Phenolrot-Faden-basierte Probenahme für ungezielte Tränenflüssigkeitslipidomik in der Biomarker-Entdeckung
December 12th, 2025
Dieses Protokoll beschreibt ein einzigartiges klinisches Protokoll zur Entnahme menschlicher Tränenflüssigkeitsproben mittels roter Phenolfäden und auf Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-basierendem Workflow, um das Rippenlipidom-Profil zu entdecken. Die einfache Methyl-tert-Butylether-(MTBE)/methanol-biphasische Trennmethode ermöglicht eine schnelle Tränenlipidextraktion mit hoher Rückgewinnung für die Entdeckung von Tränenbiomarkern.
Wir haben eine standardisierte, einfach zu bedienende Phenol-Rotfaden-basierte Methode entwickelt, um reproduzierbare Tränenlipidomprofile für die zukünftige Entdeckung von Tränenbiomarkern zu ermöglichen. Die aktuelle Herausforderung besteht darin, dass Schirmer-Streifen reizen, während Kapillaren Operatorvariabilitäten bei der Tränensammlung zeigen. Dies erschwert die experimentelle Berichterstattbarkeit und Vergleiche zwischen Studien.
Zu Beginn tragen Sie Handschuhe und desinfizieren Sie die Arbeitsstation gründlich, um eine Kontamination der Probe zu vermeiden. Halte den roten Phenolfaden am Ende gegenüber dem gebogenen Haken und achte darauf, den gebogenen Hakenbereich nicht zu berühren. Bitten Sie die Person, ihren Blick in die obere nasale Richtung zu richten.
Dann zieht man das untere Augenlid des Subjekts vorsichtig herunter und führt den phenolroten Faden mit dem gebogenen Haken in die untere temporale Palpebralbindehaut nahe dem äußeren Augenwinkel ein. Bitten Sie nun das Subjekt, die Augen sanft zu schließen und den Kopf leicht nach vorne zu neigen, um zu verhindern, dass der phenolrote Faden die Haut im Gesicht berührt. Ziehen Sie das untere Augenlid des Subjekts wieder herunter und entfernen Sie vorsichtig den roten Phenolfaden, wobei Sie den Kontakt mit der beprobten Region vermeiden.
Zeichnen Sie die Länge des beprobten roten Bereichs auf. Und mit steriler Pinzette wird das PRT in ein neues Probenröhrchen übertragen. Jetzt beschrifte und decke das Probenrohr richtig auf.
Wenn die beprobte Länge weniger als 50 Millimeter beträgt, bitten Sie die Person, sich ein bis drei Minuten auszuruhen, und wiederholen Sie dann die Tränenflüssigkeitssammlung mit demselben Auge. Lege jedes neu entnommene PRT in ein separates Probenrohr. Mit Methanol und sauberen Papiertüchern reinigen Sie Handschuhe und Pinzetten gründlich, um Rissreste oder Verunreinigungen zu entfernen.
Dann lassen Sie sie vollständig an der Luft trocknen. Versiegeln Sie alle Probenröhrchen mit Parafilm und lagern Sie sie sofort bei minus 20 Grad Celsius für eine vorübergehende Lagerung oder bei minus 80 Grad Celsius für die Langzeitlagerung. Vorwaschen Sie die Mikroschere und Pinzette mit Methanol, bevor Sie die roten Phenolfäden verarbeiten.
Schneiden Sie das verbogene Hakenende etwa die ersten drei Millimeter von jedem Phenolrotfaden ab. Schneiden Sie das beprobte Gebiet bis zur Front des phenolroten Farbstoffs in zwei Millimeter Stücke und sammeln Sie diese Segmente mit einem sauberen, 1,5 Milliliter großen, organisch-lösungsmitteltoleranten Mikrozentrifugenrohr. Entsorge das verbogene Hakenende und den unerwünschten Bereich des PRT.
Legen Sie die Proben auf Eis, um vor der Extraktion eine niedrige Temperatur zu halten. Geben Sie nun 232 Mikroliter eiskaltes Massenspektrometrie-Methanol zu jeder Probe und wirbeln 15 Sekunden lang vor, um gründlich zu mischen. Sonikieren Sie die Proben 15 Minuten lang in einem vorgekühlten Ultraschallreiniger.
