Name: Verbesserung von CRISPR-Cas9-Bildschirmen in CAR-T-Zellen: Eine verfeinerte Methode zur Bibliotheksvorbereitung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-02T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Erfahren Sie eine optimierte CRISPR-Cas9-Screening-Methode für primäre humane CAR-T-Zellen mit enzymatischer Verdauung und selektivem Pulldown. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Identifizierung genetischer Regulatoren zur Verbesserung von Immuntherapien.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>4200 TapeStation</td><td>Agilent</td><td>G2991A</td><td></td></tr><tr><td>Acridine Orange</td><td>Invitrogen</td><td>A1301</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS NEO Separator</td><td>Miltenyi</td><td>130-120-327</td><td>Hochgeschwindigkeitsmagnetzellsortierer</td></tr><tr><td>Biotinylierte Oligos</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer K2 Fluoreszierenzzellzähler</td><td>Revvity</td><td>CMT-K2-MX-150</td><td>Fluoreszierender Zellzähler</td></tr><tr><td>CHT4 Zählkammern</td><td>Revvity</td><td>CHT4-SD100-002</td><td></td></tr><tr><td>CytoSinct CD4 Nanoperlen</td><td>GenScript</td><td>L00863-1</td><td></td></tr><tr><td>CytoSinct CD8 Nanoperlen</td><td>GenScript</td><td>L00864-1</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Agilent</td><td>200418-51</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>11206D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2-Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1,00,98,31,000</td><td></td></tr><tr><td>ExPERT ATX Elektroporator</td><td>MaxCyte</td><td>ExPERT ATx</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Cytiva</td><td>17544203</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2 & mikro; m</td><td>Sarstedt</td><td>83,18,26,001</td><td></td></tr><tr><td>GenCRISPR Ultra NLS-Cas9-Research</td><td>GenScript</td><td>Z03621-1</td><td></td></tr><tr><td>Herculase-Puffer 5X</td><td>Agilent</td><td>600675-52</td><td>5X-Puffer</td></tr><tr><td>Herculase-II-Fusionsenzym</td><td>Agilent</td><td>600679-51</td><td>DNA-Polymerase</td></tr><tr><td>IL-15</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-765</td><td></td></tr><tr><td>IL-7</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-362</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler X50a</td><td>Eppendorf</td><td>6313HG006059</td><td></td></tr><tr><td>MaxCyte-Elektroporationspuffer</td><td>Cytiva</td><td>EPB1</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111L</td><td></td></tr><tr><td>Nukleospin-Gewebe</td><td>Macherey-Nagel</td><td>74,09,52,250</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Merck</td><td>TR-1003-6</td><td></td></tr><tr><td>Grundbücher</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propidiumjod</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>PspXI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0656S</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit HS DNA-Assay</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>R-50x3 Sterile Brunnenverarbeitungseinheit</td><td>MaxCyte</td><td>LM243882</td><td></td></tr><tr><td>T-Zell-Transact menschlich</td><td>Miltenyi</td><td>130-111-160</td><td>T-Zell-Stimulationsreagenz</td></tr><tr><td>Bandstation HSD1000</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>TEXMACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-196</td><td>T-Zell-Wachstumsmedium</td></tr><tr><td>Tris Puffer, 1,0 m, pH 8,0, molekularbiologische Qualität</td><td>EMD Milipore</td><td>648314</td><td></td></tr><tr><td>Wasser, für Molekularbiologie, DNAse-, RNAse- und Protease-frei</td><td>ThermoScientific</td><td>327390010</td><td></td></tr></tbody></table>

verbesserung von crispr-cas9-bildschirmen in car-t-zellen: eine verfeinerte methode zur bibliotheksvorbereitung

Improving CRISPR-Cas9 Screens in CAR T Cells: A Refined Method for Library Preparation

Verbesserung von CRISPR-Cas9-Bildschirmen in CAR-T-Zellen: Eine verfeinerte Methode zur Bibliotheksvorbereitung

Chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapies have demonstrated remarkable efficacy in several hematological malignancies, yet their success has not ...

improving-crispr-cas9-screens-car-t-cells-refined-method-for-library

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Das Video beschreibt einen Prozess zur Herstellung genetisch veränderter CAR-T-Zellen durch das CRISPR-Cas9-System. Die Infektion von T-Zellen mit CRISPR- und CAR-Lentiviren führt zu Veränderungen des Zielgens und zur Synthese eines chimären Antigenrezeptors (CAR), was schließlich zur Bildung genetisch veränderter CAR-T-Zellen führt.

