Standardisierte Methode zur Erkennung von Tunnel-Nanoröhren in menschlichen Hautzellen für Anwendungen in der Tissue Engineering

Wir entwickelten Methoden, um die tunnelnden Nanoröhren zwischen menschlichen Hautzellen zuverlässig zu erkennen und zu analysieren und deren potenzielle Rolle bei der Hautregeneration zu untersuchen. Unser Protokoll ist für fixierte Proben oder für primäre menschliche Hautzellen konzipiert. Es ist nützlich in der Forschung zur Hautbiologie und Geweberegeneration.

Zu Beginn tauen und kultivieren Sie menschliche Keratinozyten und dermale Fibroblasten in 60-Millimeter-Schalen mit dem entsprechenden Wachstumsmedium. Ergänzen Sie die Keratinozytenkulturen mit Y-27632 auf eine Endkonzentration von fünf Mikromolaren während der Wiederbelebung. Halten Sie alle Kulturen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator, bis sie etwa 80 % Konfluenz erreichen.

Dann entferne das Medium aus der Kulturschale. Spülen Sie die Zellen kurz mit einem Milliliter PBS, um den physiologischen pH-Wert und die Osmolarität während des Waschens aufrechtzuerhalten. Aspiriere das PBS vollständig.

Gib einen Milliliter 0,05 % Trypsin EDTA hinzu und verteile es gleichmäßig über die Zelloberfläche. Inkubieren Sie das Gericht bei 37 Grad Celsius 1,5 bis 2,5 Minuten. Lassen Sie die Zellen vorsichtig wieder aufhängen, indem Sie sie auf und ab pipetieren.

Gib zwei Milliliter Wachstumsmedium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Rohr und zentrifugieren Sie mit 200 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation entsorgt man das Überstandsmittel aus dem Zentrifugenrohr.

Lassen Sie das Zellpellet in ein bis zwei Milliliter Medium wieder suspendieren und zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zähler. Als Nächstes werden 12.000 dermale Fibroblasten oder 20.000 Keratinozyten in jedem Brunnen eines acht-Brunnen-Kammer-Objektträgers in einem Endvolumen von 400 Mikrolitern gesät. Nach dem Aussäen wird die Kammer gut geschüttelt, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, und die Zellen etwa 24 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubiert.

Nach der Inkubation sollte unter dem Mikroskop bestätigt werden, ob die Zellkonfluenz etwa 80 % beträgt. Wenn die Kulturen eine Konfluenz von 80 % erreichen, geben Sie vorsichtig mehrere Tropfen Fixationslösung, einen direkt in den Kammerbrunnen, um die Zellen vorzustellen. Inkubieren Sie die Zellen vier Minuten lang bei Raumtemperatur, damit das Fixativ gleichmäßig verteilt wird, ohne die Zellen zu stören.

Dann wird das Präfixativ aus dem Brunnen abgesaugt und 140 Mikroliter frische Fixierungslösung hinzugefügt, um eine vollständige Abdeckung der Bohrlochoberfläche sicherzustellen. Inkubieren Sie den Objektträger bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten. Anschließend wird das Fixativ aus dem Kammerschacht entfernt und 140 Mikroliter 100 millimolare Ammoniumchlorid hinzugefügt, um die Restaldehyde zu dämpfen.

Den Objektträger 10 bis 30 Minuten bei Zimmertemperatur ausbrüten. Spülen Sie die Proben dreimal mit PBS für jeweils 30 Sekunden bei Zimmertemperatur. Während jeder Spülung pipettieren Sie den Puffer vorsichtig entlang der Kammerwand, um Zellen nicht wegzuspülen oder Tunnel-Nanoröhren zu beschädigen.

Inkubieren Sie die Zellen mit 140 Mikrolitern einer 1:300 Volumen-zu-Volumen-Verdünnung von Weizenkeim-Agglutinin Alexa Mehlkonjugat in PBS. Führen Sie die Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur für 20 Minuten durch, um Plasmamembranglykoproteine zu markieren und die membranabgeleitete Tunnel-Nanoröhren zu visualisieren. Wasche die Zellen dann dreimal mit PBS für jeweils 30 Sekunden.

Dann inkubieren Sie die Zellen mit 140 Mikrolitern Phalloidinkonjugat, das ein bis 250 Mal in 1 % BSA für 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur verdünnt wird. Nach dreimalem Waschen der Zellen mit PBS inkubieren Sie sie mit 140 Mikrolitern DAPI-Lösung für fünf Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Zum Schluss geben Sie jedem Brunnen zwei bis drei Tropfen Montagemedium und bebrüuten Sie die Probe bei Raumtemperatur für 20 Minuten.

Bewahren Sie die Objektträger mindestens 20 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln auf, bis zur Bildaufnahme. In dermalen Fibroblastkulturen wurden tunnelnde Nanoröhren als lange, dünne Projektionen beobachtet, die benachbarte Zellen mit Membranen verbinden, die mit Weizenkeim-Agglutinin und F-Actin, markiert mit Phalloidin, gefärbt sind. In epidermalen Keratinozytenkulturen wurden auch tunnelierende Nanoröhren mit charakteristischen F-Actin-positiven Auswüchsen beobachtet, die benachbarte Zellen überbrückten.

In Kokulturen von dermalen Fibroblasten und epidermalen Keratinozyten wurden tunnelnde Nanoröhren zwischen dermalen Fibroblasten und epidermalen Keratinozyten konsistent nachgewiesen, sichtbar durch Membran- und Cytokeratin-5-Färbung. Die tunnelierenden Nanoröhren in den Kokulturen wiesen eine vielfältige zytoskelettale Organisation auf, wobei Beispiele nur F-Actin enthielten, sowohl die Filamente F-Actin mit partiellen Alpha-Tubulin als auch niedrige Alpha-Tubulin-Werte. Die größte Herausforderung besteht darin, den Tunnel in Nanoröhren zu erhalten.

Dies erfordert eine sanfte Fixierung, angemessenes Timing und die Verwendung frisch zubereiteter, fixierter Zusatzstoffe. Mit unserem Protokoll können die Tunnel-Nanoröhren unter unterschiedlichen Zellbedingungen gemessen werden, um ihre potenziellen Funktionen zu erforschen. In Zukunft werden wir Mitochondrien fluoreszierend markieren, um ihre Übertragung über tunnelierende Nanoröhren zu untersuchen.