Verbesserung von CRISPR-Cas9-Bildschirmen in CAR-T-Zellen: Eine verfeinerte Methode zur Bibliotheksvorbereitung

Unsere Forschung konzentriert sich auf den Einsatz von CRISPR-Screening-Ansätzen, um Ziele zu identifizieren und die Wirksamkeit von CAR-T-Zelltherapien zu verbessern. Aktuelle experimentelle Herausforderungen umfassen die Entwicklung reproduzierbarer Labormethoden in CRISPR-Screening-Ansätzen. Zu Beginn fügen Sie eine vorbestimmte Menge der Lenta-viralen CRISPR-Bibliothek zu einer 24-Well-Platte mit T-Zellen hinzu.

Fügen Sie Poly-Brain mit einer Endkonzentration von acht Mikrogramm pro Milliliter hinzu. Sanft mischen, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 700 G für 90 Minuten bei 32 Grad Celsius, um eine Spin-Fection durchzuführen.

Nach der Zentrifugation wird die Platte vorsichtig von der Zentrifuge entfernt. Ersetzen Sie das Medium durch frisches T-Zell-Wachstumsmedium. Nach sechs Stunden fügen Sie den CAR-Lenta Virusvektor bei einer Infektionsmultiplikation von drei hinzu.

Inkubieren Sie die Zellen vier Tage lang bei 37 Grad Celsius. Nach Abschluss der Inkubation sammeln Sie die CAR-T-Zellen. Waschen Sie einmal mit PBS.

Färben Sie die Zellen dann mit Acradine-Orange-Propidiumiodid und zählen Sie sie in einem fluoreszierenden Zellzähler. Bereiten Sie eine vier-mikromolare Lösung von Cas9 im Elektroporationspuffer vor. Sechs CAR-T-Zellen in 50 Mikrolitern Cas9-Lösung fünfmal zehn auf Leistung aufhängen.

Dann pipettieren Sie 50 Mikroliter der Zellsuspension in jede Mulde eines Mehrbrunnen-Cuvete-Streifens, ohne dass Blasen entstehen. Entfernen Sie sichtbare Blasen, indem Sie vorsichtig mit einer Pipettenspitze an den Rändern des Brunnens entlangfahren. Verwenden Sie das Expand-T-Cell-3-Programm, um die CAR-T-Zellen zu nukleoffektieren.

Stellen Sie die Cuvetten für 40 Minuten in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Die nukleoffektierten Zellen im T-Zell-Wachstumsmedium wieder aufhängen. Dann brütet man erneut bei 37 Grad Celsius für drei Tage aus.

Zähle die Zellen mit Acradine-Orangen-Propidiumiodid-Färbung in einem fluoreszierenden Zellzähler. Nachdem Sie die Zelldichte auf zehn pro Milliliter angepasst haben, fügen Sie Puromycin zu einer Endkonzentration von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter hinzu. Nach sechs Tagen Inkubation wird der Prozentsatz der CAR-positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie bewertet.

Dann sortiere CAR-T-Zellpopulationen und lagere Trockenzellpellets bei minus 80 Grad Celsius. Extraktion von genomischer DNA aus den Proben mittels einer Methode der Zell- und Gewebe-DNA-Extraktion. Messung der genomischen DNA-Konzentration mit einem doppelsträngigen DNA-Quantifizierungskit.

Anschließend werden bis zu fünf Mikrogramm genomische DNA mit 20 Einheiten der ausgewählten Restriktionsenzyme in einem Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern verdauet. Über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Thermocycler inkubieren. Am nächsten Tag bereiten Sie 10 Milliliter Elutionspuffer mit 10 Millimolartris HCL und 50 Millilitern frischem 70%-Ethanol vor.

Pipettieren Sie 100 Mikroliter des verdauten Produkts in ein Rohr mit wirbelgerieten Perlen. Pipette die Suspension gründlich mischen und fünf Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren, bevor man weitere fünf Minuten magnetisiert. Während Sie am Magneten sind, entsorgen Sie das Überstandsmittel und pipettieren Sie 200 Mikroliter der 70%igen Ethanollösung, ohne das Pellet zu stören.

