Der Nijmeger Hämostase-Assay: Gleichzeitige fluorogene Messung der Thrombin- und Plasminbildung in einem einzigen Bohrloch

Meine Forschung konzentriert sich darauf, sekundäre Hämostase und Fibrinolyse gemeinsam zu messen, um das allgemeine hämostatische Gleichgewicht zu bestimmen. Die meisten aktuellen Assays bewerten isolierte Komponenten der Koagulation oder Fibrinolyse. Dieser Assay misst beide Prozesse gleichzeitig in einem Assay.

Zu Beginn schalten Sie den Fluoreszenzplattenleser ein und lassen Sie ihn auf 37 Grad Celsius ausgleichen. Konfigurieren Sie die Filtereinstellungen in der Software, indem Sie die Anzahl der Wellenlängenpaare auf zwei setzen. Stellen Sie die Anregungswellenlänge für Thrombin auf 355 Nanometer und 485 Nanometer für Plasmin ein.

Dann stellen Sie die Emissionswellenlänge auf 460 Nanometer für Thrombin und 525 Nanometer für Plasmin ein. Als Nächstes stellen Sie den Plattentyp auf eine 96 Well Greiner Flat Bottom Black Microplate ein. Navigieren Sie zum Lesebereich und definieren Sie das Plattenlayout mit maximal 20 Brunnen pro Platte.

Konfigurieren Sie die PMT- und Optikeinstellungen, indem Sie die PMT-Verstärkung auf 200 Volt setzen und die Anzahl der Blitze pro Lesesignal auf sechs setzen. Dann navigiere zu Timing, um die Timing-Einstellungen zu bestätigen, mit einer Gesamtlaufzeit von einer Stunde, neun Minuten und 30 Sekunden, einem Intervall von 30 Sekunden. Navigiere zu Shake, um ein Shake von drei Sekunden vor der ersten Messung zu bestätigen.

Navigiere zu weiteren Einstellungen, um sicherzustellen, dass die Lesereihenfolge auf Spalte gesetzt ist. Konfigurieren Sie die Einstellungen für Compound Transfer Before Read, indem Sie die Anzahl der Compound-Transfers auf eins und das Anfangsvolumen auf 120 Mikroliter setzen. Überprüfen Sie, dass die Pipettenhöhe 130 Mikroliter, das Volumen 20 Mikroliter, die Rate ein Mikroliter pro Sekunde und der Zeitpunkt 14 Sekunden beträgt.

Unter Compound Source bestätigen Sie das 96-Well-Compound-Platten-Format und wählen Sie speziell die Beckman 96 2,3-Milliliter-Option. Bestätigen Sie die Layout-Einstellungen von Pipette Tips, indem Sie die richtigen Spalten auswählen. Jetzt navigiere zu Spalten für zusammengesetzte Tipps und wähle die richtigen Spalten aus.

Stellen Sie die Temperatur des Mikroplatten-Shakers auf 37 Grad Celsius ein und überprüfen Sie die Temperatur vor der Benutzung. Dann stellen Sie die Schüttelintensität auf 1.100 Umdrehungen pro Minute ein. Anschließend das Patientenplasma und normales gesammeltes Plasma in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für bis zu 10 Minuten auftauen.

Mischen Sie die Plasmaproben gründlich und überprüfen Sie das vollständige Auftauen ohne sichtbare Kryoprecipitat. Mit einer Pipette werden 80 Mikroliter Patientenplasma oder normales Plasma zu den vorausgewählten Bohrlöchern gegeben, wobei für jede Probe eine frische Pipettenspitze verwendet wird. Anschließend bereitet man die Substratmischung vor, indem man 48 Mikroliter Cephalin mit 48 Mikrolitern Gewebefaktor mischt.

Dazu werden 240 Mikroliter Trinatriumchloridpuffer, dann 96 Mikroliter Thrombinsubstrat und 48 Mikroliter Plasminsubstrat gepipettiert. Pipettieren Sie 20 Mikroliter der Substratmischung in jedes Bohrloch. Schüttel danach.

