Name: Lebendzell-Bildgebung der Permeabilisierung der lysosomalen Membran während der Nekroptose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-14T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Lernen Sie die Lebendzell-Bildgebung zur Überwachung der lysosomalen Membranpermeabilisierung während der Nekroptose. Diese Methode nutzt fluoreszierende Sonden zur Echtzeit-Visualisierung lysosomaler Integrität und pH-Änderungen.

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<ol><li>Shan, B., Pan, H., Najafov, A., Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+in+development+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Necroptosis in development and diseases.</a> Genes Dev. 32, 327-340 (2018).</li>
<li>Kang, K., Park, C., Chan, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Necroptosis at a glance.</a> J Cell Sci. 135 (17), jcs260091(2022).</li>
<li>Ai, Y., Meng, Y., Yan, B., Zhou, Q., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemical+pathways+of+apoptotic%2C+necroptotic%2C+pyroptotic%2C+and+ferroptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The biochemical pathways of apoptotic, necroptotic, pyroptotic, and ferroptotic cell death.</a> Mol Cell. 84, 170-179 (2024).</li>
<li>Zhang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIP3%2C+an+energy+metabolism+regulator+that+switches+TNF-induced+cell+death+from+apoptosis+to+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis.</a> Science. 325, 332-336 (2009).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-α.</a> Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).</li>
<li>Cho, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-driven+assembly+of+the+RIP1-RIP3+complex+regulates+programmed+necrosis+and+virus-induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation.</a> Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148, 213-227 (2012).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+is+a+key+receptor+interacting+protein+3+downstream+component+of+TNF-induced+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like is a key receptor interacting protein 3 downstream component of TNF-induced necrosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (14), 5322-5327 (2012).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+to+plasma+membrane+leads+to+necrotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death.</a> Cell Res. 24 (1), 105-121 (2014).</li>
<li>Cai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+translocation+of+trimerized+MLKL+protein+is+required+for+TNF-induced+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis.</a> Nat Cell Biol. 16, 55-65 (2014).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL+forms+disulfide+bond-dependent+amyloid-like+polymers+to+induce+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, E7450-E7459 (2017).</li>
<li>Lawrence, R. E., Zoncu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lysosome+as+a+cellular+centre+for+signalling%2C+metabolism+and+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control.</a> Nat Cell Biol. 21, 133-142 (2019).</li>
<li>Ballabio, A., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes+as+dynamic+regulators+of+cell+and+organismal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 21, 101-118 (2020).</li>
<li>Aits, S., Jaattela, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+cell+death+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Lysosomal cell death at a glance.</a> J Cell Sci. 126, 1905-1912 (2013).</li>
<li>Repnik, U., Hafner Cesen, M., Turk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+membrane+permeabilization+in+cell+death%3A+concepts+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Lysosomal membrane permeabilization in cell death: concepts and challenges.</a> Mitochondrion. 19 (Pt A), 49-57 (2014).</li>
<li>Alu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+lysosome+in+regulated+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm+Sin+B%22%5BJournal%5D)">The role of lysosome in regulated necrosis.</a> Acta Pharm Sin B. 10 (10), 1880-1903 (2020).</li>
<li>Werneburg, N. W., Guicciardi, M. E., Bronk, S. F., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-%CE%B1-associated+lysosomal+permeabilization+is+cathepsin+B+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-α-associated lysosomal permeabilization is cathepsin B dependent.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283, G947-G956 (2002).</li>
<li>Vanden Berghe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis%2C+necrosis+and+secondary+necrosis+converge+on+similar+cellular+disintegration+features%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Necroptosis, necrosis and secondary necrosis converge on similar cellular disintegration features.</a> Cell Death Differ. 17, 922-930 (2010).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL+polymerization-induced+lysosomal+membrane+permeabilization+promotes+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">MLKL polymerization-induced lysosomal membrane permeabilization promotes necroptosis.</a> Cell Death Differ. 31, 40-52 (2024).</li>
<li>Guicciardi, M. E., Miyoshi, H., Bronk, S. F., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+B+knockout+mice+are+resistant+to+tumor+necrosis+factor-%CE%B1-mediated+hepatocyte+apoptosis+and+liver+injury%3A+implications+for+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cathepsin B knockout mice are resistant to tumor necrosis factor-α-mediated hepatocyte apoptosis and liver injury: implications for therapeutic applications.</a> Am J Pathol. 159, 2045-2054 (2001).</li>
