Name: In-vitro Rekonstitution der bakteriellen Ubiquitination und VCP/p97-vermittelte Elimination (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-02T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Lernen Sie die In-vitro-Rekonstitution der bakteriellen Ubiquitination mit VCP/p97-vermittelter Elimination von Streptococcus pneumoniae. Diese Methode nutzt Super-Resolution-Mikroskopie und Kryo-EM zur Analyse zytosolischer Abwehrmechanismen.

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<ol><li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unravelling+of+the+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The unravelling of the ubiquitin system.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (5), 322-324 (2015).</li>
<li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis%3A+from+the+lysosome+to+ubiquitin+and+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteolysis: from the lysosome to ubiquitin and the proteasome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (1), 79-87 (2005).</li>
<li>Damgaard, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%3A+from+cell+signalling+to+disease+biology+and+new+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system: from cell signalling to disease biology and new therapeutic opportunities.</a> Cell Death Differ. 28 (2), 423-426 (2021).</li>
<li>Deol, K. K., Lorenz, S., Strieter, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+logic+of+ubiquitin+chain+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic logic of ubiquitin chain assembly.</a> Front Physiol. 10, 835(2019).</li>
<li>Kikkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+HRD1+is+an+E3+ubiquitin+ligase+involved+in+degradation+of+proteins+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human HRD1 is an E3 ubiquitin ligase involved in degradation of proteins from the endoplasmic reticulum.</a> J Biol Chem. 279 (5), 3525-3534 (2004).</li>
<li>Korac, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-independent+function+of+optineurin+in+autophagic+clearance+of+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-independent function of optineurin in autophagic clearance of protein aggregates.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 2), 580-592 (2013).</li>
<li>Asmat, T. M., Agarwal, V., Saleh, M., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+Streptococcus+pneumoniae+via+the+polymeric+immunoglobulin+receptor+of+epithelial+cells+relies+on+clathrin-+and+caveolin-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of Streptococcus pneumoniae via the polymeric immunoglobulin receptor of epithelial cells relies on clathrin- and caveolin-dependent mechanisms.</a> Int J Med Microbiol. 304 (8), 1233-1246 (2014).</li>
<li>Ercoli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+replication+of+Streptococcus+pneumoniae+inside+splenic+macrophages+serves+as+a+reservoir+for+septicaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular replication of Streptococcus pneumoniae inside splenic macrophages serves as a reservoir for septicaemia.</a> Nat Microbiol. 3 (5), 600-610 (2018).</li>
<li>Chakravortty, D., Rohde, M., Jäger, L., Deiwick, J., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+novel+surface+structure+encoded+by+Salmonella+pathogenicity+island+2%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Formation of a novel surface structure encoded by Salmonella pathogenicity island 2.</a> EMBO J. 24 (11), 2043-2052 (2005).</li>
<li>Surve, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+pneumolysin+expression+governs+the+fate+of+Streptococcus+pneumoniae+during+blood-brain+barrier+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in pneumolysin expression governs the fate of Streptococcus pneumoniae during blood-brain barrier trafficking.</a> PLoS Pathog. 14 (7), e1007168(2018).</li>
<li>Franco, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+ligase+SMURF1+functions+in+selective+autophagy+of+Mycobacterium+tuberculosis+and+anti-tuberculous+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin ligase SMURF1 functions in selective autophagy of Mycobacterium tuberculosis and anti-tuberculous host defense.</a> Cell Host Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).</li>
<li>Manzanillo, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+ligase+Parkin+mediates+resistance+to+intracellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin ligase Parkin mediates resistance to intracellular pathogens.</a> Nature. 501 (7468), 512-516 (2013).</li>
<li>Polajnar, M., Dietz, M. S., Heilemann, M., Behrends, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+host+cell+ubiquitylation+machinery+targeting+cytosolic+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Expanding the host cell ubiquitylation machinery targeting cytosolic Salmonella.</a> EMBO Rep. 18 (9), 1572-1585 (2017).</li>
<li>Huett, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+LRR+and+RING+domain+protein+LRSAM1+is+an+E3+ligase+crucial+for+ubiquitin-dependent+autophagy+of+intracellular+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The LRR and RING domain protein LRSAM1 is an E3 ligase crucial for ubiquitin-dependent autophagy of intracellular Salmonella typhimurium.</a> Cell Host Microbe. 12 (6), 778-790 (2012).</li>
<li>Otten, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitylation+of+lipopolysaccharide+by+RNF213+during+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ubiquitylation of lipopolysaccharide by RNF213 during bacterial infection.</a> Nature. 594 (7861), 111-116 (2021).</li>
<li>Yamada, A., Hikichi, M., Nozawa, T., Nakagawa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FBXO2%2FSCF+ubiquitin+ligase+complex+directs+xenophagy+through+recognizing+bacterial+surface+glycan%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">FBXO2/SCF ubiquitin ligase complex directs xenophagy through recognizing bacterial surface glycan.</a> EMBO Rep. 22 (11), e52584(2021).</li>
<li>Apte, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+innate+pathogen+sensing+strategy+involving+ubiquitination+of+bacterial+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">An innate pathogen sensing strategy involving ubiquitination of bacterial surface proteins.</a> Sci Adv. 9 (12), eade1851(2023).</li>
<li>Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+AAA-ATPase+VCP%2Fp97+lyses+ubiquitinated+intracellular+bacteria+as+an+innate+antimicrobial+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Host AAA-ATPase VCP/p97 lyses ubiquitinated intracellular bacteria as an innate antimicrobial defence.</a> Nat Microbiol. , (2025).</li>
<li>Mitchell, G., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+to+intracellular+pathogens%3A+balancing+microbial+elimination+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Innate immunity to intracellular pathogens: balancing microbial elimination and inflammation.</a> Cell Host Microbe. 22 (2), 166-175 (2017).</li>
<li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J Mol Biol. 166 (4), 557-580 (1983).</li>
<li>Blythe, E. E., Olson, K. C., Chau, V., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-+and+ATP-dependent+unfoldase+activity+of+p97%2FVCP-NPLoc4-UFD1L+is+enhanced+by+a+mutation+that+causes+multisystem+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin- and ATP-dependent unfoldase activity of p97/VCP-NPLoc4-UFD1L is enhanced by a mutation that causes multisystem proteinopathy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (22), E4380-E4388 (2017).</li>
<li>Ducker, C., Ratnam, M., Shaw, P. E., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+protein+expression+systems+and+PTM+landscape+in+the+study+of+transcription+factor+ELK-1%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of protein expression systems and PTM landscape in the study of transcription factor ELK-1.</a> Protein Expr Purif. 203, 106216(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>50-facher Protease-Inhibitor-Cocktail</td><td>Promega&nbsp;</td><td>G6521</td><td></td></tr><tr><td>6x-His-Ubiquitin</td><td>UBPBio</td><td>E1100</td><td></td></tr><tr><td>A549-Zelllinie&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ubiquitin-Antikörper</td><td>Enzo</td><td>BML-PW8810-0100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ubiquitin K48-spezifischer, Klon-Apu2-Antikörper</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ZRB2150</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/sigma/a6419">A6419</a></td><td></td></tr><tr><td>BHI</td><td>HiMedia&nbsp;</td><td>M210</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (hoher Blutzuckerspiegel)</td><td>HiMedia&nbsp;</td><td>AL251</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco (US-Herkunft)</td><td>38220090</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>PureSynth&nbsp;</td><td>PSR37325</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TC006</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6148</td><td></td></tr><tr><td>pET28a-p97-Plasmid</td><td>Unser Labor</td><td></td><td>Plasmid auf Anfrage verfügbar</td></tr><tr><td>pET41b-NPLOC4-Plasmid</td><td>Unser Labor</td><td></td><td>Plasmid auf Anfrage verfügbar</td></tr><tr><td>pET41b-UFD1-Plasmid</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #117107</td><td></td></tr><tr><td>rbx1-skp1-cul1-fbxw7&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23-030</td><td></td></tr><tr><td>Streptococcus pneumoniae R6-Stamm</td><td>ATCC</td><td>ATCC BAA-255</td><td>Risikogruppe -2 Erreger, wird in der BSL-2-Einrichtung behandelt</td></tr><tr><td>Todd Hewitt Brühepulver</td><td>HiMedia&nbsp;</td><td>M313</td><td></td></tr><tr><td>UBE1</td><td>UBPBio</td><td>B1100</td><td></td></tr><tr><td>UbE2C</td><td>UBPBio</td><td>C1300</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>HiMedia&nbsp;</td><td>MB032</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextraktpulver&nbl;</td><td>HiMedia&nbsp;</td><td>RM027</td><td></td></tr></tbody></table>

