Dot-Blot-Assay zur Erkennung globaler N6-Methyladenosin-RNA-Modifikationsniveaus

Unser Protokoll ermöglicht die gleiche quantitative Bewertung globaler m6A-Spiegel mittels Dot-Blut. Dieses Protokoll kann auf routinemäßige Screenings und die vorläufige funktionale Überprüfung von m6A angewendet werden. Zu Beginn entferne Zellkulturschalen mit 143B-Zellen mit stabilen SNHG-21-Knockdown-Negativkontrollstellen und Zellen, die mit 3-Deazaadenosin und Meclofenamsäure behandelt wurden, aus dem auf 37 Grad Celsius eingestellten Inkubator.

Überprüfen Sie, dass die Zellkonfluenz unter dem Mikroskop etwa 80 bis 90 % beträgt. Spülen Sie die Zellen zweimal mit 1 ml PBS, nachdem Sie das Kulturmedium entfernt haben. Ersetze das PBS durch 1 ml Trypsin pro 6-cm-Schüssel.

Schütteln Sie das Gericht vorsichtig, um das Trypsin gleichmäßig zu verteilen, und lassen Sie es eine Minute bei Zimmertemperatur ausbrüten. Als Nächstes wird die Trypsinlösung durch 1 mi Medium mit 10 % FBS ersetzt, um die Verdauung zu beenden. Pipettieren Sie die Zellsuspension mehrmals, um die Zellen zu verteilen.

Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5 ml ribonukleasefreies Mikrozentrifugenrohr. Zentrifugiere das Rohr bei 1000 G für drei Minuten und pipette das Überstandsmittel heraus. Für die RNA-Extraktion geben Sie 600 Mikroliter Lysepuffer aus dem RNA-Reinigungskit dem Zellpellet zu.

Wirbeln Sie gründlich, um die Zellen zu lysieren und die Lösung fünf Minuten stehen zu lassen. Nach fünf Minuten gibt man ein gleiches Volumen 100%-Ethanol dem Lysat und dem Vortex gründlich hinzu. Jetzt pipettiert man 600 Mikroliter der Mischung auf eine Spinsäule, die mit einem Sammelrohr zusammengesetzt ist.

Zentrifugiere die Säule bei 12.000 G für eine Minute. Entsorge die Flüssigkeit aus dem Sammelrohr. Nach dem Zentrifugieren des restlichen Gemisch werden 500 Mikroliter Waschpuffer aus dem RNA-Reinigungskit in die Spin-Säule gegeben und eine Minute lang bei Raumtemperatur inkubiert.

Dann zentrifugiere die Säule bei 12.000 G für eine Minute. Entsorge die Flüssigkeit aus dem Sammelrohr und zentrifugiere die leere Säule erneut, um die Restflüssigkeit zu entfernen. Jetzt soll die Spin-Säule auf ein neues 1,5-Milliliter-Ribonuklease-freies Rohr übertragen werden.

Öffnen Sie den Deckel und lassen Sie ihn zwei Minuten an der Luft trocknen. Fügen Sie 25 bis 50 Mikroliter enzymfreies Wasser in die Mitte der Spin-Säule hinzu. Nach einer zweiminütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Säule bei 12.000 G für eine Minute zentrifugiert, um RNA zu elutieren.

Entwerfen Sie die Spin-Säule und legen Sie die elutierte RNA auf Eis. Anschließend wird die RNA-Konzentration von Kontroll- und Knockdown-Proben mit einem Spektrophotometer gemessen. Bereiten Sie ein Mikrogramm Gesamt-RNA aus jeder Zelllinie vor.

Anschließend wird RNA seriell auf 400 Nanogramm, 200 Nannanogramm und 100 Nanogramm mit diethylpyrocarbonatbehandeltem Wasser verdünnt. Erhitze die verdünnten RNA-Proben drei Minuten lang bei 95 Grad Celsius. Die Röhren werden sofort auf Eis umgepumpt, um abzukühlen.

Um das Dot-Blotting durchzuführen, zeichnen Sie zunächst Referenzlinien auf der positiv geladenen Nylonmembran. Beschrifte die Membran mit Probennamen. Nun wird jede RNA-Probe gründlich durch sanftes Wirbeln oder Pipettieren vermischt.

