Isolierung von Perizyten aus Mauskortikalgewebe mittels FACS zur Einzelzellsequenzierung

Unsere Forschung untersucht Gehirnparasiten mit Fokus auf ihre Gefäßrollen und ihre Wechselwirkungen innerhalb der neurovaskulären Abteilung, um die Gehirnfunktion zu verstehen. Niedrige Bildabbildung und das räumliche FACS in einem Darmprozess, Kartierung oder Parasitenfunktion innerhalb der Gehirngefäße, die die standortspezifischen Rollen und therapeutischen Ziele offenbaren. Zu Beginn sprühen Sie den Bereich von Kopf und Hals einer eingeschläferten Maus mit 75 % Ethanol ein.

Mit einem Skalpell wird ein Schnitt auf der Kopfhaut in der Mitte vom Okzipitalbereich bis zum Frontalbereich gemacht, um den Schädel freizulegen. Führen Sie einen transversalen Schnitt vor den beidseitigen Augenhöhlen vor, gefolgt von lateralen Einschnitten entlang der unteren Ränder des Kleinhirns, um die Schädelbasis abzutrennen. Schneide das Kalvarium längs entlang der sagittalen Naht von hinten nach vorne ein.

Heben Sie die Schädellappe zusammen mit einem Duramat an, um das Gehirn freizulegen. Mit einer chirurgischen Schere wird das Gehirn vorsichtig angehoben, während die Sehnerven und die Verbindung zum Rückenmark der Medulla oblongata durchtrennt werden. Legen Sie das intakte Gehirn vorsichtig in eine 10 Zentimeter große Schale mit 10 Millilitern eiskaltem PBS, um Schäden zu vermeiden.

Übertragen Sie das Gehirn auf Alufolie. Legen Sie den Subarachnoidalraum frei. Nachdem Sie die Dura mit einer Pinzette entfernt haben, spülen Sie sie mit Hanks ausgewogener Salzlösung ab.

Das Gewebe wird auf Filterpapier übertragen und das Piamater durch Rollen entfernt. Mit einer Rasierklinge schneiden und entsorgen Sie den olfaktorischen Bulb sowie die meisten Schwanzabschnitte und schneiden Sie das Gehirn koronal in Scheiben von zwei bis drei Millimetern Dicke. Isolieren Sie den Großhirnrinde entlang des Corpus callosum.

Übertragen Sie das kortikale Gewebe in Ampullen mit drei Millilitern eiskaltem Gewebepuffer. Mit chirurgischen Skalpellen wird das Gewebe und die Ampullen in Fragmente von etwa einem mal einem Millimeter zerkleinert und das Hacken innerhalb von fünf Minuten abgeschlossen, um die Frische des Gewebes zu erhalten. Pipettenspitzen mit Gewebeabnahmepuffer vorabspülen.

Dann aspirieren Sie die gehackten Fragmente langsam zur Spitze der Spitze, während Sie die Pipette vertikal halten. Geben Sie die Fragmente vorsichtig in vorgekühlte 15-Milliliter-Zentrifugenröhren aus. Waschen Sie die ursprünglichen Ampullen mit 2 % FBS in PBS-Kochsalzlösung.

Die Waschanlage in dieselben Zentrifugenröhren übertragen und bei 300 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Entsorge das Überlagerungsmittel nach der Zentrifugation. Jedes Pellet in drei Millilitern CD-Enzym-Arbeitslösung erneut suspendieren.

Aliquot die Suspension gleichmäßig in drei Röhren aufteilen und zusätzliche Enzymlösung hinzufügen, um ein Endvolumen von fünf Millilitern pro Röhre zu erreichen. Inkubieren Sie die Röhren 100 Minuten lang in einem Hybridisationsofen bei 37 Grad Celsius mit Orbital-Schütteln bei 100G. Während der Inkubation geben Sie einen Milliliter DNASE-1-Lösung zu 10 Millilitern 2%FBS in PBS.

Beenden Sie die Verdauung durch Zentrifugation bei 300 G bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Anschließend wird jede Kugel in einen Milliliter Gewebedissoziationslösung wieder suspendiert. Pipettieren Sie die Lösung 100 Mal, um die mechanische Dissoziation zu unterstützen.

Als Nächstes werden alle Suspensionen in einem einzigen 50-Milliliter-Zentrifugenrohr zusammengefasst. Spüle jede Tube mit zwei Millilitern Puffer ab und vermische die Waschungen. Nach der Zentrifugation bei 300 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und dem Ablegen der obersten Schicht 12,5 Milliliter 20 % BSA hinzufügen und umkehren, um zu mischen.

Zentrifugiere bei 1000 g bei vier Grad Celsius für 20 Minuten. Sammeln Sie nun das untere Pellet ein und übertragen Sie das Supernatant in ein neues 50-Milliliter-Zentrifugenrohr. Vorsichtig wieder suspendieren, bevor du erneut zentrifugierst.

