Name: Reinigung von HLA-G+ -Extravillen-Trophoblasten aus menschlichen Term-Plazentageweben für Phänotypisierung und funktionelle Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von HLA-G+ Extravillösen Trophoblasten aus menschlichen Plazentageweben mittels FACS-Sortierung. Diese Methode ermöglicht funktionelle Analysen und Untersuchungen der Immunologie an der mütterlich-fetalen Grenzfläche.

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<ol><li>Papuchova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+types+of+HLA-G%2B+extravillous+trophoblasts+that+have+distinct+immune+regulatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Three types of HLA-G+ extravillous trophoblasts that have distinct immune regulatory properties.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (27), 15772-15777 (2020).</li>
<li>Hamilton, I., Ikumi, N. M., Kshirsagar, S., Goodman, W. A., Tilburgs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+primary+HLA-G%2B+extravillous+trophoblasts+and+HLA-G%2B+EVT-like+cell+lines+to+study+maternal-fetal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Utilizing primary HLA-G+ extravillous trophoblasts and HLA-G+ EVT-like cell lines to study maternal-fetal interactions.</a> STAR Protoc. 4 (2), 102276(2023).</li>
<li>Tilburgs, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+HLA-G%2B+extravillous+trophoblasts%3A+Immune-activating+cells+that+interact+with+decidual+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human HLA-G+ extravillous trophoblasts: Immune-activating cells that interact with decidual leukocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7219-7224 (2015).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progestogen-driven+B7-H4+contributes+to+onco-fetal+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Progestogen-driven B7-H4 contributes to onco-fetal immune tolerance.</a> Cell. 187 (17), 4713-4732.e19 (2024).</li>
<li>Apps, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+profile+of+first+trimester+villous+and+extravillous+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells.</a> Placenta. 32 (1), 33-43 (2011).</li>
<li>Apps, R., Gardner, L., Hiby, S. E., Sharkey, A. M., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+of+human+leucocyte+antigen-C+molecules+at+the+surface+of+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Conformation of human leucocyte antigen-C molecules at the surface of human trophoblast cells.</a> Immunology. 124 (3), 322-328 (2008).</li>
<li>Moffett, A., Loke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+placentation+in+eutherian+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunology of placentation in eutherian mammals.</a> Nat Rev Immunol. 6 (8), 584-594 (2006).</li>
<li>Papúchová, H., Meissner, T. B., Li, Q., Strominger, J. L., Tilburgs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dual+role+of+HLA-C+in+tolerance+and+immunity+at+the+maternal-fetal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The dual role of HLA-C in tolerance and immunity at the maternal-fetal interface.</a> Front Immunol. 10, 2730(2019).</li>
<li>Vander Zwan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+signature+of+activation+and+dysfunction+allows+human+decidual+CD8%2B+T+cells+to+provide+both+tolerance+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mixed signature of activation and dysfunction allows human decidual CD8+ T cells to provide both tolerance and immunity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (2), 385-390 (2018).</li>
<li>Salvany-Celades, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+types+of+functional+regulatory+T+cells+control+T+cell+responses+at+the+human+maternal-fetal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Three types of functional regulatory T cells control T cell responses at the human maternal-fetal interface.</a> Cell Rep. 27 (9), 2537-2547.e5 (2019).</li>
<li>Mahajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+decidual+CD8%2B+T+cells+include+distinct+effector+memory+and+tissue-resident+memory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific decidual CD8+ T cells include distinct effector memory and tissue-resident memory cells.</a> JCI Insight. 8 (17), e171806(2023).</li>
<li>Crespo, ÂC., Strominger, J. L., Tilburgs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+KIR2DS1+by+decidual+natural+killer+cells+increases+their+ability+to+control+placental+HCMV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of KIR2DS1 by decidual natural killer cells increases their ability to control placental HCMV infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (52), 15072-15077 (2016).</li>
<li>Burton, G. J., Redman, C. W., Roberts, J. M., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-eclampsia%3A+Pathophysiology+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Pre-eclampsia: Pathophysiology and clinical implications.</a> BMJ. 366, 12381(2019).</li>
<li>Inada, K., Shima, T., Nakashima, A., Aoki, K., Ito, M., Saito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+regulatory+T+cells+in+decidua+of+miscarriage+cases+with+abnormal+or+normal+fetal+chromosomal+content%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of regulatory T cells in decidua of miscarriage cases with abnormal or normal fetal chromosomal content.</a> J Reprod Immunol. 97 (1), 104-111 (2013).</li>