<li>Aits, S., Jaattela, M., Nylandsted, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+quantification+of+lysosomal+membrane+permeabilization%3A+a+hallmark+of+lysosomal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for the quantification of lysosomal membrane permeabilization: a hallmark of lysosomal cell death.</a> Methods Cell Biol. 126, 261-285 (2015).</li>
<li>Barral, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+to+analyze+lysosome+morphology%2C+positioning%2C+motility+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Current methods to analyze lysosome morphology, positioning, motility and function.</a> Traffic. 23, 238-269 (2022).</li>
<li>Huang, K., Jiang, X., Du, J., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+detecting+lysosome+quantity+and+membrane+permeability+in+acute+myeloid+leukemia+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for detecting lysosome quantity and membrane permeability in acute myeloid leukemia cell lines.</a> STAR Protoc. 5, 103309(2024).</li>
<li>Ferrari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome+quality+control+in+health+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+Lett%22%5BJournal%5D)">Lysosome quality control in health and neurodegenerative diseases.</a> Cell Mol Biol Lett. 29, 116(2024).</li>
<li>Otoda, T., Aihara, K. I., Takayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+stress+in+cardiovascular+diseases%3A+therapeutic+potential+of+cardiovascular+drugs+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Lysosomal stress in cardiovascular diseases: therapeutic potential of cardiovascular drugs and future directions.</a> Biomedicines. 13, (2025).</li>
<li>Cao, M., Luo, X., Wu, K., He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+lysosomes+in+human+disease%3A+from+basic+research+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting lysosomes in human disease: from basic research to clinical applications.</a> Signal Transduct Target Ther. 6, 379(2021).</li>
<li>Fisher, T. LysoTracker and LysoSensor probes. Thermo Fisher Scientific. , https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp07525.pdf (2013).</li>
<li>Wang, Z., Jiang, H., Chen, S., Du, F., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+phosphatase+PGAM5+functions+at+the+convergence+point+of+multiple+necrotic+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial phosphatase PGAM5 functions at the convergence point of multiple necrotic death pathways.</a> Cell. 148 (1-2), 228-243 (2012).</li>
<li>Kiepas, A., Voorand, E., Mubaid, F., Siegel, P. M., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+live-cell+fluorescence+imaging+conditions+to+minimize+phototoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimizing live-cell fluorescence imaging conditions to minimize phototoxicity.</a> J Cell Sci. 133 (4), jcs242834(2020).</li>
<li>Eriksson, I., Vainikka, L., Persson, H. L., Ollinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+lysosomal+membrane+permeabilization+using+acridine+orange%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of lysosomal membrane permeabilization using acridine orange.</a> Methods Protoc. 6 (4), 72(2023).</li>
<li>Aits, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+lysosomal+membrane+permeabilization+by+lysosomal+galectin+puncta+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay.</a> Autophagy. 11, 1408-1424 (2015).</li>
<li>Hoyer, M. J., Swarup, S., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+controlling+selective+elimination+of+damaged+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms controlling selective elimination of damaged lysosomes.</a> Curr Opin Physiol. 29, 100590(2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>HT-29-Zellen</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td>Darmkrebszellen</td></tr><tr><td>35 mm Glasboden-Schüssel</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C-GRD</td><td></td></tr><tr><td>CO2-Inkubator</td><td>PHCBI</td><td>MCO-170AICUVL</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Leica</td><td>SP8WLL</td><td></td></tr><tr><td>Dextran-grüne Perlen</td><td>ThermoFisher</td><td>D1820</td><td>Dextran, Fluorescein, 10.000 MW, anionisch, lysinfixierbar</td></tr><tr><td>Dulbeccos modifizierter Eagle Medium (DMEM)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum (FBS)</td><td>Cytiva&nbsp;</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red DND-99</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>Ölimmersionstyp HF</td><td>Elektronenmikroskopiewissenschaften</td><td>16915-01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin und Streptomycin (P/S)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Smac-Mimetik (S)</td><td>BV6, ApexBio, Katalog</td><td>B4653</td><td>Endkonzentration, 1 mM</td></tr><tr><td>The Brick&nbsp;</td><td>Lebensbildgebende Dienstleistungen</td><td>13685</td><td>CO2-Regler des Gasmischers</td></tr><tr><td>Der Würfel</td><td>Lebensbildgebende Dienstleistungen</td><td>CBO2A</td><td>Temperaturkontrollkammermikroskope</td></tr><tr><td>Tumornekrosefaktor Alpha (TNF-&Alpha; - T)</td><td>Peprotech</td><td>30001A100UG</td><td>Endkonzentration: 20 ng/ml</td></tr><tr><td>z-VAD-FMK (Z)</td><td>ApexBio</td><td>A1902</td><td>Endkonzentration, 20 mM</td></tr></tbody></table>

