In-vitro Rekonstitution der bakteriellen Ubiquitination und VCP/p97-vermittelte Elimination

Unsere Arbeit zeigt, wie VCP oder p97 als zytosolischer Verteidiger gegen verschiedene Krankheitserreger wirkt. Dies erschließt das Potenzial von VCP oder p97 für therapeutische Anwendungen und Bioengineering-Strategien. Neben der routinemäßigen Biochemie werden Superauflösungsmikroskopie, Kryo-EM und Kryo-ET eingesetzt, um herauszufinden, wie sich diese Wirtseffektoren auf den Erreger organisieren, um sie zu zerstören.

Zu Beginn werden die Streptokokken-Pneumonie über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid im Todd-Hewitt-Hefemedium gezüchtet. Inokuliere einen Teil der Übernachtkultur in 10 Teile frischen Todd-Hewitt-Hefemediums und inkubiere bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,4 erreicht. Dann mischen Sie 900 Mikroliter der Streptokokken-Pneumoniekultur mit 600 Mikrolitern 50 % Glycerol und lagern den Glycerolfond bei minus 80 Grad Celsius.

Dann tauen Sie einen frischen Vorrat der Streptokokken-Pneumonie bei minus 80 Grad Celsius auf und inokulieren Sie ihn vollständig in fünf Milliliter Todd-Hewitt-Hefemedium. Nehmen Sie etwa 10 in der Potenz von sieben Streptokokken-Pneumonie-Zellen. Um die Zellen gründlich zu waschen, werden die Bakterien im Reaktionspuffer wieder suspendiert und bei Raumtemperatur bei 21.000 G für fünf Minuten zentrifugiert.

Das Pellet mit einem 549 Säugetierzelllysat wieder aufhängen. Dann gib gereinigtes Ubiquitin und ein millimolares Adenosintriphosphat hinzu und inkubiere die Mischung ein bis zwei Stunden bei 27 Grad Celsius. Anschließend wird die Bakterien einmal mit einem Reaktionspuffer mit einem molaren Harnstoff gewaschen, gefolgt von zwei weiteren Waschen nur mit dem Reaktionspuffer.

Fixiere die Bakterien mit 1 % Paraformaldehyd. Nach der Fixierung werden die Zellen mit PBS inkubiert, das 15 Minuten lang ein Milligramm Glycin pro Milliliter enthält. Dann zweimal mit PBS waschen.

Bereiten Sie eine Reaktionsmischung vor, indem Sie Ubiquitin mit anderen benötigten Komponenten im Reaktionspuffer kombinieren. Stellen Sie das Gesamtvolumen der Reaktionsmischung auf 100 bis 150 Mikroliter ein. Die Bakterien in der Reaktionsmischung mit dem Ubiquitin-Enzym erneut suspendieren und die Suspension zwei Stunden lang bei 27 Grad Celsius inkubieren.

Nachdem Sie die Bakterien dreimal mit einem Reaktionspuffer mit Harnstoff gewaschen haben, fixieren Sie sie mit 1% Paraformaldehyd. Nach der Fixierung werden die Zellen mit PBS inkubiert, das 15 Minuten lang ein Milligramm Glycin pro Milliliter enthält. Dann wird die Probe eine Stunde lang in 3 % BSA bei 27 Grad Celsius inkubiert und zweimal mit PBS gewaschen.

Die ubiquitinierten Bakterien werden in einer primären Antikörperlösung erneut suspendiert, die in höheren Konzentrationen hergestellt wird als üblicherweise bei Immunfluoreszenz-Tests. Dann eine Stunde lang bei 27 Grad Celsius inkubieren. Nach zweimaligem Waschen der Bakterien mit PBS werden sie in den entsprechenden sekundären Antikörper konjugiert, der mit Alexa Fluor 488 und Alexa Fluor 555 konjugiert ist, wieder suspendiert.

Nun werden etwa 10 bis 20 Mikroliter der beschrifteten Bakterienprobe auf einen Glasträger gegossen und fünf bis zehn Mikroliter Montagemedium mit oder ohne DAPI untergemischt. Legen Sie eine Deckschicht über die Probe und verwenden Sie Seidenpapier, um überschüssige Flüssigkeit abzutupfen. Kombinieren Sie sechs mikromolare VCP p97 mit einem mikromolaren NPLOC4 und einem mikromolaren UFD-1.

Stellen Sie das Volumen des Reaktionsgemisch auf etwa 90 Mikroliter an, verwenden Sie einen Reaktionspuffer und inkubieren Sie zwei Stunden auf Eis. Anschließend wird ein bis zwei millimolare Adenosintriphosphat zur Reaktionsmischung mit p97 UFD-1, NPLOC4, hinzugefügt. Dann kombiniert man das mit 10 Zellen in der Potenz von sieben ubiquitinierten Streptokokken-Pneumoniezellen und inkubiert zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Unmittelbar nach der Behandlung nehmen Sie ein 10-Mikroliter-Aliquot aus der Reaktionsmischung und führen Sie eine Serienverdünnung durch. Geben Sie 10 bis 20 Mikroliter jeder Verdünnung auf Hirn-Herz-Infusionsplatten. Bewerten Sie Koloniebildungseinheiten zwischen der Nullstunde und der Zwei-Stunden-Zeit.

Berechnen Sie den Prozentsatz der bakteriellen Lebensfähigkeit, indem Sie die Zwei-Stunden-CFU-Anzahl durch die Null-Stunden-CFU-Zahl teilen und mit 100 multiplizieren. Eine signifikante Uiquitination von Streptococcus pneumoniae wurde beobachtet, wenn sie entweder mit Säugetierzelllysat oder einem rekonstituierten E-1-, E-2- und E-3-Enzymsystem behandelt wurden. Das Ubiquitinationssignal fehlte bei der Kontrolle und wurde deutlich reduziert, als die ubiquitinierte Streptokokken-pneumoniae OTUB1 ausgesetzt war, was die K48-gebundene Poly-Ubiquitin-Modifikation bestätigte.

Eine Linienprofilanalyse zeigte eine vollständige Überlappung zwischen Ubiquitin- und bakteriellen Signalen, was ihre räumliche Kolokalisierung bestätigte. Die dreidimensionale Rekonstruktion bestätigte die räumliche Überlappung von Ubiquitin- und Streptokokken-Pneumoniae-Signalen. Wildtyp p97 reduzierte in Kombination mit seinen Kofaktoren UFD1 und NPLOC4 die bakterielle Lebensfähigkeit nach zwei Stunden auf 10 bis 20 %, unabhängig davon, ob die Ubiquitination mit Zelllysat oder mit gereinigtem Enzymsystem durchgeführt wurde.

Es wurde keine Verringerung der bakteriellen Lebensfähigkeit beobachtet, wenn Ubiquitination weggelassen wurde, wenn p97 hitzeinaktiviert wurde oder der katalytisch inaktive p97-Mutant E57 8Q verwendet wurde, was bestätigt, dass sowohl Ubiquitination als auch aktives p97 für die bakterielle Tötung unerlässlich sind. Unsere Studie öffnet die Tür dazu, wie Wirts-E3-Ubiquitin-Ligasen verschiedene Krankheitserreger verändern und die Effektormechanismen untersuchen, um die infektiösen Bedrohungen zu beseitigen. Als Nächstes wollen wir untersuchen, wie p97 oder VCP reguliert wird, und es weiter so entwickeln, dass es seine antibakterielle Wirkung erhöht.