Amyloid und die Cross-Beta-Architektur

Unsere Forschung nutzt die Röntgenfaserbeugung, um die Struktur des Kreuz-Beta-Amyloidfibrills und deren molekulare Organisation zu untersuchen. Dieses Protokoll verwendet Röntgenfaserbeugung, um Cross-Beta-Muster zu bestätigen und Fibrillarchitekturen zu klären. Dieses Protokoll ermöglicht die strukturelle Analyse von Amyloidfibrillen von der Bestätigung der Cross-Beta-Organisation bis zur Aufklärung weiterer molekularer Details.

Zu Beginn richten Sie die Protein- oder Peptidfibrillen so aus, dass ein Bündel entsteht, dessen Faserachsen idealerweise alle parallel verlaufen. Schmelze Kerzenwachs mit einer heißen Platte, bis es verflüssigt ist. Schneiden Sie mit einem Glasfräser 1 Millimeter Borosilikat-Glaskapillaren auf eine Länge von etwa 2–3 Zentimetern.

Tauchen Sie die abgeschnittenen Kapillaren kurz in das flüssige Wachs. Dann zieht man das Kerzenwachs durch Kapillarwirkung auf etwa 1–2 Millimeter innerhalb der Kapillare auf. Verwenden Sie nun Plastilin, um die versiegelten Kapillaren horizontal in einer Petrischale zu befestigen.

Halten Sie einen Abstand von 0,5–2 Millimetern zwischen den mit Wachs gefüllten Enden der Kapillaren. Mit einer Pipette wird vorsichtig ein 10-Mikroliter-Tropfen Fibrilllösung zwischen den mit Wachs gefüllten Enden der beiden Kapillaren aufgehängt. Decken Sie die Petrischale ab, um die Probe vor Staub zu schützen, und lassen Sie sie über Nacht verdunsten.

Dann versiegeln Sie den Teller, um eine kontrollierte Trocknungsumgebung zu gewährleisten. Um die Amyloidfibrillen in einer Glaskapillare auszurichten, befestigt eine 1-Milliliter-Spritze mit Gummischlauch am breiten Ende einer 0,7-Millimeter-Durchmesser silikonierten Glaskapillare. Aspirieren Sie 2–3 Zentimeter Fibrillsuspension in die Kapillare.

Versiegeln Sie ein Ende der Kapillare mit geschmolzenem Wachs und lassen Sie das andere Ende offen, um die Verdunstung zu ermöglichen. Richten Sie die Kapillare vertikal an und lassen Sie sie trocknen, bis eine getrocknete Scheibe entsteht. Um Fibrillen als Matte oder dünne Schicht auszurichten, legen Sie eine hochkonzentrierte Fibrillprobe auf einen Glasobjektträger und decken Sie sie ab, bevor Sie 24 Stunden an der Luft trocknen.

Stellen Sie das Fibrillenbündel-Stockwerk vorsichtig auf einen Goniometerkopf und richten Sie es so aus, dass der Röntgenstrahl durch das Bündel hindurchgeht. Wenn Sie eine Fibrillenmatte verwenden, richten Sie sie so aus, dass der Röntgenstrahl den Rand der Matte durchquert. Untersuchen Sie die Probe unter einem Lichtmikroskop, das mit einem Kreuzpolarisationsfilter ausgestattet ist, um die Doppelbrechung zu beobachten.

Positioniere die Probe im Röntgenstrahl basierend darauf, ob es sich um ein Faserbündel, eine Matte oder eine Scheibe handelt. Sammeln Sie ein Beugungsmuster mit hauseigenen Röntgengeräten oder Synchrotronstrahlung. Um die Datenanalyse durchzuführen, laden Sie die Datei in die CLEARER-Software zur Beugungsmusteranalyse hoch.

Navigieren Sie zu Beugungsmuster und Beugungseinstellungen, um Beugungseinstellungen einzugeben, einschließlich Pixelgröße, Röntgenquelle und Abstand zwischen Probe und Detektor. Klicken Sie auf Bildverarbeitung und Drehen, um das Beugungsbild so zu drehen, dass der Meridian vertikal ist. Verwenden Sie das Zentrierungsmodul, indem Sie zum Beugungsmuster navigieren und auf Bild zentrieren klicken, um das Bild zu zentrieren.

Definiere die Meridian- und Äquatornachsen. Speichern Sie das zentrierte Bild für eine spätere Analyse. Als Nächstes geben Sie einen geeigneten Winkel entlang des Meridians und des Äquators an.