lebendzell-bildgebung der permeabilisierung der lysosomalen membran während der nekroptose

Live-cell Imaging of Lysosomal Membrane Permeabilization During Necroptosis

Die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren ermöglichen die Aufnahme von Lebendzellbildern mittels konfokaler Mikroskopie, um LMP in Echtzeit zu überwachen. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des experimentellen Protokolls, von der Zellbeschichtung bis zur Bildaufnahme. An Tag 0 wurden 5.000 HT-29-Zellen plattiert und 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Nach 24 Stunden (Tag 1) wurden die Zellen für weitere 24 Stunden unter den gleichen Bedingungen mit Fluorescein-markierten Dextran-Kügelchen (25 μg/ml) inkubiert. Diese Kügelchen werden durch Endozytose und Verkehr zu den Lysosomen internalisiert, wo sie sich ansammeln und als helle Puncta erscheinen. An Tag 2 (Experimentiertag) wurden die Zellen 2 h lang bei 37 °C und 5% CO2 mit dem pH-sensitiven LysoTracker-Farbstoff (1 μM) behandelt. LysoTracker konzentriert und zeigt eine starke Fluoreszenz in sauren Kompartimenten, wie z. B. späten Endosomen und Lysosomen. Dreißig Minuten vor der Bildgebung wurde das konfokale Mikroskopsystem eingeschaltet und stabilisiert, einschließlich Temperatur-, Gas- und Feuchtigkeitsreglern, wie in Schritt 4 des Protokolls beschrieben. Die Bildgebungskammer wurde zusammengebaut, wie in Abbildung 2 gezeigt. Zum Einsatz kamen die Laser 488 nm (grün) und 555 nm (rot).
Nach der Inkubation mit LysoTracker wurden die Zellen dreimal sorgfältig mit PBS gewaschen und 2 ml frisches DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % P/S, hinzugefügt. Die Platte wurde auf das Mikroskop übertragen und ein Tropfen Immersionsöl auf das 63x/1,40 NA Öl-Immersionsobjektiv aufgetragen. Die Laserintensität und die Hintergrundwerte wurden dann angepasst, um die Bildgebungsbedingungen zu optimieren, wie in Schritt 5.5 beschrieben. des Protokolls. Unsere ersten Bilder bestätigten das Vorhandensein stabiler Punktzahlen des Lysotrackers und des Fluorescein-markierten Dextranas, was auf intakte Lysosomen hinweist (Abbildung 3). Die Basisbilder wurden vor T/S/Z aufgenommen und als Kontrolle verwendet. Es wurde kein Fahrzeug eingesetzt.
Nach der Festlegung der anfänglichen Bildgebungs- und Mikroskopieeinstellungen wurde die Platte wieder in die Laminar-Flow-Haube zurückgeführt und 1 ml DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % P/S, bestehend aus 100 ng/ml TNF-α (T), 500 nM SMAC-Mimetikum (S) und 100 μM Z-VAD-FMK (Z), hinzugefügt. Die Bildgebung wurde am konfokalen Mikroskop unter Verwendung des in Schritt 6 des Protokolls beschriebenen Bildgebungserfassungsparameters fortgesetzt. Wie in Abbildung 3, Ergänzungsfilm S1 und Ergänzungsfilm S2 gezeigt, diente die fortschreitende Abnahme der LysoTracker-Fluoreszenz in T/S/Z-behandelten Zellen als Frühindikator für lysosomale Veränderungen. Diesem Verlust folgte und trat gelegentlich gleichzeitig mit dem Ausfluss von Fluorescein-markiertem Dextran aus den Lysosomen in das Zytosol auf (punktuelle zu diffuse Verschiebung), was auf LMP hinweist. Nach 8 Stunden verschwanden fast alle Lysotracker-Signale, jedoch behielten viele Zellen immer noch grüne Puncta mit zytosolischem grünem Signal, was darauf hindeutet, dass der Verlust des lysosomalen pH-Gradienten der vollständigen LMP- und Frachtfreisetzung vorausgeht.
<img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Abbildung 1"> 