Nach 30 Sekunden entsorgt man das Überdachungsmittel und führt zwei weitere Alkoholwäschen durch. Nach zwei Waschgängen lassen Sie die Perlen zwei Minuten trocknen und nehmen Sie sie dann vom Magneten. Fügen Sie 40 Mikroliter Elucian Puffer hinzu und pipetten, um die Perlen wieder aufzuhängen.

Magnetisieren Sie die Suspension für zwei Minuten und übertragen Sie dann das Supernatant in ein neues Rohr. Fügen Sie einen X-Wash-Bindungspuffer zu einem Rohr hinzu, das ein Milligramm Vortex-Streptavidin-Magnetperlen enthält. Pipette, um die Perlen im Puffer wieder aufzuhängen.

Dann die Suspension für eine Minute auf einen Magneten legen, das Überlagerungsmittel entsorgen und noch zwei weitere Waschen durchführen. Nach dem dritten Waschen werden die Perlen in einem Puffer mit zwei Wash Binding Buffers neu aufgetragen. Dann fügen Sie fünf Mikroliter 10 mikromolare biotinylierte Pull-down-Primer zum gereinigten Verdauungsprodukt hinzu.

Die Mischung fünf Minuten lang in einem trockenen Bad bei 96 Grad Celsius inkubieren und anschließend fünf Minuten auf Eis abkühlen. Fügen Sie der Reaktion ein Milligramm vorgewaschene, streptavidin-magnetische Perlen hinzu, sodass sowohl die Reaktion als auch die Streptavidinperlen gleich viele Volumen haben. 20 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren und alle vier Minuten neu suspendieren.

Magnetisieren Sie die Perlen für fünf Minuten und waschen Sie dann dreimal mit einem X-Wash-Bindungspuffer. Schließlich werden die Perlen mit gebundener sgRNA-Kassette in 50 Mikrolitern Elucian-Puffer wieder suspendiert. Bereite die sgRNA-Bibliothek vor, amplifiziere sie und sequenziere sie.

Nach der Antibiotikaselektion zeigten CAR-T-Zellen, die mit der CRISPR-Bibliothek transduziert wurden, bei beiden Spendern nach der Puromycin-Behandlung weiterhin Überleben und Proliferation. Untransduzierte T-Zellen und CAR-T-Zellen ohne CRISPR-Bibliothekstransduktion zeigten keine vergleichbare Proliferation unter Antibiotikaselektion und dienten als negative Kontrolle. Die Verdauung von Restriktionsenzymen mit NDEL und PSPXI erzeugte fragmentierte genomische DNA, während die einzelne Führungs-RNA-Kassette für die Anreicherung erhalten blieb.

Fragmente mit sgRNA wurden dann selektiv amplifiziert. Die Korrelationen zwischen Pearson und Spearman zeigten, dass die Lesezahlen und die Bibliothekskomplexität der einzelnen Guide-RNA in Spendergenom-DNA-Proben im Vergleich zur Plasmidbibliothek beibehalten wurden. Eine robuste Rangaggregationsanalyse identifizierte Gene, die nach Cas9-Editierung bei beiden Spendern signifikant angereichert oder depleziert waren.

Die Analyse der Weganreicherung ergab die wichtigsten Genontologie-Begriffe, die mit den identifizierten genetischen Regulatoren assoziiert sind. Unser Protokoll bietet eine verlässliche Alternative zu bestehenden Labortechniken mit CRISPR-Screening-Ansätzen. Unsere Ergebnisse werden das Fachgebiet voranbringen, indem sie die Entwicklung reproduzierbarer und robusterer CRISPR-Screening-Protokolle unterstützen.

Unsere Ergebnisse ebneten den Weg zur Identifikation von Genen und können moderiert werden, um den Phänotyp und die Funktion der CAR-T-Zellen zu verbessern.