Epigenetisches Engineering von K562-Zellen: Dual-Vektor-Episomalstrategie für eine stabile gezielte DNA-Methylierung mit dCas9-DNMT3A- und -HDAC1-Fusionsproteinen

Unsere Forschung zielt darauf ab, ein stabiles, nicht-integriertes System für gezielte DNA-Methylierung zu entwickeln und dauerhafte epigenetische Bearbeitung in K562-Zellen zu erforschen. Jüngste Fortschritte auf diesem Gebiet umfassen duale Effektor-CRISPR-dCas9-Systeme, die epigenetische Enzyme für synergistische, stabile und lokal spezifische epigenetische Modifikation kombinieren. Zu Beginn werden die K562-Zellen in T75-Kulturkolben bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und befeuchteten Bedingungen aufbewahrt.

Quantifizieren Sie die episomale DNA, die für die Transfektion verwendet wird, mit einem Spektrophotometer bei 260 Nanometern. Verwenden Sie acht Mikrogramm Gesamtplasmid-DNA pro Transfektion, indem Sie vier Mikrogramm jedes Plasmids für eine Ko-Transfektion vorbereiten und die erforderliche Menge mit 90 Mikrolitern ultrareinem Wasser mischen. Gib nun 10 Mikroliter 3-molare Natriumacetatlösung und 2,5 Bände 100%-Ethanol zur verdünnten DNA-Lösung hinzu.

Mischen Sie die DNA-Lösung gründlich und bebrüten Sie sie über Nacht bei 20 Grad Celsius, um die DNA-Ausfällung zu ermöglichen. Am folgenden Tag wird das DNA-Niederschlagsrohr bei 11.000 G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Unter sterilen Bedingungen in einem Biosicherheitsschrank entsorgen Sie das Supernatant vorsichtig aus dem Rohr.

Gib 500 Mikroliter 70%-Ethanol in das Rohr, um das Pellet zu waschen, und zentrifugiere erneut bei 11.000 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Als Nächstes entferne ich das Ethanol-Supernatant vollständig aus dem Röhrchen und lass das DNA-Pellet an der Luft trocknen, bis kein sichtbares Ethanol mehr übrig ist. Anschließend wird das getrocknete DNA-Pellet gründlich in 50 Mikrolitern DMEM erneut suspendiert.

Bewahren Sie 400 Nanogramm der neu suspendierten DNA etwa 2,5 Mikroliter in einem neuen Rohr auf und lagern Sie die Plasmid-DMEM-Lösung bei vier Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung. Führen Sie die verbleibende DNA-Probe mit einem 1%-Agarose-Gel durch, um die DNA-Reinigung und -Integrität zu überprüfen. Entnehmen Sie K562-Zellen aus einem T75-Kolben, wenn die Kulturen eine Konfluenz von 50 bis 60 % erreichen, um eine optimale Transfektionseffizienz sicherzustellen.

Zählen Sie die entnommenen Zellen mit einem Hämozytometer und übertragen Sie ein Volumen mit zweimal zehn Zellen in der Stärke von fünf Zellen in eine 35-Millimeter-Kulturschale mit 900 Mikrolitern DMEM ohne FBS oder Antibiotika. Stellen Sie die Kulturschale in einen 37-Grad-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid, um die Zellen in einem transfektiven Zustand zu halten. Verwenden Sie ein auf Lipofectamin basierendes Transfektionsset, um Plasmide gemäß den Anweisungen des Herstellers zu verabreichen und bei Bedarf das Volumen anzupassen.

Fügen Sie drei Mikroliter P3000-Reagenz zur zuvor vorbereiteten Plasmid-DMEM-Lösung hinzu. Sanft rühren und die Mischung fünf Minuten lang bei Zimmertemperatur bebrüten. Fügen Sie nun fünf Mikroliter Lipofectamine 3000-Reagenz zusammen mit genügend DMEM hinzu, um ein Endvolumen von 100 Mikrolitern zu erreichen.

Inkubieren Sie diese Transfektionsmischung bei Zimmertemperatur für 15 Minuten. Geben Sie die vollen 100 Mikroliter der Transfektionsmischung in die 35-Millimeter-Kulturschale mit den Zellen. Schütteln Sie das Gericht vorsichtig, um die Mischung gleichmäßig zu verteilen, und bringen Sie es dann zurück in den Inkubator.

24 Stunden nach der Transfektion werden drei Milliliter volles DMEM mit 10 % FBS und einmal Penicillin-Streptomycin zu jeder Schale hinzugefügt, um die Proliferation der transfektierten Zellen zu fördern. 72 Stunden nach der Transfektion beginnen Sie mit der Selektion, indem Sie G418-Antibiotikum hinzufügen, um eine Endkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter zu erreichen. Sobald der Selektionsprozess etabliert ist und die Gesamtzellanzahl eins mal zehn mal sechs übersteigt, entnehmen Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 G für sechs Minuten bei 25 Grad Celsius.

