q24 Reagenzien</td><td>Qiagen</td><td>970802</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark PCR-Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>978703</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q24 MDx</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Pyrosequencing Workstation&nbsp;</td></tr><tr><td>PyroMark Q24 Software&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>v2.0.8</td><td>Pyrosequenzierungssoftware&nbsp;</td></tr><tr><td>F5&reg; Hochpräzise DNA-Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0491</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect Reverse-Transkriptions-Kit</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio Absolute Q MAP16 Plattenkit</td><td>Angewandte Biosysteme</td><td>A52865</td><td>Digitales PCR-System&nbsp;</td></tr><tr><td>SYBR Green I Nukleinsäure-Gelfärbung, 10.000-fach Konzentrat in DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>T4-DNA-Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>T4-Polynukleotid-Kinase</td><td>NEB</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol-Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr></tbody></table>

epigenetisches engineering von k562-zellen: dual-vektor-episomalstrategie für eine stabile gezielte dna-methylierung mit dcas9-dnmt3a- und -hdac1-fusionsproteinen

Epigenetic Engineering of K562 Cells: Dual-Vector Episomal Strategy for Stable Targeted DNA Methylation using dCas9-DNMT3A and -HDAC1 Fusion Proteins

Epigenetisches Engineering von K562-Zellen: Dual-Vektor-Episomalstrategie für eine stabile gezielte DNA-Methylierung mit dCas9-DNMT3A- und -HDAC1-Fusionsproteinen

Investigating the precise role of DNA methylation in gene transcriptional regulation and developing therapies targeting specific gene methylation patterns ...

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Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit Hilfe eines Episoms basierend Neuprogrammierung Strategie und Histon-Deacetylase-Inhibitoren.

Effiziente iPS Zellgeneration aus Blut Mit Episomen und HDAC-Inhibitoren

Wir sind zwei Chemie-basierte Protokolle für die Kultivierung embryonalen Stammzellen der Maus ausführlich beschrieben. Diese neue Methode nutzt synergistische Mechanismen der Förderung Tet-vermittelten Oxidation (durch Vitamin C) und de-Novo -Synthese von 5-Methylcytosine (durch PD0325901) zu unterdrücken, um DNA-Hypomethylierung und Pluripotenz von embryonalen Stammzellen der Maus zu erhalten.

Eine Alternative Kultur-Methode, um genomische Hypomethylierung von embryonalen Stammzellen der Maus mit MEK-Inhibitor PD0325901 und Vitamin C aufrechtzuerhalten

Detaillierte Protokolle für die Einführung ein veränderter Split-TET2 Enzym (Apfelwein) in Säugerzellen für chemische induzierbaren DNA-Hydroxymethylation und epigenetische Umbau werden vorgestellt.

Ein veränderter Split-TET2 Enzym für chemische-induzierbaren DNA Hydroxymethylation und epigenetische Umbau

Verordnung der Chromatin-Umgebung ist ein wesentlicher Prozess erforderlich für die ordnungsgemäße Genexpression. Hier beschreiben wir eine Methode zur Steuerung der Genexpression durch die Rekrutierung von Chromatin-modifizierende Maschinen Gen-spezifischen und reversibel.

Gentranskription durch Umleiten zellulären Maschinerie mit chemischen epigenetische Modifikatoren zu unterdrücken

Gezielte DNA Epigenom Bearbeitung stellt eine leistungsstarke Therapieansatz. Dieses Protokoll beschreibt die Produktion, Reinigung und Konzentration der all-in-One Lentivirale Vektoren beherbergen das CRISPR-dCas9-DNMT3A Transgen für Epigenom-editing-Anwendungen in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSC)-Neuronen abgeleitet.

Lentivirale Vektor-Plattform für die effiziente Bereitstellung von Epigenom-editing-Tools in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Krankheitsmodelle

Wir stellen hier eine Methode vor, die die Verwendung von chemischer epigenetischer Auslöschung mit mechanosensing-bezogenen Hinweisen kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren effizient zu erzeugen, ohne dass Gentransfektion oder retrovirale Vektoren erforderlich sind. Diese Strategie ist daher vielversprechend für die translationale Medizin und stellt einen bemerkenswerten Fortschritt in der Stammzellorganoidtechnologie dar.

Eine zweistufige Strategie, die epigenetische Modifikation und biomechanische Hinweise kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren zu erzeugen

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die in vitro Selektion von technisch hergestellten Transkriptionsrepressoren (ETRs) mit hoher, langfristiger, stabiler On-Target-Silencing-Effizienz und geringer genomweiter Off-Target-Aktivität vor. Dieser Arbeitsablauf ermöglicht es, ein anfängliches, komplexes Repertoire von ETR-Kandidaten auf eine kurze Liste zu reduzieren, die für die weitere Evaluierung in therapeutisch relevanten Umgebungen geeignet ist.

In vitro Auswahl von modifizierten Transkriptionsrepressoren für gezieltes epigenetisches Silencing

Neue Strategien zur getreuen Modellierung somatischer Mutationen in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) sind notwendig, um die hämatopoetische Stammzellbiologie und hämatologische Malignome besser zu untersuchen. Hier wird ein Protokoll zur Modellierung heterozygoter Gain-of-Function-Mutationen in HSPCs durch Kombination der Verwendung von CRISPR/Cas9 und dualer rAAV-Donortransduktion beschrieben.

Entwicklung onkogener heterozygoter Gain-of-Function-Mutationen in humanen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen

Das Protokoll beschreibt Methoden zur CRISPR-basierten Epigenom-Editierung (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) in humanen Zelllinien unter Verwendung von Plasmid-DNA-Transfektion und mRNA-Nukleofektion.

CRISPR-Epigenom-Editierung in menschlichen Zellen mittels Plasmid-DNA-Transfektion und mRNA-Nukleofektion

Es wird ein detailliertes Protokoll für die Verwendung der CRISPR/Cas9-Technologie zur Erzielung eines hocheffizienten gezielten Knock-ins von großen, multicistronischen Konstrukten in primären humanen T-Zellen über den Homologie-vermittelten Endverbindungsweg (HMEJ) zur Verfügung gestellt. T-Zellen, die mit diesem cGMP-adaptierbaren Protokoll hergestellt wurden, behalten eine hervorragende Zellexpansion, Zytotoxizität und Zytokinproduktion bei.

Nicht-virales Engineering von primären humanen T-Zellen durch Homologie-vermittelte Endverknüpfung und gezielte Integration großer DNA-Templates

Erfahren Sie, wie Sie mit einem dualen CRISPR/dCas9-Effektorsystem gezielte DNA-Methylierung in K562-Zellen durchführen. Diese episomale Methode ermöglicht stabile epigenetische Modifikationen ohne Genomintegration.

Epigenetisches Engineering von K562-Zellen: Dual-Vektor-Episomalstrategie für eine stabile gezielte DNA-Methylierung mit dCas9-DNMT3A- und -HDAC1-Fusionsproteinen (Video) | JoVE Journal

Epigenetisches Engineering von K562-Zellen: Dual-Vektor-Episomalstrategie für eine stabile gezielte DNA-Methylierung mit dCas9-DNMT3A- und -HDAC1-Fusionsproteinen

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