Multiplexierter Immunfluoreszenz-Assay zur räumlichen Bewertung von Altersmarkern in vivo
24. Juli 2026
Multiplexierte Immunfluoreszenz ermöglicht die sequentielle Markierung mehrerer Antikörpermarker innerhalb eines einzelnen Gewebeschnitts, um die räumliche Analyse der Gewebearchitektur und Zellpopulationen zu unterstützen. Hier wird ein Arbeitsablauf zur Multiplexerkennung von seneszenzassoziierten, strukturellen und immunen Markern präsentiert, einschließlich manueller und automatisierter Objektträgervorbereitung, iterativer Bildgebung und Einzelzellanalyse mit digitaler Pathologiesoftware.
Die räumliche Analyse seneszenter Zellen ist wichtig, um ihren Beitrag zu Prozessen wie Altern, Krebs, Immunität und normaler Gewebehomöostase zu verstehen. Der Nachweis von seneszenten Zellen basiert auf der Profilierung mehrerer Biomarker. Die multiplexe Immunfluoreszenzbildgebung ermöglicht das Hochdurchsatz dieser Profile innerhalb eines einzelnen Gewebeschnitts.
Zunächst sollte überprüft werden, dass die 5 Mikrometer dicken, formalinfixierten, paraffin-eingebetteten oder FFPE-Gewebeschnitte mit einer maximalen Größe von 4 x 2 Zentimetern Quadrat zentral auf positiv geladenen Objektträgern montiert sind und innerhalb des Betrachtungsfensters des deckungsfreien Objektträgers deutlich sichtbar sind. Führen Sie die Probenvorbereitungsschritte entweder manuell mit einer Enttarnungskammer oder automatisch mit einem automatisierten Färbemittel durch. Legen Sie die vorbereiteten Objektträger in den Halter für den Deckelschleifen.
Richten Sie die obere und rechte Kante an den Metallanschlägen aus. Verriegeln Sie den Schlitten mit beiden Händen gleichzeitig, um die Kunststoffwellen in die geschlossene Vorhängeschlossposition zu drehen. Stelle sicher, dass der Schlitten komplett flach sitzt und im Halter nicht schwankt.
Setze den ClickWell, setze die Kammer über den Verschluss ein und kneife die Seitenbalken mit beiden Händen, um den Druck zu begrenzen und Brüche zu vermeiden. Laden Sie den Klickbrunnen mit 2 Millilitern Montagemedium mit 50 % Glycerol in phosphatgepufferter Kochsalzlösung über den Einlassanschluss. Fügen Sie in beiden Richtungen ein Barcode-Etikett auf die linke Seite des Objektträgers hinzu und machen Sie dann mit der Bildgebung.
Für Regionsauswahl und Autofluoreszenzanalyse öffnen Sie die Mx Workflow Version 4204, Multiplex-Bildaufnahmesoftware. Klicken Sie auf Tools, um Protocol Publisher auszuwählen. Im Multiplex Protocol Publisher-Popup geben Sie den Protokollnamen ein.
Klicken Sie auf Create Setup Round, gefolgt von Add Next Protocol Round, um mehrere Runden der Biomarker-Markierung zu erstellen. Klicken Sie auf Veröffentlichen und wählen Sie dann im Pop-up-Fenster OK aus. Erwerben Sie den Cy3-Kanal für virtuelle H&E-Bilder.
Klicken Sie auf Folie und dann Erstellen Sie einen neuen Batch. Nachdem Sie den Protokollnamen ausgewählt haben, geben Sie die Folien-ID ein. Klicken Sie auf Folie hinzufügen und wählen Sie dann Batch erstellen, um einen Multiplex-Experiment-Workflow zu erstellen. Öffnen Sie die Cell DYKE-Erfassungssoftware.
Klicken Sie auf Laden, um den Objektträger ins Mikroskop zu laden. Im Dropdown-Menü Tools klicken Sie auf das Raster-Symbol, um die gewünschten Regionen zu definieren, und verwenden Sie das Werkzeug "Verschieben", um die definierten Regionen neu zu positionieren. Als Nächstes verwenden Sie das Werkzeug Zeichnen, um alle nicht erforderlichen Felder abzuwählen, wobei Sie sicherstellen, dass jedes Sichtfeld mindestens zwei benachbarte Sichtfelder hat, um Nahtprobleme zu vermeiden, und klicken Sie auf Regionen speichern.
Im Mx Workflow-Fenster klicken Sie auf Viewer QC, um die Cell DIVE Viewer-Seite zu öffnen und das Gewebebild in 10-facher Vergrößerung zu visualisieren. Klicken Sie auf das Bildkorrektur-Symbol, um die Bildhelligkeit anzupassen, und klicken Sie auf 'Submit QC', um im Pop-up-Fenster 'Slide passieren und laden neu' auszuwählen. Sobald das Bild neu geladen ist, klicken Sie auf Add ROI, um die interessanten Bereiche zu zeichnen und anzupassen.