Genetisch veränderte CAR-T-Zellen mit einem CRISPR-Cas9-System

Dieses Protokoll beschreibt im Detail die Generation der Fußabdruck-freie induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse in den Feeder-freien Bedingungen, gefolgt von Bearbeitung mit CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins und Charakterisierung der geänderten einzellige Klone.

Effiziente Erzeugung und Bearbeitung von Feeder-freie IPSCs aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit dem CRISPR-Cas9-System

CRISPR-Cas ist eine leistungsstarke Technologie, die komplexe Genome von Pflanzen und Tieren zu entwickeln. Hier zeigen wir ein Protokoll, das menschliche Genom mit verschiedenen Cas jedoch effizient zu bearbeiten. Wir markieren wichtige Überlegungen und Design-Parameter zur Optimierung der Bearbeitung Effizienz.

Genom-Bearbeitung in Säugetieren Zelllinien mit CRISPR-Cas

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Optimierung der CRISPR-Cas9 um eine höhere Spezifität verlustfrei auf-Aktivität zu erreichen. Wir verfolgen einen gerichteten Evolution genannt Sniper-Bildschirm, um einen Mutant Cas9 mit den gewünschten Eigenschaften zu finden. Sniper-Cas9 ist kompatibel mit gekürzten Single-Guide RNAs und Lieferung in einem Ribonucleoprotein Format, bekannte Strategien zur Erreichung höherer Besonderheiten.

Verwendung von Sniper-Cas9, Off-Target Auswirkungen von CRISPR-Cas9 ohne den Verlust der Zielaktivität durch gerichtete Evolution

Eine CRISPR/SgRNA-Bibliothek wurde zur Vernehmung Protein-kodierenden Gene angewandt. Die Machbarkeit einer SgRNA Bibliothek um die Funktion einer CTCF Grenze in Genregulation zu entdecken bleibt jedoch unerforscht. Hier beschreiben wir eine HOX Loci spezifische SgRNA Bibliothek um die Funktion von CTCF Grenzen in HOX Loci zu erhellen.

HOX Loci Focused CRISPR/SgRNA Bibliothek Screening identifizieren kritische CTCF Grenzen

Die CRISPR-Cas9-Technologie bietet eine effiziente Methode, um das Säugetiergenom in jedem Zelltyp präzise zu bearbeiten, und stellt ein neuartiges Mittel zur Durchführung genomweiter genetischer Screens dar. Ein detailliertes Protokoll, in dem die Schritte erläutert werden, die für die erfolgreiche Durchführung von gepoolten genomweiten CRISPR-Cas9-Bildschirmen erforderlich sind, finden Sie hier.

Gepoolte CRISPR-basierte genetische Screens in Säugetierzellen

Dieses Manuskript beschreibt einen zellbasierten Screening-Ansatz im Genommaßstab zur Identifizierung extrazellulärer Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen.

Identifizierung von Zelloberflächenrezeptoren mit Genom-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Hier beschreiben wir eine schnelle und direkte in vivo CRISPR/Cas9 Screening-Methodik mit Ultraschall-geführten in utero embryonalen lentiviralen Injektionen, um gleichzeitig die Funktionen mehrerer Gene in der Haut und Mundhöhle von immunkompetenten Mäusen zu bewerten.

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening zur gleichzeitigen Bewertung der Genfunktion in Maushaut und Oralhöhle

Hier stellen wir ein Protokoll für die Genbearbeitung in primären menschlichen T-Zellen vor, das die CRISPR Cas-Technologie verwendet, um CAR-T-Zellen zu modifizieren.

Herstellung von humanen CRISPR-engineered CAR-T Zellen

Der Artikel beschreibt ein Protokoll für die Anwendung eines in vitro Modells zur Erschöpfung zur Vervollständigung eines genomweiten CRISPR-Knockout-Screenings in gesunden chimären Antigenrezeptor-T-Zellen von Spendern.

Durchführung eines genomweiten In-vitro-CRISPR-Knockout-Screenings in chimären Antigenrezeptor-T-Zellen

Erfahren Sie eine optimierte CRISPR-Cas9-Screening-Methode für primäre humane CAR-T-Zellen mit enzymatischer Verdauung und selektivem Pulldown. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Identifizierung genetischer Regulatoren zur Verbesserung von Immuntherapien.

Verbesserung von CRISPR-Cas9-Bildschirmen in CAR-T-Zellen: Eine verfeinerte Methode zur Bibliotheksvorbereitung

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