<li>Tsuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonally+expanded+decidual+effector+regulatory+T+cells+increase+in+late+gestation+of+normal+pregnancy+but+not+in+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clonally expanded decidual effector regulatory T cells increase in late gestation of normal pregnancy but not in preeclampsia.</a> Front Immunol. 9, 1934(2018).</li>
<li>Tsuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cell+heterogeneity+in+gestational+age+and+preeclampsia+using+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cell heterogeneity in gestational age and preeclampsia using single-cell RNA sequencing.</a> Front Immunol. 15, 1401738(2024).</li>
<li>Pique-Regi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+signatures+of+the+human+placenta+in+term+and+preterm+parturition%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional signatures of the human placenta in term and preterm parturition.</a> eLife. 8, e52004(2019).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+developmental+deficiencies+in+placentation+and+decidualization+in+late-onset+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals developmental deficiencies in placentation and decidualization in late-onset preeclampsia.</a> Front Immunol. 14, 1142273(2023).</li>
<li>Morita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+TCR+repertoire+and+PD-1+expression+in+decidual+and+peripheral+CD8%2B+T+cells+reveals+distinct+immune+mechanisms+in+miscarriage+and+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of TCR repertoire and PD-1 expression in decidual and peripheral CD8+ T cells reveals distinct immune mechanisms in miscarriage and preeclampsia.</a> Front Immunol. 11, 1082(2020).</li>
<li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proportion+of+peripheral+blood+and+decidual+CD4%2B+CD25bright+regulatory+T+cells+in+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Proportion of peripheral blood and decidual CD4+ CD25bright regulatory T cells in pre-eclampsia.</a> Clin Exp Immunol. 149 (1), 139-145 (2007).</li>
<li>Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidual+and+peripheral+blood+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells+in+early+pregnancy+and+spontaneous+abortion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Decidual and peripheral blood CD4+CD25+ regulatory T cells in early pregnancy and spontaneous abortion.</a> Mol Hum Reprod. 10 (5), 347-353 (2004).</li>
<li>Shannon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+assessment+of+primary+and+stem+cell-derived+human+trophoblast+organoids+as+placenta-modeling+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell assessment of primary and stem cell-derived human trophoblast organoids as placenta-modeling platforms.</a> Dev Cell. S1534-5807, 00043-00051 (2024).</li>
<li>Apps, R., Murphy, S. P., Fernando, R., Gardner, L., Ahad, T., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+expression+of+primary+trophoblast+cells+and+placental+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">HLA expression of primary trophoblast cells and placental cell lines.</a> Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).</li>
<li>Okae, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+trophoblast+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Derivation of human trophoblast stem cells.</a> Cell Stem Cell. 22 (1), 50-63.e6 (2018).</li>
<li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+screening+in+human+trophoblast+stem+cells+reveals+shared+and+distinct+aspects+of+placental+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">CRISPR screening in human trophoblast stem cells reveals shared and distinct aspects of placental development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (51), e2311372120(2023).</li>
<li>Hori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophoblast+stem+cell-based+organoid+models+of+the+human+placental+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Trophoblast stem cell-based organoid models of the human placental barrier.</a> Nat Commun. 15 (1), 962(2024).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+multi-omic+profiling+of+human+placental+syncytiotrophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus multi-omic profiling of human placental syncytiotrophoblasts.</a> Nat Genet. 56 (2), 294-305 (2024).</li>
<li>Ikumi, N. M., Koenig, Z., Mahajan, S., Gray, C. M., Tilburgs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+primary+human+placental+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of primary human placental leukocytes.</a> STAR Protoc. 