Wählen Sie die gewünschten Sichtfelder aus und wiederholen Sie die Addition von ROI. Als Nächstes klicken Sie auf Senden ins Labor. Laden Sie die Folie, um die 20x-Autofluoreszenz-Bildaufnahme zu starten.
Im Menü 'Imaging QC' wählen Sie das Kontrollkästchen für die spezifische Dia-ID aus und klicken Sie dann auf Viewer QC. Zoome auf das geladene Bild, um nach unscharfen Bereichen oder Artefakten zu suchen. Überprüfen Sie die Hintergrundbilder für jeden Kanal, die vom finalen Biomarker-Signal abgezogen werden. Klicken Sie auf Submit QC, dann auf Pass und Exit, um Hintergrundbilder zu generieren.
Vor der sequentiellen Biomarker-Färbung zentrifugieren Sie die Antikörper bei 13.000 G für eine Minute bei Raumtemperatur, um Artefakte zu begrenzen. Bereiten Sie die Antikörperlösung mit einer Verdünnung von 1 zu 200 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor, die 0,3 % Rinderserumalbumin (BSA) enthält. Entfernen Sie das Montagemedium, indem Sie das ClickWell-Port auspipetten.
Und dreimal mit 2 Millilitern PBS mit 0,01% Tween 20 oder PBST für 5 Minuten waschen. Gib 350 Mikroliter Antikörperlösung in den Port, um eine vollständige Probenabdeckung innerhalb der Färbekammer sicherzustellen. Inkubiere eine Stunde bei Zimmertemperatur.
Als Nächstes pipettieren Sie die Antikörperlösung aus dem ClickWell-Port. Und dreimal mit 2 Millilitern PBST für 5 Minuten waschen. Füge 2 Milliliter Montagemedium hinzu.
Setzen Sie den ClickWell-Halter ins Mikroskop ein und laden Sie den Objektträger, um mit der 20-fachen Biomarker-Bildgebung zu beginnen. Führen Sie die Bildqualitätskontrolle mit dem Blend-Editor und Bildkorrekturoptionen durch und reichen Sie die Bild-Qualitätskontrolle ein. Pipette das Montagemedium aus dem ClickWell-Port und wasche dreimal mit 2 Millilitern PBST für 5 Minuten.
Bereiten Sie die Farbstoffinaktivierungslösung frisch vor der Anwendung vor. Nach dem Entfernen von PBST geben Sie für jeden Objektträger 2 Milliliter Farbstoffinaktivierungslösung hinzu. Brüte 15 Minuten im Halter des Objektträgers aus.
Pipettiere die Farbinaktivierungslösung aus dem ClickWell-Port und wasche sie mit 2 Millilitern PBST für 5 Minuten. Fügen Sie 2 Milliliter Montagemedium hinzu und setzen Sie den ClickWell-Halter in das Mikroskop ein, um eine automatische, rundenspezifische 20x-Autofluoreszenzbildgebung einzuleiten. Bringen Sie den Workflow voran, indem Sie nach Abschluss QC-Schritte wie angewiesen auf dem Bildschirm übergeben.
Wiederholen Sie die sequentielle Färbung, Farbinaktivierung und Multiplexbildgebung für so viele Marker wie erforderlich und setzen Sie die Untersuchung bis zum Abschluss fort. Verwenden Sie die HALO-Software, um verschiedene Kanäle auszuwählen, um die Lokalisierung von Markern in verschiedenen Bereichen des Gewebekerns zu visualisieren. Klicken Sie auf Analysieren und wählen Sie Vollständiges Bild, um die quantitativen Kennzahlen für einzelne Marker zu analysieren.
Klicken Sie auf Ergebnisse, um die Gesamtzahl der Zellen im analysierten Gewebekern und die Teilmenge der Zellen zu sehen, die bestimmte Marker ausdrücken. Im Vergleich zur automatisierten, auf Objektträger basierenden Methode führte die manuelle Enttarnungskammermethode zu einer höheren Häufigkeit von Gewebeartefakten, die speziell durch Gewebeablösung sowie verlorene oder verrutschte Kerne gekennzeichnet sind. Die Quantifizierung mit digitaler Pathologiesoftware an repräsentativem Bauchspeicheldrüsengewebe zeigte, dass p16-positive Zellen mit niedrigeren LB1-Spiegeln assoziiert waren und umgekehrt, was ein Profil zeigte, das mit seneszenzassoziierten Markermustern übereinstimmt.