Dann fügen Sie 774 Mikroliter HPLC-Qualitäts-Methyltert-Butyläther und 194 Mikroliter deionisiertes Wasser zu jeder Probe hinzu. Wirbel erneut für 15 Sekunden, um die Lösungsmittel gründlich zu mischen. Sonikieren Sie die Proben erneut in einem vorgekühlten Ultraschallreiniger für weitere 15 Minuten.
Nach der Sonikation inkubieren Sie die Proben in einem ThermoMixer, der auf vier Grad Celsius eingestellt ist und mit einem Schütteln von 1.200 Umdrehungen pro Minute über acht Stunden hinweg vibriert. Dann lassen Sie die Mischung 10 Minuten ungestört bei Zimmertemperatur stehen. Zentrifugieren Sie die Gemische bei 10.000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.
Nach der Zentrifugation sollten die Gemische sichtbar in zwei verschiedene flüssige Phasen getrennt werden. Sammeln Sie vorsichtig 700 Mikroliter der oberen organischen Phase, die Lipide enthalten, und übertragen Sie sie in ein vorgekühltes neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Entsorgen Sie die untere wässrige Phase, die Restreste von Methyltert-Butylether und Methanol als gefährliche chemische Abfälle enthält.
Trocknen Sie die Lipidextrakte vier Stunden lang mit einem gekühlten SpeedVac-Konzentrator, der auf vier Grad Celsius eingestellt ist. Anschließend werden die getrockneten Lipidextrakte bei minus 20 Grad Celsius für eine kurzfristige Lagerung oder bei minus 80 Grad Celsius für die Langzeitlagerung gelagert. Bereiten Sie das Methanol-Chloroform-Lösungsmittelgemisch vor, indem Sie Methanol mit Chloroform in einem Eins-zu-Eins-Volumenverhältnis mischen.
Rekonstituieren Sie die getrockneten Lipidextrakte mit 50 Mikrolitern des eiskalten Methanol-Chloroform-Lösungsmittels. Sonikieren Sie die rekonstituierte Lösung 15 Minuten lang in einem vorgekühlten Ultraschallreiniger. Zentrifugieren Sie nun die rekonstituierten Lipidextrakte bei 14.000 G und vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Übertragen Sie vorsichtig 40 Mikroliter des resultierenden Supernatanten in ein Autosampler-Glasfläschchen, das mit einem Glaseinsatz ausgestattet ist. Schließen Sie das Fläschchen fest mit einer nicht-spaltförmigen Septum-Kappe mit offenem Oberteil, um sie für die Analyse der Flüssigkeitschromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie vorzubereiten. Nach strengen Kriterien wurden 773, 890 und 1.025 einzigartige Lipidspezies in Repliziergruppen eins, zwei replizieren und drei replizieren.
Der positive Ionenmodus identifizierte 1.302 Lipidspezies mit 26 % Grad A, 13,2 % Grad B und 60,8 % Grad C Identifikationen. Der negative Ionenmodus identifizierte 257 Lipidspezies mit etwa 8,2 % Grad A, 22,9 % Grad B und 68,9 % Grad C Identifikationen. Trotz lagerbedingter Variationen wurden in allen drei Probensätzen konsistent 394 einzigartige Lipidarten identifiziert.
Der Intersubjekt-Variationskoeffizient über drei Besuche betrug 21,5 % im positiven Modus und 31,3 % im negativen Modus. Dieses Protokoll berücksichtigt das Fehlen eines standardisierten Arbeitsablaufs für reproduzierbare Rippenlipidom-Analysen und kann die Vergleichbarkeit zwischen Studien verbessern. Unsere PRT-basierte Methode minimiert Reizungen, ermöglicht eine schnelle Tränensammlung und verringert die Variabilität des Bedieners.