4 (2), 102277(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsin/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Zentrifugenrohre</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-955-238</td><td></td></tr><tr><td>-20&nbsp;&deg;C Gefrierschrank</td><td>jeder Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;C 5% CO2 Inkubator</td><td>jeder Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg;C Kühlschrank</td><td>jeder Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL konische Zentrifugenrohre</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-955-240</td><td></td></tr><tr><td>55 mM &beta;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>6 &frac12;&rdquo; Schere</td><td>jeder Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-AAD-Vitalitäts-Färbelösung</td><td>Biolegend</td><td>420403</td><td></td></tr><tr><td>-80&nbsp;&deg;C Gefrierschrank&nbsp;</td><td>jeder Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>REPROCELL</td><td>04-0014</td><td></td></tr><tr><td>AF700, Maus, IgG1 k Isotyp-Kontrolle</td><td>Biolegend</td><td>400144</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 Ratten IgG2a, &kappa; Isotyp-Kontrolle</td><td>Biolegend</td><td>400524</td><td></td></tr><tr><td>B7H3 PE/Dazzle594</td><td>Biolegend</td><td>351012</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSymphony A5 SE Zellanalysator</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bigfoot Spectral Zellsortierer</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovines Serumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>BSL2 Biosicherheitsschrank</td><td>jeder Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV605 Maus IgG1, &kappa; Isotyp-Kontrolle</td><td>BD Biosciences</td><td>562652</td><td></td></tr><tr><td>BV750 Maus IgG1, &kappa; Isotyp-Kontrolle&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>400105</td><td></td></tr><tr><td>BV785 Maus IgG1, &kappa; Isotyp-Kontrolle</td><td>Biolegend</td><td>400170</td><td></td></tr><tr><td>CD45 BV785</td><td>Biolegend</td><td>304048</td><td></td></tr><tr><td>Zelldissoziationssieb</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td>CD1-1KT (Maschenweite 60)</td><td></td></tr><tr><td>Zellsiebe 40&micro;m, 70&micro;m, 100&micro;m</td><td>Thermo Fisher</td><td>22363547; 22363548; 22363549</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent Caspase-3/7 Grün-Detektionsreagenz</td><td>invitrogen</td><td>C10423</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>jeder Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021, 3mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML 1046-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette mit gebogener Spitze</td><td>jeder Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>VWR Life Science</td><td>97063-136</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 für T-Zellexpansion und -Aktivierung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>EGF, menschlich, rekombinant, tierfrei</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15-1MG</td><td></td></tr><tr><td>EGFR1 BV711</td><td>Biolegend</td><td>352920</td><td></td></tr><tr><td>FACS DIVA-Software</td><td>BD Biosciences</td><td>https://www.bdbiosciences.com/ja-jp/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll Paque Plus</td><td>Cytivia</td><td>17144003</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>FlowJo</td><td>https://www.flowjo.com/</td><td></td></tr><tr><td>HLA-C PE</td><td>BD Biosciences</td><td>566372</td><td></td></tr><tr><td>HLA-E PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>342608</td><td></td></tr><tr><td>HLA-G APC</td><td>abcam</td><td>AB40915</td><td></td></tr><tr><td>Human AB Serum</td><td>Corning</td><td>35060CI</td><td></td></tr><tr><td>Humanes Choriongonadotropin (hCG) (2500IE/mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1063</td><td></td></tr><tr><td>Humanes Fibronektin (1mg/mL)</td><td>Corning</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>Humanes rekombinante IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selen, 100x (ITS-G)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>ITGA6 APC/cy7</td><td>Biolegend</td><td>313627</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0278</td><td></td></tr><tr><td>Magnetseparator</td><td>promega</td><td>Z5342</td><td></td></tr><tr><td>Neugeborenen-Kalbsserum (NCS)</td><td>gibco</td><td>16010-159</td><td></td></tr><tr><td>PD-L1 AF700</td><td>invitrogen</td><td>56-5983-42</td><td></td></tr><tr><td>PD-L2&nbsp; BV750</td><td>Biolegend</td><td>345528</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 Maus, IgG1 k, Isotyp-Kontrolle</td><td>Biolegend</td><td>400126</td><td></td></tr><tr><td>PE/Dazzle594 Maus IgG1, &kappa; Isotyp-Kontrolle</td><td>Biolegend</td><td>400176</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin und Streptomycin&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat-gepufferte Salzlösung 10X-Lösung</td><td>ThermoFisher</td><td>BP399-4</td><td></td></tr><tr><td>PVR BV605</td><td>BD Biosciences</td><td>748276</td><td></td></tr><tr><td>FBS Forschungsqualität</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB12999102</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep Human CD8+ T Zell-Anreicherungs-Cocktail</td><td>Stem Cell</td><td>15023</td><td></td></tr><tr><td>SB431542. 10 mM</td><td>Apex-Bio</td><td>A8249</td><td></td></tr><tr><td>Schüttelwasserbad 37&nbsp;&deg;C</td><td>jeder Lieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryple Express 1x ohne Phenolrot</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>VPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 10 Serumfreies hämatopoetisches Zellmedium</td><td>Lonza</td><td>04-380Q</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>688000-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