Jedes Pellet in zwei Millilitern à 2 % FBS in PBS wieder suspendieren. Dann kombinieren Sie beide Aufhängungen zu einem einzigen Rohr. Zentrifugiere die kombinierte Suspension bei 300 G bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.

Nach dem Entsorgen des Supernatants wird das letzte Pellet in zwei Millilitern PBS mit 2 % FBS wieder suspendiert. Bereiten Sie vier 15-Milliliter-Zentrifugenröhren vor, die vier Milliliter 22 % pro Anruflösung enthalten. Schichten Sie vorsichtig 0,5 Milliliter Aliquot der Zellsuspension auf jeden Gradienten und zentrifugieren Sie bei 560 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Nach dem Absugen des Überschussmittels wird jedes Pellet in einem Milliliter HBSS BSA-Glukosepuffer wieder suspendiert. Dann zieht man die Federungen in ein neues 15-Milliliter-Rohr. Spülen Sie die Percol-Röhren mit zwei Millilitern Puffer und kombinieren Sie die Waschspülungen vor der Zentrifugation bei 300 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Für die Durchflusszytometrie wird das Pellet nach dem Aspirieren des Supernadants in einen Milliliter HBSS BSA-Glukosepuffer wieder suspendiert. Fügen Sie fünf Mikroliter FC-Rezeptorblockierendes Reagenz hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Dann pipettende fluoreszierend konjugierte Antikörper gegen die Suspension vor der Inkubation.

Waschen Sie die Zellen mit sechs Millilitern HBSS BSA-Glukosepuffer. Dann zentrifugiere die Suspension bei 300 G bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Nach dem Ansaugen des Überstandsmittels wird das Pellet in einen Milliliter Puffer wieder aufgehängt.

Fügen Sie 200 Mikroliter sieben Amino-Actinomycin-D-Lösungen hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten auf Eis. Dann das Endvolumen auf zwei Milliliter mit HBSS-Puffer, ergänzt mit BSA und Glukose, einstellen. Spülen Sie die Innenseite der Sortierröhrchen mit einer 1%-BSA-Lösung ab.

Saugen Sie die überschüssige Lösung ab, sodass in jedem Röhrchen genau ein Milliliter Lösung bleibt. Lagern Sie die Röhren auf Eis, um sortierte Zellen aufzunehmen. Zellen, die vom Gehirngewebe dissoziiert wurden, wurden sequentiell durch den Vorwärtsstreubereich und den seitlichen Streubereich gelenkt, um Zellreste während der Durchflusszytometrie-Sortierung auszuschließen.

CD45-positive und CD41-positive doppelt positive Ereignisse wurden ausgeschlossen, um hämatopoietische Zellen und Thrombozytenkontaminanten zu entfernen. CD13-positive Gefäßwandzellen wurden angereichert. Und apoptotische Zellen wurden mit sieben Amino-Aktinomycin-D-Negativ-Gating-Verfahren ausgeschlossen, gefolgt von CD31-negativer Selektion zur Isolierung von Parasiten.

Die Sortierung der Durchflusszytometrie zeigte, dass nukleierte Zellen 59,8 % aller Ereignisse ausmachten. CD13-positive Zellen machten 1 % aller Ereignisse aus. Und die letzte CD13-positive CD31-negative Parasitenpopulation machte 0,7 % aller Ereignisse aus.

Die Dimensionsreduktion der UMAP der sortierten Zellen zeigte sechs unterschiedliche Hauptcluster, die auf zelluläre Heterogenität innerhalb der isolierten Population hinweisen. Die Z-Score-Normalisierungs-Heatmap-Analyse zeigte, dass Parasitenmarker-Gene in den Clustern von null bis drei stark und überwiegend exprimiert werden. Die Analyse des Clusteranteils zeigte, dass die Cluster von null bis drei 87,1 % der Gesamtbevölkerung ausmachten.

Während glatte Muskelzellmarker in Cluster vier mit 10,14 % angereichert waren und Fibroblastenmarker in Cluster fünf mit 2,77 % angereichert waren, ermöglicht dieses Protokoll Forschern, hochreine tragbare Parasiten zu isolieren, die für die nachgelagerte Einzelzellsequenzierung und funktionelle Analyse geeignet sind. Die größte Herausforderung ist das Fehlen hochspezifischer Parasitenmarker, die komplizierte Isolation und das steigende Risiko einer säkularen Kontamination. Künftige Studien können sich darauf konzentrieren, parasitenspezifische Marker zu identifizieren, was eine verbesserte Isolierung, eine tiefere funktionelle Charakterisierung und gezielte therapeutische Untersuchungen ermöglicht.