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Versuchsprotokolls. (Erstellt im BioRender.com) Zunächst wurden 5.000 Zellen plattiert (0 h) und 24 h inkubiert; danach wurden Dextran-Kügelchen (25 μg/ml) hinzugefügt und für weitere 24 Stunden inkubiert. Nach 48 h wurde LysoTracker (1 μM) hinzugefügt und 2 h lang inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen (Schritt 1), gefolgt von der Zugabe von 2 ml frischem DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % P/S (Schritt 2). Die Mikroskopieeinstellungen wurden angepasst (Schritt 3), und die Zellen wurden mit TNF-α (T), SMAC-Mimetikum (S) und Pan-Caspase-Inhibitor Z-VAD-FMZ (Z) (Schritt 4) behandelt, bevor die Lebendzellbildaufnahme (Schritt 5) erfolgte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Abbildung 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig2.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Abbildung 2"> 
Abbildung 2: Diagramm des Aufbaus der Bildgebungskammer. (A) Der Probenhalter, (B) die Gasinkubationskammer und (C) der obere Deckel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig3.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Abbildung 3"> 
Abbildung 3: Repräsentative Bilder von HT29-Zellen vor und nach der T/S/Z-Behandlung. Die Zellen wurden mit roten Lysotracker- und grünen Dextran-Kügelchen gefärbt und mit TNF-α (T), SMAC-Mimetikum (S) und Pan-Caspase-Inhibitor Z-VAD-FMZ (Z) behandelt. Maßstab: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzender Film S1: Zeitraffer von HT29-Zellen, die mit grünen Dextran-Kügelchen inkubiert und mit T/S/Z behandelt wurden. Die Zellen wurden über 6 Stunden lang überwacht, um die zelluläre Reaktion zu beurteilen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/Movie%20S1_Dextran%20Green%20Beads.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.</a>
Ergänzender Film S2: Zeitraffer von HT29-Zellen, die mit LysoTracker rot inkubiert und mit T/S/Z behandelt wurden. Die Zellen wurden über 6 Stunden lang überwacht, um die zelluläre Reaktion zu beurteilen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/Movie%20S2_LysoTracker%20red.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.</a>

Lebendzell-Bildgebung der Permeabilisierung der lysosomalen Membran während der Nekroptose

Necroptosis, a form of regulated necrosis, culminates in cell membrane rupture. Our lab and others have discovered that lysosomal membrane ...

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Dieses Protokoll enthält Anweisungen zum Auslösen und Überwachen der Stub1-vermittelten Pexophagie in lebenden Zellen.

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Dieses Protokoll beschreibt einen Mechanismus zur Verwendung von korrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie, um die Wechselwirkung von Mitochondrien und Lysosomen, die mit mEosEM bzw. APEX2 markiert sind, sichtbar zu machen.

Zweifarbige korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie zur Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen Mitochondrien und Lysosomen

Lernen Sie die Lebendzell-Bildgebung zur Überwachung der lysosomalen Membranpermeabilisierung während der Nekroptose. Diese Methode nutzt fluoreszierende Sonden zur Echtzeit-Visualisierung lysosomaler Integrität und pH-Änderungen.

Lebendzell-Bildgebung der Permeabilisierung der lysosomalen Membran während der Nekroptose

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