Eine neuartige Plattform für in vitro zelluläre Dehnung und Bildgebung

Unser Ziel war es, ein kostengünstiges, vom Hoberman inspiriertes mikroskopkompatibles Zelldehnungsgerät zu entwickeln, um zu untersuchen, wie mechanische Dehnung die zelluläre Funktion beeinflusst. Dieses Gerät ermöglicht es Forschern, die Reaktionen von Lebenszellen auf mechanische Reize zu untersuchen und physiologische Systeme wie ein schlagendes Herz oder atmende Lungen nachzuahmen. Um zu beginnen, wo es angemessen ist, persönliche Schutzausrüstung.

Mische Silgard 184 Basis und Aushärtungsmittel in einem Verhältnis von 10 zu eins in einer Kunststoffschale. Mit einem Zungenspatel die Komponenten kräftig zwei bis drei Minuten lang mischen. Dann stellst du die Schale für eine Stunde in eine Entgasungskammer.

Als Nächstes nehmen Sie die vorbereiteten 3D-gedruckten Formen und geben Sie 1,3 Gramm der PDMS-Mischung in die isotrope Form. Dann geben Sie 0,5 Gramm der PDMS-Mischung in die Uniaxialform. Verteile das Gel gleichmäßig über die Form und entfette die gefüllte Form eine Stunde lang.

Lassen Sie das Gel in der Form zwei Stunden lang auf einer flachen Oberfläche bei Zimmertemperatur absinken. Dann über Nacht im Ofen bei 60 Grad Celsius aushärten. Als Nächstes werden die Teile A und B des NuSil Gel 8100 gleichmäßig gemischt.

Mischen Sie das kombinierte Gel mit Silgard 184 Quervernetzer bei 0,36 % des Gesamtvolumens, um eine Substratsteifigkeit von 13 Kilopascal zu erreichen. Um ein weiches Substrat mit einer Steifigkeit von 0,3 Kilopascal zu erzeugen, überspringen Sie das Hinzufügen des Querverschlusses und mischen Sie die Lösung dann 15 Minuten im Rühren. Die NuSil-Mischung in eine Entgasungskammer geben und 30 Minuten entgasen.

Entferne jetzt vorsichtig das PDMS-Gel aus der maßgefertigten Form und lege es auf einen 40-Millimeter-Deckel, ohne ihn zu zerreißen. Anschließend lege das PDMS-Gel in den Spin-Coder. Pipettieren Sie 100 Mikroliter des NuSil-Gemisch auf den negativen Bereich des isotropen PDMS-Gels.

Dann pipettieren Sie 50 Mikroliter des NuSil-Gemisch auf die negative Fläche des uniaxialen PDMS-Gels. Nach diesem Code bei sieben G für 50 Sekunden. Um eine Dicke von 100 Mikrometern zu erreichen.

Lassen Sie das beschichtete Gel zwei Stunden lang auf einer ebenen, ebenen Oberfläche bei Raumtemperatur absinken. Das Gel in einen Ofen legen und über Nacht bei 60 Grad Celsius aushärten. Jetzt säen wir menschliche Atemwege, glatte Muskelzellen in elastischen Zellkulturbrunnen und inkubieren unter Standardbedingungen.

Anschließend werden die Zellen mit der FLIPR Calcium Six-Lösung für die Bildgebung gemischt. Zur Messung der Zugkraft werden die PDMS NuSil-Gelsubstrate mit einer Schicht fluoreszierender Perlen überzogen, um als fiduziale Marker zu dienen. Bereiten Sie eine 0,025%-Lösung aus einem Mikrometer Durchmesser roten fluoreszierenden Carboxylat-modifizierten Mikrosphären in HBSS vor.

Mit einem Vortex-Mixer-Vortex wird die Perlenlösung für 10 Sekunden verwendet. Dann pipettieren Sie 880 Mikroliter der Perlenlösung in das isotrope Gel. Gib 420 Mikroliter der Perllösung zum Uniaxial-Gel hinzu.