reinigung von hla-g+ -extravillen-trophoblasten aus menschlichen term-plazentageweben für phänotypisierung und funktionelle analyse

Purification of HLA-G+ Extravillous Trophoblasts from Human Term Placental Tissues for Phenotyping and Functional Analysis

Erwartete Zellergaben
Von 15 ml Decidua basalis ergibt das erwartete HLA-G+ EVT 0,1–0,3 × 106Zellen aus der ersten Verdauung und 0,1–0,6 × 106 Zellen aus der zweiten Verdauung (insgesamt 0,2–0,8 × 106Zellen). Aus 30 ml Chorionmembran werden die erwarteten HLA-G+-EVT-Erträge 0,4–1,0 × 106Zellen aus der ersten Verdauung und 0,4–1,5 × 106Zellen aus der zweiten Verdauung (insgesamt 0,8–2,5 × 106Zellen) erwartet. Der Anteil der Caspase 3/7-7-AAD-Live-EVT in den Isolaten wird voraussichtlich bei 90-95 % liegen.
Primäre HLA-G+ EVT-Kultur
Die Flowzytometrieanalyse der Linienmarker (HLA-G, HLA-C, EGFR) und Zelltodesmarker zeigte, dass dieses Protokoll eine lebensfähige primäre EVT-Kultur bis Tag 4 (96 Stunden nach dem Plattieren des sortierten EVT) liefert (Abbildung 1B-D). Repräsentative Lichtmikroskopiebilder von primären chorionischen und d.basalis HLA-G+ EVT werden nach 24, 48 und 72 Stunden Kultur gezeigt (Abbildung 2A-F).
Kokultur primärer HLA-G+ EVT mit T-Cellen
Dieses Protokoll verbesserte die Lebensfähigkeit der primären EVT 96 Stunden nach der Isolierung von der Plazenta – eine Verbesserung gegenüber unserem vorherigen Bericht 1,2,10. Daher ermöglicht es die Analyse von EVT-Reaktionen nach Kokultur mit vorstimulierten Lymphozyten, was eine akute Entzündung an der mütterlich-fetalen Schnittstelle nachahmt. EVT exprimiert polymorphe HLA-C sowie immunsuppressive kohemmende Moleküle wie PD-L1, PD-L2, PVR (auch bekannt als CD155), B7H3 und HLA-E, bestimmt durch extrazelluläre Durchflusszytometrie-Färbung (Abbildung 3A,B). EVT erhöhte die Expression von HLA-C sowie von PD-L1, PD-L2 und HLA-E, erhöhte jedoch nicht die Expression von PVR und B7H3 bei Kokultivierung mit aktivierten Lymphozyten für 72 Stunden gemäß Protokollabschnitt 8 (Abbildung 4A,B). Außerdem wurde kein Anstieg der EVT-Todesfälle beobachtet, wie die Färbung von 7AAD und Caspase 3/7 zeigt (Abbildung 4C,D).
<img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Abbildung 1. Die Gating-Strategie für EVT-Zellsortierung und Durchflusszytometrieplots nach der Kultivierung des sortierten EVT. (A) Die repräsentative Gating-Strategie zur Sortierung von Decidua basalis EVT und chorionischer EVT. R1 ist das Live-Zellgatter im Forward-Side Scatter-Plot. R2 ist das Tor zum Ausschluss von CD45+-Leukozyten. R3 ist das HLA-G+EGFR+EVT-Gate. R4 ist der 7-AAD-Caspase3/7-Live-EVT. Obwohl das R4-Gatter nicht unbedingt für die Sortierung benötigt wird, wird es hier gezeigt, um die Viabilität des primären EVT zu demonstrieren. (B) Repräsentative Flowzytometriediagramme sortierter HLA-G+EGFR+EVT, nach 96 Stunden in vitro Kultur. (C,D) Frequenzen von Caspase 3/7-7-AAD- Live-EVT während der Art (Tag 0) und 96 Stunden Kultivierung (Tag 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Abbildung 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Abbildung 2. Die Morphologie von EVT während der In-vitro-Kultur . Repräsentative Lichtmikroskopie-Bilder von chorionischer EVT nach (A) 24 Stunden, (B) 48 Stunden und (C) 72 Stunden Kultur sowie Decidua basalis EVT nach (D) 24 Stunden, (E) 48 Stunden und (F) 72 Stunden Kultur. Maßstabsleiste = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Abbildung 3. Immunologische Phänotypen der primären EVT. (A) Die repräsentativen Flussdiagramme von HLAs und koinhibitorischen Molekülen auf primärem EVT, bestimmt durch extrazelluläre Flowzytometrie-Färbung (Tag 0). (B) Gepaarte Liniendiagramme zeigen die rohe MFI der IgG-Kontrolle und vollständige Färbung jedes Markers von d. basalis EVT (blau) und chorionischer EVT (grün) am Tag 0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Abbildung 4. Immunologische Phänotypen der primären EVT mit oder ohne aktivierte Lymphozyten (Tag 4). (A) Repräsentative Flussdiagramme von EVT nach der 72-Stunden-Kultur (Tag 4) mit oder ohne aktivierte Lymphozyten von Drittanbietern. (B) Gepaarte Liniendiagramme zeigen MFI von EVT mit oder ohne aktivierte Lymphozyten von Drittanbietern. Blaue Diagramme stehen für decidua basalis EVT, grüne Diagramme für chorionische EVT. (C) Repräsentative Flusszytometrie-Plots für Caspase 3/7-7-AAD – Live-EVT mit oder ohne aktivierte Lymphozyten von Drittanbietern am Tag 4. (D) Gepaarte Liniendiagramme zeigen Häufigkeiten von Caspase 3/7-7-AAD-Live-EVT mit oder ohne aktivierte Lymphozyten von Drittanbietern. Blaue Diagramme stehen für decidua basalis EVT, grüne Diagramme für chorionische EVT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
Tabelle 1. Schlüsselreagenzien für die Gewebedissektion und Verdauung. Siehe auch 1,2,24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/Table%201_final.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 2. Wichtige Reagenzien für die EVT-Kultur und Kokultur mit T-Zellen. Siehe auch 1,2,24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/Table%202_v2_final.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 3. Schlüsselantikörper und Reagenzien für Sortierung und Flowzytometrie-Analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/Table%203_final.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Reinigung von HLA-G+ -Extravillen-Trophoblasten aus menschlichen Term-Plazentageweben für Phänotypisierung und funktionelle Analyse

