Reinigung von HLA-G⁺ -Extravillen-Trophoblasten aus menschlichen Term-Plazentageweben für Phänotypisierung und funktionelle Analyse

Dieses Protokoll ist darauf ausgelegt, primäre menschliche Trophoblasten aus menschlichem Plazentagewebe zu reinigen, um deren funktionelle Eigenschaften und immunologische Eigenschaften in gesunder Schwangerschaft und unter pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Dieses Protokoll bietet somit eine reproduzierbare Plattform, um einige frühere Einschränkungen bei der Arbeit mit primären menschlichen extravillösen Trophoblasten, insbesondere deren Lebensfähigkeit, zu überwinden. Dieses Protokoll ist also wirklich optimiert, um ihre Lebensfähigkeit und Reinheit zu verbessern.

Zu Beginn entnehmen Sie eine menschliche Plazentaprobe. Platziere die Plazenta so, dass die fetale Seite nach oben zeigt, sodass die Nabelschnureinstichstelle sichtbar ist. Ziehen Sie das Amnion manuell von der lateralen Membran in Richtung der Nabelschnur-Einstichstelle ab und entfernen Sie es.

Dann benutzt man eine Schere, um das Amnion zu schneiden und wegzuwerfen. Schneiden Sie die choriodeziduale Membran in zwei Zoll lange Streifen, beginnend von der Basis der Plazenta nach oben, während jeder Streifen an der Plazenta befestigt bleibt. Lege den choriodecidualen Membranstreifen über zwei Finger, wobei die deziduale Seite nach oben zeigt.

Mit einer sterilen, gebogenen Spitzenzange wird die mütterliche Decidua parietalis vorsichtig vom Chorion abgekratzt. Sammeln Sie die Decidua parietalis in einem 50-Milliliter-konischen Rohr mit 20 Millilitern PBS zur Lymphozytenisolierung. Dann sammeln Sie die Chorionmembran in ein separates 50-Milliliter-konisches Rohr mit 20 Millilitern Waschmedium A. Mit einer Schere schneiden Sie die Chorionmembran im 50-Milliliter-Rohr in Stücke von weniger als zwei Quadratmillimetern.

Entsorge Waschmedium A aus der Tube. Waschen Sie das Taschentuch wiederholt mit PBS, bis das Supernatant klar ist. Bei der Plazentadissektion wird die Plazenta mit der mütterlichen Seite nach oben gelegt und Blutgerinnsel entfernt.

Mit steriler Schere schneiden Sie Stücke der Plazenta-Basalplatte ab, wobei nekrotische, verkalkte oder ischämische Bereiche vermieden werden. Setzen Sie das Decidua-Baschalis-Stück auf die Finger, wobei die Villi nach oben zeigen. Dann werden die Zotten vorsichtig mit einer Schere entfernt und so eine zwei bis drei Millimeter breite Membran erhalten, in der nur noch eine dünne Zottenschicht übrig bleibt.

Sammeln Sie das Gewebe der Decidua basalis in ein 50-Milliliter-konisches Rohr mit 20 Millilitern PBS. Dann schneiden Sie das Gewebe in Stücke von weniger als zwei Quadratmillimetern. Entsorge als Nächstes das PBS aus der Röhre.

Waschen Sie die Decidua Basalis wiederholt mit PBS, bis das Supernatant klar und ohne sichtbares Blut ist. Dann werden 15 Milliliter Gewebesuspension in zwei 50-Milliliter-Kegelröhren aufgeteilt. Füllen Sie alle Tuben mit PBS.

Zentrifugiere die Röhren bei 200 G für eine Minute und gieße das Supernatant ab. Gib 150 Milliliter warmes Gewebe-Verdauungsenzym-Cocktail in eine 300-Milliliter-Glasflasche. Gib 30 Milliliter Chorionmembran in die Flasche.

Füge 20 Milliliter warmes DMEM/F-20 und 80 Milliliter warmes Gewebe-Verdauungsenzym-Cocktail in zwei separate 300-Milliliter-Glasflaschen hinzu. Dann geben Sie 7,5 Milliliter Decidua Basalis in jede Flasche. Inkubieren Sie die Flaschen in einem Wasserbad.

Schütteln Sie alle Flaschen alle drei bis vier Minuten während der 15-minütigen Inkubation. Nach der Verdauung wird das Gewebe durch Metallsiebe mit einer Maschengröße von 40 gefiltert. Dann gibt es Waschmedium B, um das Gewebe auszuspülen und das gelatineartige Material aufzulösen.

Übertrage das unverdaute Gewebe zurück in die Glasflaschen und wiederhole die Verdauung. Anschließend filtern Sie die Zellsuspensionen durch einen 100-Mikrometer-Filter in beschriftete 50-Milliliter-Konusrohre. Halte die Zellen der ersten und zweiten Verdauung getrennt.