Unsere zukünftige Forschung wird Rippenlipidom-Biomarker in großen Kohorten validieren und Multiomics für personalisierte Diagnostik integrieren.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine standardisierte Methode zur Sammlung menschlicher Tränenflüssigkeitsproben unter Verwendung von Phenolrot-Fäden, mit dem Ziel, die Reproduzierbarkeit in Tränen-Lipidomik-Studien zu verbessern. Der Arbeitsablauf beinhaltet Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) für die Lipidextraktion und -analyse.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Biochemie
- Klinische Forschung
Hintergrund
- Aktuelle Methoden zur Tränensammlung führen oft zu Reizungen oder Variabilität.
- Standardisierung ist entscheidend für die zuverlässige Entdeckung von Biomarkern.
- Phenolrot-Fäden bieten eine weniger invasive Alternative für die Tränenprobenahme.
- LC-MS/MS bietet eine robuste Plattform für die Lipidomanalyse.
Zweck der Studie
- Eine reproduzierbare Methode für das Tränen-Lipidomik-Profiling zu etablieren.
- Die Variabilität des Bedieners zu minimieren und die Vergleichbarkeit zwischen Studien zu verbessern.
- Zukünftige Forschung zu Tränen-Lipid-Biomarkern zu erleichtern.
Verwendete Methoden
- Sammlung von Tränenproben unter Verwendung von Phenolrot-Fäden.
- Extraktion von Lipiden mittels biphasischer Trennmethode.
- Analyse von Lipidspezies mittels LC-MS/MS.
- Lagerung der Proben bei kontrollierten Temperaturen zur Stabilität.
Hauptergebnisse
- Identifizierung von über 1.300 Lipidspezies im positiven Ionenmodus.
- Konsistente Identifizierung von 394 einzigartigen Lipidspezies über Proben hinweg.
- Zwischen-Subjekt-Variabilität gemessen bei 21,5% im positiven Modus.
- Methode verbessert die Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit von Lipidom-Studien.
Schlussfolgerungen
- Die Phenolrot-Faden-Methode reduziert Reizungen und Variabilität.
- Standardisierter Arbeitsablauf verbessert die Zuverlässigkeit der Tränen-Lipidomanalyse.
- Zukünftige Studien werden sich auf die Validierung von Lipid-Biomarkern in größeren Kohorten konzentrieren.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Standardized, minimally invasive tear fluid sampling is critical for robust lipidomic biomarker discovery in ocular and systemic disease research. The phenol red thread (PRT)-based protocol addresses reproducibility and operator variability, enabling higher predictive confidence in early biomarker validation. This workflow supports translational continuity from discovery to preclinical research by ensuring consistent, high-quality lipidomic data across studies and sites.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables reproducible interrogation of tear lipid profiles for biomarker hypothesis testing.
- Reduces biological and procedural variability, supporting functional target validation.
- Facilitates portfolio triage by providing robust, quantitative lipidomic datasets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tear fluid samples for downstream high-resolution LC-MS/MS workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization by minimizing operator-dependent variability.
- Supports scalable, user-friendly sample collection suitable for multi-site studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns lipidomic outputs with disease-relevant biomarker discovery and monitoring.
- Enables continuity from early discovery through preclinical validation by supporting consistent sample quality.
- Reduces risk of false negatives in translational biomarker studies due to sampling artifacts.
Pipeline & Workflow Integration
The PRT-based sampling protocol integrates into the biomarker discovery continuum, from early hypothesis testing to preclinical validation, by providing a standardized input for lipidomic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven lipidomic profiling and pathway clarification in ocular and systemic disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative tear lipid samples for high-throughput LC-MS/MS analysis.
- Analytics: Enables identification and comparison of over 700 unique lipid species across replicates and conditions.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and disease monitoring through robust, minimally invasive sampling.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, standardized protocol adaptable across research teams and clinical cohorts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in lipid biomarker studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of tear fluid collection.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by reducing sampling-related risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of biomarker programs.
Implementation Considerations
- Requires personnel trained in standardized PRT handling and sample processing.
- Needs access to high-resolution LC-MS/MS instrumentation and lipidomics software.
- Demands cross-team adherence to contamination control and storage protocols.
- Adaptable to subjects with low tear volume or sensitivity to traditional sampling methods.
- Potential limitations include storage-related lipid variability and need for further validation in large cohorts.