The human maternal-fetal interface represents a unique immunological environment where maternal immune cells and fetal extravilllous trophoblasts (EVT) ...

purification-hla-g-extravillous-trophoblasts-from-human-term

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir haben die Plazenta als wichtiger blutbildenden Organ während der Entwicklung identifiziert. Wir fanden, dass hämatopoetische Stammzellen (HSZ) sind beide generiert und erweitert in der Plazenta in einzigartige Mikroumgebung Nischen. Hier beschreiben wir experimentelle Techniken zur Isolierung und Visualisierung von HSZ in der Maus Plazenta erforderlich.

Isolierung und Analyse von hämatopoetischen Stammzellen aus der Plazenta

In diesem Protokoll beschreiben wir die Zerlegung der Plazenten von der Maus auf die Schwangerschaft d10.5, durch Isolation von Trophoblastzellen mit einem Percoll-Gradienten folgen. Wir demonstrieren dann Verwendung der isolierten Zellen in einem Matrigel Invasionsassay.

Isolation of Primary Maus Trophoblastzellen und Trophoblastinvasion Assay

Wir beschreiben die Verwendung der monoklonalen Antikörper TG30 (CD9) und GCTM-2 zum kombinierten Nachweis von Zelloberflächenantigenen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) zur Identifizierung und Anreicherung lebender menschlicher embryonaler Stammzellen (hESC) mit positiver Selektion und auch zur Verwendung negativer Selektion zur Reinigung von hESCs aus einer gemischten Zellpopulation.