Dann zentrifugiere die Zellsuspension bei 650 G für acht Minuten. Entsorge das Supernatant. Kombinieren Sie Pellets mit gleichem Gewebetyp und Verdauungsanzahl in einem Rohr.

Dann mache ich das Volumen mit Wash medium B bis zu 25 Millilitern fertig. Füge 12 Milliliter Ficoll zu vier 50-Milliliter-konischen Röhren hinzu, die mit Gewebetyp und Verdauungsnummer beschriftet sind. Schichte die Zellsuspension vorsichtig auf das Ficoll.

Dann bei 800 G 20 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren, ohne zu unterbrechen. Saugen Sie die Zellschicht vorsichtig an der Ficoll-Medium-Grenzfläche ab und übertragen Sie sie in saubere, beschriftete Röhren. Dann fülle die Röhren mit Wash Medium B, zentrifugiere bei 650 G acht Minuten und suspendiere die Pellets wieder.

Geben Sie die resuspendierten Pellets in sterile, fluoreszenzaktivierte Zellsortierröhren, die mit Gewebetyp und Verdauungsnummer beschriftet sind. Fügen Sie Anti-CD45 BV785, Anti-HLA GAPC und Anti-EGFR1 BV711 Antikörper hinzu. 20 Minuten bei Zimmertemperatur im Dunkeln inkubieren lassen.

Nach dem Waschen und Wiederaufhängen der Zellen in Waschmedium B werden sie sofort durch ein 40-Mikrometer-Sieb geführt. CD45-negatives HLAG-positives EGFR-positives extravillouses Trophoblast in Röhren mit einem Milliliter EVT-Kulturmedium A sortieren. Die Durchflusszytometrieanalyse der Linienmarker zeigte eine lebensfähige primäre extravillouse Trophoblast-Kultur bis zum vierten Tag. Repräsentative Lichtmikroskopieaufnahmen des primären chorionischen und decidua basalis HLAG-positiven extravillösen Trophoblasten wurden nach 24, 48 Stunden und 72 Stunden Kultur aufgenommen.

Extravillous Trophoblast exprimierte polymorphe HLAC- und immunsuppressive kohemmende Moleküle. Die extravillöse Trophoblast erhöhte die Expression von HLAC, PD-L1, PD-L2 und HLA-E, erhöhte jedoch nicht die Expression von PVR und B7H3, wenn sie 72 Stunden lang mit aktivierten Lymphozyten kokultiviert wurden. Nach Kokultur mit aktivierten Lymphozyten wurde kein Anstieg des Todes von extravillösen Trophoblasten beobachtet.

Dieses Protokoll ermöglicht es Menschen, Wissenschaftlern, primäre extravillöse Trophoblasten für eine Vielzahl von Tests zu verwenden. Der Vorteil liegt in der hohen Viabilität, die Analysen mit Zellkultur, Kaltkultur, Durchflusszytometrie, Proteomik und Transkriptomik ermöglicht, wobei diese wirklich gut geeigneten, leistungsfähigen extravillösen Trophoblasten verwendet werden. Einer der wichtigsten Aspekte unseres Protokolls ist also, dass Sie frische Plazentamaterialien verwenden müssen.

Du kannst sie nicht kühlen. Trophoblasten lieben das Sterben, also nehmen Sie bitte das Plazentumgewebe so schnell wie möglich nach der Geburt, vorzugsweise innerhalb von zwei Stunden nach der Geburt, und bewahren Sie sie jederzeit bei Zimmertemperatur auf. Dies ist entscheidend, um einen hoch lebensfähigen extravillösen Trophoblasten zu erhalten.

Einige der zusätzlichen und fortschrittlicheren innovativen Methoden, für die man diese primären Trophoblasten nutzen kann, ist die langfristige Zellkultur. Sie können sie also nutzen, um primäre viertägige Zellkulturen zu etablieren. Zellen sind also bis zu 96 Stunden lebensfähig, was ziemlich lang ist, und ermöglicht es Kaltkulturen mit Immunzellen wie T-Zellen und NK-Zellen.

Eine weitere Innovation ist auch, dass man sie nutzen kann, um trophoblastähnliche Zelllinien mit den von Aoki erstmals beschriebenen Methoden zu etablieren, die wir auch auf diese Kulturen angewendet haben, um langfristig proliferierende Zelltypen zu etablieren, die man für Genom-Editing und andere langfristigere Kulturassays nutzen kann. Der Einsatz dieser innovativen Methoden, einschließlich der Langzeitzellkultur, kann Ihnen meiner Meinung nach wirklich helfen, langfristige mechanistische Kulturen zu entwerfen, bei denen Sie Genom-Editierung, Knock-out- und Knock-in-Gene und Proteine anwenden und einige dieser Trophoblasten überexprimieren, um viel mehr mechanistische Details darüber zu erhalten, wie diese Trophoblasten Toleranz erzwingen oder Immunität und mehr Zytotoxizität ermöglichen, wenn sie mit Immunpopulationen interagieren.