Nun werden die Mikroplatten in den Fluoreszenzplattenleser eingesetzt und mehrere Minuten lang bei 37 Grad Celsius ausgeglichen. Kombinieren Sie Trinatriumchloridpuffer, Trinatriumchlorid-Calciumchloridpuffer und einen Gewebeplasminogenaktivator, um das Ausgangsreagenz herzustellen. Vortex gründlich zu mischen.

Pipettieren Sie das Ausgangsreagenzgemisch in alle Reihen der Verbindungssäule. Setzen Sie die Platte mit dem Startreagenzgemisch in die Quellschublade ein und beginnen Sie mit der Fluoreszenzmessung. Nehmen Sie alle 30 Sekunden für 70 Minuten Fluoreszenzsignale auf.

Halten Sie die Platte während der gesamten Messung bei 37 Grad Celsius. Für die Datenanalyse exportieren Sie die kinetischen Fluoreszenzdaten als Tabelle mit Zeitpunkten und Fluoreszenzwerten pro Bohrloch. Berechnen Sie die erste Ableitung und zeichnen Sie die Enzymgenerierungskurven für jedes Bohrloch, um die Thrombin- oder Plasmingenerierung über die Zeit zu visualisieren.

Der Hämostase-Test ermöglichte eine gleichzeitige, zeitaufgelöste Messung von Thrombin- und Plasminbildung, um eine integrierte Bewertung der Gerinnung und Fibrinolyse zu ermöglichen. Aus der Thrombin-Erzeugungskurve können mehrere Parameter abgeleitet werden, darunter Verzögerungszeit, Spitzenspitzenhöhe und Thrombinpotenzial. Längere Verzögerungszeiten, niedrigere Spitzenhöhen und reduzierte Thrombinpotenziale deuten auf eine beeinträchtigte Thrombinbildung hin.

Die Plasmin-Erzeugungskurve liefert außerdem mehrere Parameter, darunter die Fibrin-Lysezeit und die Plasmin-Peak-Höhe. Kürzere Fibrin-Lysezeiten und höhere Spitzenhöhen spiegeln eine verstärkte Plasmaerzeugung wider. Thrombin- und Plasmagenerierungskurven von drei gesunden Kontrollpersonen sowie normalem pooliertem Plasma zeigten reproduzierbare Endzeitpunkte der Spitzenhöhe und dienten als Referenzprofile für die normale hämostatische Funktion.

Bei einem Patienten mit einer Faktor-V-Aktivität von 3 % fehlte die Thrombinbildung vollständig. Die Plasmaerzeugung nahm jedoch nur geringfügig zu. Der Patient mit einer Faktor-V-Aktivität von 44 % zeigte eine verminderte Thrombinbildung mit verlängerter Verzögerung und verringerter Spitzenhöhe, während die Plasmaerzeugung im Normalbereich blieb.

Bei Alpha-2-Antiplasmin-Mangel nahm die Plasmaerzeugung mit abnehmender Alpha-2-Antiplasmin-Aktivität zu. Der homozygote Patient mit 23 % Aktivität zeigte einen frühen Beginn der Plasminbildung, eine kürzere Fibrinlysezeit und einen höheren Plasma-Peak. Diese Veränderungen wurden auch beim heterozygoten Patienten mit 73 % Aktivität beobachtet, obwohl sie nicht so ausgeprägt waren.

Der Hämostasis-Test eignet sich hervorragend für die Forschung zu seltenen Koagulationsfaktormangeln, fibrinolytischen Störungen und hämostatischen Effekten von Medikamenten. Die Hauptherausforderungen sind die Standardisierung der Technik und die Normalisierung der Ergebnisse zur Verbesserung der Vergleichbarkeit zwischen Räumen und Laboren. Zukünftige Arbeiten könnten sich auf die Automatisierung des Assays und die Entwicklung von Anpassungen zur Kompatibilität mit Vollblut- oder plattenreichem Plasma konzentrieren.