Anreicherung und Reinigung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Nachweis von Zelloberflächenantigenen unter Verwendung der monoklonalen Antikörper TG30 und GCTM-2

Hierin wird ein Protokoll zur Isolierung und weiteren Untersuchung der infiltrierenden Leukozyten der Decidua basalis und der Decidua parietalis - der menschlichen mütterlich-fetalen Schnittstelle - beschrieben. Dieses Protokoll bewahrt die Integrität der Zelloberflächenmarker und liefert genügend lebensfähige Zellen für nachgelagerte Anwendungen, wie die Durchflusszytometrie-Analyse beweist.

Isolation von Leukozyten aus dem menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur siRNA effizient transfizieren in frisch isolierten menschlichen villöse Zytotrophoblasten Verwendung Mikroporation und Identifizieren von DNA-Protein-Komplexe in diesen Zellen. Transfizierte Zellen können durch Western-Blot überwacht werden und EMSA-Analysen während der 4-tägigen Kulturzeit.

siRNA-Transfektion und EMSA-Analysen auf frisch isolierten menschlichen Villöse Cytotrophoblasten

Dieses Manuskript präsentiert ein einzigartiges in vitro Modell von immungereinigten humanen villösen Zytotrophoblastzellen, die unter Hypoxie/Reoxygenierung kultiviert wurden. Dieses Modell ist geeignet, um die schützende Wirkung vielversprechender Behandlungen wie Melatonin auf Schwangerschaftskomplikationen zu untersuchen, die mit erhöhtem oxidativem Stress und veränderter Plazentafunktion verbunden sind.

Menschliche Primär Trophoblast Zellkulturmodell die schützende Wirkung von Melatonin gegen Hypoxie / Reoxygenierung induzierte Störung zu studieren

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur effizienten Erzeugung menschlicher trophoblastischer Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung des knochenmorphogenen Proteins 4 und Inhibitoren der Activin/Nodal-Signalwege. Diese Methode eignet sich für die effiziente Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen und kann große Mengen an Zellen für die genetische Manipulation erzeugen.

In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

Diese Studie stellt ein Protokoll für die reversible Gewebe, clearing, Immunostaining, 3D-Darstellung und Analyse von vaskulären Netzwerken im menschlichen Plazenta Zotten Proben in der Größenordnung von 1 bis 2 mm3.

Dreidimensionale Darstellung und Analyse der Immunolabeled, geklärt menschlichen Plazenta Zotten vaskulärer Netzwerke

Dieses Protokoll zeigt eine Methode zur Isolierung von primären menschlichen deziduale Zellen gesammelt von den fetalen Membranen der Begriff plazentas, die für eine Vielzahl von Anwendungen (z. B. Immunocytochemistry, Durchflusszytometrie, etc.) verwendet werden können mit dem Ziel zur Untersuchung der Rolle von verschiedenen Zell-Populationen in Komplikationen während der Schwangerschaft.

Isolation von primären menschlichen Deziduale Zellen aus der fetalen Membranen der Begriff Plazentas

Hier beschreiben wir eine Methode zur Erwärmung verglaster menschlicher Blastozysten, die sie durch die Implantationsphase in vitro kultivieren, sie in einzelne Zellen verdauen und frühe Trophoblastenzellen für weitere Untersuchungen sammeln.

Einzelzellsammlung von Trophoblastenzellen im Peri-Implantationsstadium menschliche Embryonen

Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung von menschlichen Plazentagewebe-Explantierungen, die an einer Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche kultiviert werden, um virale Infektionen zu untersuchen.

Ex vivo Kultur menschlicher Plazenta-Explants zur Untersuchung der viralen Übertragung über die mütterlich-fetale Grenzfläche

Erfahren Sie die Isolierung von HLA-G+ Extravillösen Trophoblasten aus menschlichen Plazentageweben mittels FACS-Sortierung. Diese Methode ermöglicht funktionelle Analysen und Untersuchungen der Immunologie an der mütterlich-fetalen Grenzfläche.

Reinigung von HLA-G+ -Extravillen-Trophoblasten aus menschlichen Term-Plazentageweben für Phänotypisierung und funktionelle Analyse (Video) | JoVE Journal

Reinigung von HLA-G⁺ -Extravillen-Trophoblasten aus menschlichen Term-Plazentageweben für Phänotypisierung und funktionelle Analyse

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