Waschen Sie das Pellet einmal mit einmaliger steriler PBS, pH-Wert etwa 7,4, und zentrifugieren Sie erneut unter denselben Bedingungen. Nach dem Wiederaufhängen des finalen Zellpellets in einmalige PBS wird die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer bestimmt. Verdünnen Sie die Suspension auf einmal zehn auf die Potenz von sechs Zellen pro Milliliter, um sicherzustellen, dass die Zellen vollständig wieder suspendiert sind, und übertragen Sie die Zellen in ein Durchflusszytometrierohr.

Als Nächstes richten Sie den fluoreszenzaktivierten Zellsortierer in den Einzelzellmodus ein, wobei eine 96-Well-Gewebekultur-behandelte Platte als Sammelgerät verwendet wird. Passe die Softwareeinstellungen je nach verwendetem Instrument an. Gatet die Primärpopulation, indem Zellen basierend auf Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung ausgewählt werden, um erwartete Größe und Granularität zu isolieren.

Schließen Sie Trümmer und hochgranulare oder tote Zellen aus und verwenden Sie Vorwärtsstreufläche versus Höhe oder Seitenstreufläche versus Höhendiagramme zum Gate-Singlets. Anschließend wird jede Mulde der 96-Bohrloch-Platte mit 100 Mikrolitern vollem Medium vorgefüllt, das einen Milligramm G418 pro Milliliter enthält, und die Platte in einem 37-Grad-Inkubator erhitzt. Führen Sie Zellsortierung im Einzelzellmodus durch und halten Sie die Sortierrate unter 300 Ereignissen pro Sekunde, um die Genauigkeit zu verbessern.

Nach der Sortierung inspizieren Sie jeden Brunnen unter einem Mikroskop, um das Vorhandensein einer einzelnen Zelle pro Bohrloch zu bestätigen, und setzen Sie die Platte in einen 37-Grad-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Lassen Sie die Einzelzellklone einzeln in der 96-Well-Platte expandieren. Sobald das klonale Wachstum sichtbar ist, geben Sie den Bohrlöchern ein Medium mit reduziertem G418 auf eine Endkonzentration von 400 Mikrogramm pro Milliliter zu, um den Selektionsdruck aufrechtzuerhalten.

Übertragen gut wachsende Klone nacheinander auf 12-Well-Platten, dann auf T25-Flaschen und schließlich auf T75-Kolben bei Bedarf, bis jeder Klon etwa ein mal 10 auf die Leistung von sechs Zellen erreicht. Als Nächstes sammle Doppelzell-Pellets in regelmäßigen Abständen. Lagere ein Pellet bei minus 20 Grad Celsius für die genomische DNA-Extraktion.

Homogenisieren Sie ein zweites Pellet in 500 Mikrolitern Trizol-Reagenz und lagern Sie es bei minus 20 Grad Celsius für RNA-Extraktion und komplementäre DNA-Synthese. Genomische DNA aus ausgewählten Klonen mit Phenol-Chloroform-Extraktion und anschließend Ethanol-Präzipitation extrahieren. Die extrahierte DNA wird vollständig in nukleasefreiem Wasser oder TE-Puffer wieder suspendiert.

Missen Sie die DNA-Konzentration und Reinheit mit einem Spektrophotometer, bevor Sie mit den nachfolgenden Schritten fortfahren. Abschließend wird die gesamte RNA aus den gespeicherten Zellpellets mit TRIzol-Reagenz extrahiert, gefolgt von Isopropanol-Ausfällung. Einzelzellen wurden in 96-Well-Platten mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung sortiert, um diejenigen zu isolieren, die beide Konstrukte trugen.

Die PCR-Analyse von 10 expandierten Klonen bestätigte, dass nur einige beide Konstrukte behielten, was durch Bänder mit 230 Basenpaaren und 205 Basenpaaren angezeigt wurde. Die Pyrosequenzierung zeigte, dass der positive Klon zwei eine erhöhte Methylierung an mehreren CPG-Stellen in der Nähe der gRNA1-Zielregion im Vergleich zur nicht transfektierten Kontrollgruppe zeigte. Wir gehen auf den Mangel an nicht integrierten Langzeitabgabesystemen ein, die präzise, stabile epigenetische Bearbeitung ermöglichen, ohne das Wirtsgenom zu verändern.

Unsere Ergebnisse schaffen ein zuverlässiges Werkzeug zur Untersuchung der Genregulation durch Zielmethylierung und unterstützen die Entwicklung möglicher präziser epigenetischer Therapien. Zukünftige Forschungen werden die Verbesserung der episomalen Abgabe, die Minimierung der Zieleffekte, die Verbesserung der Cas9-Effizienz und die Anpassung des Systems an primäre oder in vivo Modelle untersuchen.