Eine Z-Score-normalisierte Heatmap zeigt die Verteilung des p16-positiven Lamin-B1-negativen Senezenz-Phänotyps über verschiedene Gewebe und zeigt hohe Konzentrationen von seneszenten Zellen in Lunge, Nebennieren und Hypophysen, die mit erhöhtem p16 und verminderten LB1-Spiegeln korrespondieren. Umgekehrt zeigten der Blinddarm, der Lymphknoten und die Milz eine geringe Altersbildung, wobei eine hohe LB1- und eine niedrige p16-Expression aufrechterhalten wurde. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung einer Kombination aus Alters-, strukturellen und Immunbiomarkern innerhalb eines einzigen Objektträgers.
Durch die Kombination mehrerer Marker in einer einzigen Probe kann eine räumliche Analyse der Gewebearchitektur und der seneszenten Zellverteilung durchgeführt werden. Zukünftige Anwendungen umfassen die großflächige Profilierung von Senezenz-Biomarkern über mehrere Gewebetypen hinweg sowie die Integration mit räumlichen Omics zur besseren Auflösung der zellulären Heterogenität.
Overview
This article presents a comprehensive protocol for multiplexed immunofluorescence (IF) staining, enabling the simultaneous detection of multiple antibody markers within a single tissue section. The method is particularly suited for profiling senescent cells across diverse human tissue types, allowing for detailed spatial and quantitative analysis that surpasses traditional IF techniques.
Key Study Components
Area of Science
- Cellular senescence
- Immunofluorescence imaging
- Digital pathology
- Tissue microarray analysis
Background
- Traditional IF imaging is limited in the number of markers that can be assessed simultaneously.
- Senescence lacks a universal biomarker; signatures vary by cell type, trigger, and time since induction.
- Multiplexed IF allows for the detection of multiple markers in a single tissue section, improving cell type and structure profiling.
- Spatial relationships between cell types and tissue structures are critical for understanding senescence in situ.
Purpose of Study
- To provide a detailed protocol for multiplexed IF staining and imaging of human tissue samples.
- To enable unbiased detection and spatial analysis of senescent cells using combinatorial biomarker approaches.
- To demonstrate the utility of multiplexed imaging for comprehensive tissue profiling.
Methods Used
- Tissue microarrays from 34 human tissue types were utilized.
- 10-plex immunofluorescence staining targeting structural, immune, and senescence biomarkers.
- Sequential staining, imaging, and dye inactivation cycles to build multiplex datasets.
- Image acquisition with a multiplex fluorescence slide scanner.
- Protocols for both manual and automated slide preparation.
- Single-cell segmentation and spatial analysis using digital pathology software.
Main Results
- Successful multiplexed detection of multiple biomarkers within single tissue sections.
- Assessment of abundance and spatial distribution of senescent cells across diverse tissues.
- Generation of high-content multiplex datasets suitable for advanced spatial analysis.
- Protocols adaptable for both manual and automated workflows.
Conclusions
- Multiplexed IF provides a powerful, unbiased approach for senescent cell detection in situ.
- The described methods facilitate comprehensive spatial and quantitative analysis of tissue samples.
- This protocol serves as a general guide for multiplexed imaging in research and pathology applications.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Multiplexed immunofluorescence enables high-content spatial profiling of senescence markers across diverse human tissues, addressing the challenge of heterogeneous senescence signatures in drug discovery. This approach enhances predictive confidence in target validation and supports translational continuity by allowing simultaneous assessment of multiple biomarkers within a single tissue section. The method is positioned to improve decision-making at key inflection points in early discovery and preclinical research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive interrogation of senescence-associated pathways using combinatorial biomarker panels.
- Supports biological de-risking by revealing cell-type and context-specific senescence signatures.
- Facilitates predictive confidence in target selection through spatially resolved marker analysis.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tissue systems for downstream screening of senescence-modulating compounds.
- Standardizes multiplexed assay workflows for reproducible and quantitative biomarker detection.
- Enables scalable imaging and analysis suitable for high-throughput tissue microarray studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial biomarker data with disease-relevant tissue contexts for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by supporting unbiased senescent cell detection.
- De-risks advancement decisions by quantifying abundance and distribution of senescent cells in situ.
Pipeline & Workflow Integration
This multiplexed IF assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling spatially resolved, quantitative analysis of senescence markers in human tissue microarrays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through multi-marker spatial profiling.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in validated tissue contexts.
- Analytics: Provides high-content imaging datasets and digital pathology outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by aligning biomarker data with disease-relevant tissues.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for multiplexed imaging across diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in senescence research.
- Operational Value: Standardizes multiplexed imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust spatial biomarker analysis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of senescence-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiplexed immunofluorescence and digital pathology analysis.
- Needs access to multiplex slide scanners and compatible digital pathology software.
- Demands cross-team standardization of staining, imaging, and analysis protocols.
- Adaptable to both manual and automated slide preparation workflows.
- Dependent on tissue quality and marker panel optimization for reliable outputs.