Anschließend werden 1 bis 2 Mikroliter jeder RNA-Probe auf bestimmte Stellen auf der Membran platziert. Bestrahlen Sie die Membran in einem ultravioletten Quervernetzer mit 254 Nanometern und 120 Millijoule pro Quadratzentimeter, um RNA-Vernetzung durchzuführen. Dann wird die Membran in eine Schale mit 10 ml tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 übertragen und fünf Minuten lang auf einer Schaukelplattform inkubiert.

Bereiten Sie anschließend vor der Verwendung eine frische 5%-Serum-Serum-Albumin-Blocklösung vor und befruchten Sie die Membran zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in der Blocklösung. Dann wird die Membran über Nacht mit einem Anti-m6A-Antikörper bei 4 Grad Celsius auf einer Schaukelplattform mit 50 Umdrehungen pro Minute inkubiert. Am nächsten Tag waschen Sie die Membran dreimal mit 10 ml Tris-Puffer-Kochsalzlösung und Tween 20 für jeweils 10 Minuten auf einer Schaukelplattform.

Anschließend wird die Membran eine Stunde lang bei Zimmertemperatur mit einem Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörper inkubiert. Nach dreimalem Waschen der Membran gleichmäßig chemilumineszierend Meerrettichperoxidase-Substrat tropfweise auf die Membran auftragen und eine Minute lang bei Zimmertemperatur mit sanftem Schaukeln inkubieren. Erkennen Sie das Signal mit einem chemilumineszenzbildenden Bildgebungssystem.

Führen Sie einen ersten Pre-Scan mit der Autobelichtungsfunktion durch. Für die Methylenblaufärbung wird die Membran eine Minute lang in einer Methylenblau-Färbungslösung inkubiert. Waschen Sie die Membran dreimal mit jeweils 10 ml Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 für jeweils fünf Minuten.

Bild als Ladekontrolle. Die Membran mit einer Lösung mit 1 % Natriumdodecylsulfat auf einer Schaukelplattform für 15 Minuten abfärben. Importiere als Nächstes das aufgenommene Bild in die Image J-Software und passe das Format an.

Subtrahieren Sie den Hintergrund, indem Sie Prozesse auswählen und Hintergrund subtrahieren. Stellen Sie den Radius auf 50,0 Pixel ein und aktivieren Sie den Lichthintergrund. Verwenden Sie das Rechteck-Werkzeug, um den Analysebereich auszuwählen.

Dann definieren Sie die Spuren nacheinander, indem Sie Analysieren, Gels auswählen und Erste Spur auswählen. Klicken Sie dann nacheinander auf Analysieren, Gels, Plot Lanes und messen Sie anschließend Peaks, um Intensitätsprofile zu erstellen. Messen Sie die Graustufenwerte von N6-Methyladenosin- und Methylenblau-Signalen.

Kopieren Sie die quantifizierten Daten in eine Tabelle zur Analyse. Vergleichen Sie Signalintensitäten, um globale N6-Methyladenosin-Modifikationsniveaus zu bewerten. Die Behandlung mit dem Methyltransferaseinhibitor 3-Deazaadenosin verringerte das globale N6-Methyladenosin-Signal in 143B-Zellen deutlich.

Der Knockdown von SNHG 21 führte zu einer vergleichbaren Reduktion der globalen Ausgangswerte von N6-Methyladenosin. Eine weitere Behandlung mit 3-Deazaadenosin verringerte das globale N6-Methyladenosin-Signal in SHSNHG-21-Zellen weiter. Die Behandlung mit dem Demethylaseinhibitor Meclofenaminsäure erhöhte die globalen N6-Methyladenosinspiegel in 143B-Zellen signifikant.

Trotz niedrigerer basaler N6-Methyladenosinwerte zeigten SHSNHG-21-Zellen nach der Behandlung mit Meclofenamsäure einen deutlichen Anstieg des N6-Methyladenosin. Die wichtigsten Herausforderungen sind die Membranauswahl, die präzise RNA-Verdünnung und die einheitliche Größe beider. Führen Sie Sequenzierungen für eine präzise zustandsspezifische Identifikation durch und wenden Sie das Massenspektrum-Merkmal an, um eine umfassende globale quantitative Analyse zu erreichen.

Zukünftige Studien können den m6A-Mechanismus bei der Entwicklung und dem Fortschreiten von Krankheiten untersuchen.