Nachdem das Gel eine Stunde lang bei Zimmertemperatur inkubiert wurde, entferne die Perlenlösung vorsichtig, um die Verteilung der Perle zu erhalten. Dann verwenden Sie ein Wattestäbchen oder ein Labortuch, um die Restlösung von der Geloberfläche vorsichtig abzutupfen. Als Nächstes verwenden Sie ein umgekehrtes Mikroskop, das mit Kamera, Lichtmotor und einem 10-fachen Trockenobjektiv ausgestattet ist.

Stellen Sie die Anregung auf 475 mal 40 Nanometer und die Emission auf 555 mal 50 Nanometer ein. Erfassen Sie 16-Bit-Bilder mit einer Bildrate von zwei Hertz während Dehnungsexperimenten. Legen Sie nun isotropes Gel auf den Stretcher und bilden Sie die fluoreszierenden Perlen mit einem umgekehrten Mikroskop mit einem 10-fachen Trockenobjektiv. Nehmen Sie Bilder im Vordehnungszustand auf.

Nehmen Sie während des Dehnprotokolls kontinuierlich Bilder im Zentrum des Substrats auf. Fokussieren Sie das Mikroskop bei Bedarf vor der Aufnahme der Bilder auf die gestreckte Position. Analysieren Sie die Bilder mit benutzerdefiniertem MATLAB-Code, der auf der Fuier-Traktionskraftmikroskopie basiert, um Verschiebungsvektoren und entsprechende planare Dehnungsfelder zu berechnen.

Stellen Sie die Daten als Durchschnitt der Endstudien dar. Die Anwendung einer Verschiebung von 240 Mikrometern führte dazu, dass sich fluoreszierende Perlen radial vom Zentrum nach außen verschoben. Die Zugkraftmikroskopie zeigte ein isotropes Verschiebungsfeld mit Vektoren, die vom Zentrum nach außen strahlten und mit der Entfernung zunehmen.

Das isotrope Verschiebungsfeld erzeugte ein homogenes ebenes Dehnungsfeld. Die Erhöhung der Verschiebung auf 1000 Mikrometer führte zu Verdrängungsvektoren, die an Größe zunahmen, während die radiale Ausrichtung beibehalten wurde. Das entsprechende Dehnungsfeld bei 1000 Mikrometern nahm an Magnitude zu, blieb aber radial symmetrisch.

In uniaxialen Gelen, die einer Verschiebung von 250 Mikrometern ausgesetzt sind, waren die Verschiebungsvektoren überwiegend entlang einer einzigen Achse ausgerichtet, was mit uniaxialer Dehnung übereinstimmt. Die Dehnungswellenformen spiegelten die programmierten Motorverschiebungen eng nach und blieben über drei wiederholte Zyklen synchronisiert. Die Dehnungswerte bei maximaler Verschiebung blieben über drei unabhängige Stichproben hinweg konstant.

Die Anwendung einer transienten Verschiebung bis zu 5.555 Mikrometern erzeugte Spannungen von mehr als 0,1 % bis 12 %. Eine transiente 0,5 %-Dehnung führte zu einem Anstieg des intrazellulären Kalziums, was sich in einer höheren Fluoreszenzintensität nach der Dehnung zeigte. Mit unserer Tragleiste können Forscher lebende Zell-Calciumbildgebung, Traktionskraftmikroskopie durchführen und zelluläre mechanische Reaktionen auf isotrope oder uniaxiale Dehnung quantifizieren. Ein entscheidender Schritt ist es, sicherzustellen, dass Gele auf einer ebenen Oberfläche aushärten, da eine ungleichmäßige Dicke das Substrat aus dem Fokus versetzen und die optische Klarheit während der Live-Bildgebung verringern kann.

Zukünftige Studien können dehnungsinduzierte Zytoskelett-Neuorientierung, pathologische Dehnungszustände, die für Asthma oder Lungenverletzungen relevant sind, sowie verschiedene Zelltypen untersuchen.