in-vitro rekonstitution der bakteriellen ubiquitination und vcp/p97-vermittelte elimination

In-vitro Reconstitution of Bacterial Ubiquitination and VCP/p97-mediated Elimination

Unser Protokoll beschreibt die Nutzung von Säugetierzellen A549, um ein Zelllysat zu erzeugen, das reich an den notwendigen Komponenten für den Beginn eines Ubiquitinationsprozesses ist (Abbildung 1A). Dieses Lysat, egal ob konzentriert oder durch gereinigte Komponenten wie UBE1 (das E1-Ubiquitin-aktivierende Enzym), UbE2C (ein E2-Ubiquitin-konjugierendes Enzym) und den Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7-Komplex (die E3-Ubiquitin-Ligase) ersetzt wird, wird mit gereinigtem ...

In-vitro Rekonstitution der bakteriellen Ubiquitination und VCP/p97-vermittelte Elimination

Ubiquitination is a versatile post-translational modification that plays a critical role in cytosolic immunity. Upon invasion of the host cells, ...

in-vitro-reconstitution-bacterial-ubiquitination-vcpp97-mediated

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Die hier beschriebene Methode ist eine neue Vesikel Isolierung Protokoll, das für die Reinigung von den zellulären Kompartimenten ermöglicht dem exogene Antigenen durch endoplasmatische Retikulum verbundenen Abbau in Kreuz-Präsentation verarbeitet werden.