Klicken Sie auf das Beugungsmuster und dann auf das Modul Radially Average, um ein Diagramm der Position des Beugungssignals zu erzeugen. Versus Intensität. Navigieren Sie vom Menü "Diffraction Pattern" zum Peak Find-Modul, um das Beugungssignal zu messen und automatisch auszugeben.

Passen Sie die maximale Suchbreite an, um echte Signale ohne Rauschen zu erkennen. Nutzen Sie die Option Zoom and Measure, um die Position des Beugungssignals mit Peak Find zu überprüfen. Untersuchen Sie mögliche Einheitszelldimensionen mit dem Modul Einheitszelloptimierung.

Geben Sie Anfangsschätzungen basierend auf starken äquatorialen Signalen ein und definieren Sie die Mindest- und Maximalindizes für die Zellsuche. Berechnen Sie die Dimensionen der potenziellen Einheitszelle und vergleichen Sie die vorhergesagten Beugungssignalpositionen mit den beobachteten Reflexionen. Wählen Sie die Einheitszelle aus, die am besten zu den Daten und der Probe passt.

Um molekulare Modelle zu erstellen, werden 3D-Anordnungen der Peptide in einer Beta-Sheet-Konfiguration erstellt, die zur bestimmten Einheit passt. Stellen Sie sicher, dass alle symmetriebezogenen Komponenten enthalten sind. Als Nächstes klicken Sie auf Diffraction Simulation und anschließend auf Structures and Structure Chain Generator und laden Sie das PDB-Modell.

Weisen Sie die Faserachse und die Strahlachse zu, geben Sie die Zelleinheiten ein und prüfen Sie dann auf sterische Kollisionen. Navigieren Sie zur Beugungssimulation und klicken Sie auf Faserbeugungssimulation, um die PDB-Koordinaten in das Faserbeugungssimulationsmodul hochzuladen. Geben Sie die Richtung der Faserachse, die Strahlorientierung, die Einheitszellmaße, die Röntgenquelle und die Detektoreinstellungen ein und klicken Sie dann auf Simulieren, um die Simulation durchzuführen.

Stellen Sie sicher, dass die Strahlachse senkrecht zur Faserachse steht. Dann gehe ich zu Datei und klicke auf Speichern Unter, um die Simulationseinstellungen als HTML-Dateien für spätere Bearbeitungen zu speichern. Speichere das simulierte Beugungsmuster im RAW-Format oder als TIFF-Datei.

Vergleichen Sie das simulierte Muster mit dem experimentellen Beugungsmuster. Messen Sie simulierte Beugungssignale mit demselben Analyse-Workflow. Zeichnen Sie diese Werte auf und vergleichen Sie diese mit experimentellen Daten.

Elektronenmikroskopographien zeigten eine hohe Dichte von Amyloidfibrillen auf dem Gitter, die für die Herstellung einer Röntgenfaserprobe geeignet sind. Stretchframe-ausgerichtete Fasern erzeugten ein charakteristisches Cross-Beta-Beugungsmuster mit einer meridianalen Reflexion bei 4,76 Ångström und äquatorialen Reflexionen, die sich aus Kettenlänge, Blattabstand und Protofilamentgröße ergeben. Ein idealisiertes Kreuz-Beta-Beugungsmuster zeigte, dass meridianale und äquatoriale Reflexionen mit wiederholten Abständen entlang der Faserachsen korrespondieren.

Ein gut zentriertes Beugungsmuster war symmetrisch, wobei sich äquatoriale und meridianale Gipfel in ihrer Position überlappten. Beugungsspitzen wurden automatisch erkannt und mittels Peakfinding-Analyse aufgelistet. Die detektierten Beugungsspitzen wurden verwendet, um plausible Einheitszellgrößen zu identifizieren.

Ein Strukturmodell wurde mit der identifizierten Einheitszelle erstellt und vor der Beugungssimulation visualisiert. Simulierte Beugungsdaten, die aus dem vorgeschlagenen Strukturmodell generiert wurden, zeigten eine angemessene Übereinstimmung mit dem experimentellen Beugungsmuster sowohl in Reflexionspositionen als auch in relativen Intensitäten. Das Überlagern simulierter und experimenteller Beugungsmuster zeigte die Ausrichtung entsprechender Reflexionen weiter.

Eine korrekte Stichprobenausrichtung ist entscheidend, da sie die Qualität der Beugungsdaten und der daraus gewonnenen Informationen bestimmt. Diese Arbeit ermöglicht atomare Auflösungsstrukturmodellierung und Integration mit anderen Strukturtechniken wie AFM, um detaillierte molekulare Strukturen zu ermöglichen.