Lebendzell-Bildgebung der Permeabilisierung der lysosomalen Membran während der Nekroptose

Dieses Protokoll beschreibt eine Lebendzellbildgebungsmethode zur Überwachung der Permeabolisation der lysosomalen Membran während der Nekrotose mit fluoreszierenden Sonden, die Veränderungen der Integrität und Versauerung der lysosomalen Membran nachweisen. Die Herausforderung in diesem Bereich besteht darin, die Dynamik der während des Zelltods beschädigten Organellen zu charakterisieren und genau zu definieren, wie dieser Schaden den Zellverlust antreiben oder dazu beitragen sollte. Zu Beginn plattieren Sie 5.000 Zellen in zwei Millilitern antibiotika-angereichertes DMEM-Medium in eine sterile Glasbodenschale.

Stellen Sie die Schale in einen auf 37 Grad Celsius eingestellten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und inkubieren Sie die Zellen über Nacht. Füge 20 Mikroliter Dextran-grüne Perlen zu 25 Mikrogramm pro Milliliter in frischem, mit Antibiotika supplementiertem DMEM-Medium hinzu, um es zu verdünnen. Entferne das alte Medium aus der Schüssel und ersetze es durch zwei Milliliter des mit Rindfleisch ergänzenden DMEM-Mediums.

Stellen Sie die Schale in einen auf 37 Grad Celsius eingestellten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und inkubieren Sie 24 Stunden, damit die Perlen in Lysosomen internalisiert werden. Fügen Sie nun zwei Mikroliter einer millimolaren LysoTracker-Lagerlösung zu zwei Millilitern frischem DMEM-Medium hinzu. Ersetze das alte Medium durch diese Flecklösung.

Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für zwei Stunden. Schalten Sie die Komponenten des Konfokalsystems ein, indem Sie den Personalcomputer, das Mikroskop, die Scanner-Energie, die Laserleistung, die Laseremission und die Leica-Stromversorgung einschalten. Schalten Sie die Umweltkontrollen ein, einschließlich des Temperaturreglers, genannt Cube, und des Kohlendioxidgasmischerreglers, genannt Brick.

Öffnen Sie die Zufuhr von Kohlendioxid und Sauerstoff. Stellen Sie den Temperaturregler auf 37 Grad Celsius ein. Stelle den Gas- und Feuchtigkeitsregler auf 5 % Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit ein.

Bauen Sie die Bildaufnahmekammer zusammen. Nach der Färbung werden die Zellen dreimal mit zwei Millilitern PBS gewaschen und dann zwei Milliliter frisches, zugefügtes DMEM-Medium hinzugefügt. Tragen Sie vor der Bildaufnahme Immersionsöl auf das Objektiv auf.

Installiere die Schüssel auf der Mikroskopstufe. Stellen Sie die Laserintensität auf 3 %, aber nicht mehr als 5 % ein, passen Sie dann die Detektorverstärkung in der Mikroskopsoftware an, um das Signal zu optimieren. Minimieren Sie den Hintergrund, indem Sie die Kontrastleiste anpassen.

Erfassen Sie Ausgangsbilder unbehandelter Zellen, die als Kontrollbedingung dienen. Bringen Sie die Platte zurück in die laminare Flusshaube und fügen Sie ein Milliliter Antibiotikum DMEM hinzu, ergänzt mit Zelltodesinduzatoren. In der Erfassungssoftware stellen Sie den Modus auf XYT, das Format auf 512 mal 512, die Geschwindigkeit auf 400, den Zoom auf drei, den Zeilenmittelwert auf eins, die Zeilenakkumulation auf drei, die Bildakkumulation auf eins, das Zeitintervall auf drei Minuten, die Dauer auf acht Stunden und aktivieren Sie den Autofokus.

Klicken Sie auf Start, um mit der Zeitrafferaufnahme zu beginnen. Erste Bildgebung bestätigte das Vorhandensein stabiler Puncta von LysoTracker und fluorescein-markiertem Dextran, was auf intakte Lysosomen vor der Behandlung hindeutet. Vier Stunden nach der Behandlung mit TSZ war die Fluoreszenz von LyoTracker deutlich reduziert, während Dextran eine diffuse zytosolische Verteilung zeigte, was auf eine anfängliche Permeabilisierung der lysosomalen Membran hinweist.

Acht Stunden nach der Behandlung war das Signal von LysoTracker fast vollständig verschwunden, während viele Zellen grüne Dextran-Puncta mit diffusem grünem zytosolischen Signal behielten. Wir zeigen, dass die Permeabolisation der lysosomalen Membran direkt in einer lebenden Zelle visualisiert werden kann, die sich einer nekrototischen Induktion unterzieht. Dieses Protokoll zeigt, dass die Kombination von LysoTracker- und Dextran-Perlen eine gleichzeitige Überwachung des lysosomalen pH-Werts und der Freigabe von Fracht in Echtzeit ermöglicht.

Wichtig für die Weiterentwicklung dieses Live-Zell-Bildprotokolls ist seine Fähigkeit, eine kleine pH-Veränderung und die Permeabilisierung der lysosomalen Membran in Echtzeit zu überwachen, um dynamische Ereignisse zu erfassen, die durch Endpunktanalysen wie Flowzytometrie und Monolayer-Färbung übersehen werden.