Reinigung der Membran-Fach für endoplasmatische Retikulum-assoziierten Abbau von exogenen Antigenen in Kreuz-Präsentation

Im Gegensatz zu Ubiquitin Ligases wurden einige E3 SUMO Ligases identifiziert. Dieses modifizierte in-vitro- Sumoylierung Protokoll ist in der Lage, neuartige SUMO E3 Ligases durch eine in-vitro- Rekonstitution Assay zu identifizieren.

In-vitro- Sumoylierung Assay SUMO E3 Ligase Tätigkeit zu studieren

Ubiquitination ist eine post-translationale Modifikation, die eine wichtige Rolle in zellulären Prozessen spielt und durch Deubiquitination eng koordiniert wird. Defekte in beiden Reaktionen liegen den menschlichen Pathologien zugrunde. Wir bieten Protokolle zur Durchführung von Ubiquitination und Deubiquitination Reaktion in vitro mit gereinigten Komponenten.

In Vitro Ubiquitination und Deubiquitination Assays von Nucleleosomalhistones

Diese Arbeit beschreibt die Synthese und Charakterisierung eines pomalidomidbasierten, bifunktionellen Homo-PROTAC als einen neuartigen Ansatz zur Induzieren von Ubiquitination und Abbau des E3 Ubiquitin Ligase Cereblon (CRBN), dem Ziel von Thalidomid-Analogen.

Chemische Inaktivierung des E3 Ubiquitin Ligase Cereblon durch Pomalidomid-basierte Homo-PROTACs

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Ubiquitin (Ub) und Ubiquitin-Likes (Ubls) spezifische Proteome zu etablieren, um Änderungen dieser Art von post-translationalen Modifikationen (PTMs) zu identifizieren, die mit einer bestimmten Erkrankung wie einer Behandlung oder einem Phänotyp verbunden sind.

Profilierung von Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen abhängigen posttranslationalen Änderungen und Identifizierung signifikanter Änderungen

Diese Methode beschreibt die Bewertung globaler Veränderungen in der Ubiquitin-Kettentopologie. Die Bewertung erfolgt durch die Anwendung eines auf Massenspektrometrie basierenden zielgerichteten Proteomik-Ansatzes.

Ubiquitin-Kettenanalyse durch Parallelreaktionsüberwachung

Die vorliegende Studie liefert detaillierte In-vitro-Ubiquitylierungs-Assay-Protokolle für die Analyse der katalytischen Aktivität der E3-Ubiquitin-Ligase.  Rekombinante Proteine wurden mit prokaryotischen Systemen wie der Escherichia coli-Kultur exprimiert.

In vitro Analyse der E3-Ubiquitin-Ligase-Funktion

Ubiquitinierung ist eine kritische posttranslationale Proteinmodifikation, deren Dysregulation mit zahlreichen menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht wurde. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Phagenanzeige verwendet werden kann, um neuartige Ubiquitin-Varianten zu isolieren, die die Aktivität von E3-Ligasen binden und modulieren können, die die Spezifität, Effizienz und Muster der Ubiquitinierung steuern.

Verwendung von Phagenanzeige zur Entwicklung von Ubiquitin-Variantenmodulatoren für E3-Ligasen

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für einen Ubiquitylierungsassay eines spezifischen Substrats und einer E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzellen. HEK293T-Zelllinien wurden zur Proteinüberexpression verwendet, das polyubiquitylierte Substrat wurde durch Immunpräzipitation von Zelllysaten gereinigt und in SDS-PAGE aufgelöst. Immunoblotting wurde verwendet, um diese posttranslationale Modifikation zu visualisieren.

Evaluierung der Substratubiquitylierung mittels E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzelllysaten

Das Protokoll beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Reinigung ubiquitinierter Proteine aus Säugetierzellen am Beispiel des Tumorsuppressorproteins p53. Ubiquitinierte p53-Proteine wurden unter strengen nichtdenaturierenden und denaturierenden Bedingungen aus Zellen gereinigt.

Aufreinigung ubiquitinierter p53-Proteine aus Säugetierzellen

In diesem Protokoll wird erläutert, wie die Wirkung genetischer Variation, die mit neurologischen Entwicklungsstörungen verbunden ist, auf die deubiquitylierende Enzymaktivität gemessen werden kann, indem die rekombinante Proteinreinigung mit Ubiquitin-Kettenspaltungsassays kombiniert wird.

Messung der enzymatischen Aktivität von Enzymen, die mit neurologischen Entwicklungsstörungen assoziiert sind, mittels eines in vitro Ubiquitin-Kettenspaltungsassays

Lernen Sie die In-vitro-Rekonstitution der bakteriellen Ubiquitination mit VCP/p97-vermittelter Elimination von Streptococcus pneumoniae. Diese Methode nutzt Super-Resolution-Mikroskopie und Kryo-EM zur Analyse zytosolischer Abwehrmechanismen.

In-vitro Rekonstitution der bakteriellen Ubiquitination und VCP/p97-vermittelte Elimination

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