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Die Autoren danken den Entwicklern und Betreuern der Pakete Seurat, Giotto und SPOTlight für deren Unterstützung und Dokumentation. Die Beiträge öffentlicher Datenarchivdienste und der Forschenden, die großzügig ihre Datensätze geteilt haben, werden ebenfalls dankbar anerkannt.

<ol>
	<li>Ozirmak Lermi N, Molina Ayala M, Hernandez S, et al. Comparison of imaging based single-cell resolution spatial transcriptomics profiling platforms using formalin-fixed paraffin-embedded tumor samples. Nat Commun. 2025;16(1):8499.</li>
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	<li>Xu Z, Wang W, Yang T, et al. STOmicsDB: A comprehensive database for spatial transcriptomics data sharing, analysis and visualization. Accessed October 31, 2025. https://dx.doi.org/10.1093/nar/gkad933</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Dieses Protokoll bietet einen umfassenden rechnergestützten Arbeitsablauf für die Analyse von Daten der räumlichen Transkriptomik, der analytische Tiefe mit praktischer Zugänglichkeit in Einklang bringt. Der schrittweise Ansatz führt Forschende durch die gesamte analytische Pipeline, von der anfänglichen Datenerfassung bis hin zu fortgeschrittenen räumlichen Analysen, und betont dabei kritische Entscheidungspunkte und mögliche Fallstricke.
Mehrere Schritte im Protokoll erfordern besondere Aufmerksamkeit, da sie erheblichen Einfluss auf nachfolgende Ergebnisse haben. Die Qualitätskontrolle und die Filtergrenzwerte sollten sorgfältig an spezifische Gewebetypen und Technologieplattformen angepasst werden, da übermäßig strenge Filterung biologisch relevante Stellen entfernen kann, während zu großzügige Grenzwerte technisches Rauschen einführen können. Die Wahl der Normalisierungsmethode beeinflusst signifikant die nachfolgenden Ergebnisse bezüglich Clustering und differentieller Expression. Beispielsweise verwendet die Pipeline SCTransform anstelle der Standard-Log-Normalisierung, da berichtet wurde, dass SCTransform technische Variationen im Zusammenhang mit Sequenziertiefe und anderen technischen Effekten in Einzelzell- und räumlichen Workflows modelliert und reduziert14,15. Während der Integration erfordert die Auswahl der Integrationsmerkmale und Auflösungsparameter eine sorgfältige Abwägung, um die Integrationsstärke mit der Erhaltung des biologischen Signals in Einklang zu bringen. Für den Nachweis räumlich variabler Gene wurde Moran's I aufgrund seiner rechnerischen Skalierbarkeit und Eignung für die Analyse räumlicher Autokorrelation in arraybasierten Daten gewählt, obwohl alternative Methoden wie SPARK je nach Datensatzgröße und Studienzielen in Betracht gezogen werden können16.
Die Fehlerbehebungskomponente dieses Workflows konzentriert sich auf häufige Interoperabilitätsprobleme, die auftreten, wenn Ausgabedaten von einem Paket an das nächste weitergegeben werden. Anstatt auf einen einzigen generischen Konvertierungsschritt zu setzen, verwendet der Workflow maßgeschneiderte Formatkonvertierungen an jeder Software-Schnittstelle: Räumliche Zähldaten werden in einen standardmäßigen RNA-Assay-Slot kopiert, bevor die Seurat-Integration erfolgt; Seurat- und Single-Cell-Referenzobjekte werden in SingleCellExperiment-Objekte für SPOTlight umgewandelt; räumliche Zählmatrizen werden für STdeconvolve neu formatiert; aus Seurat abgeleitete Zähldaten, Koordinaten und Zelltyp-Metadaten werden in ein Giotto-Objekt konvertiert, um die Analyse der Zell-Zell-Kommunikation durchzuführen; und ROI-Anmerkungen aus Select Spatial Spots werden als CSV-Dateien mit CELL_ID, X/Y-Koordinaten und Gruppenbezeichnungen exportiert, damit sie zurück zum Seurat-Objekt zugeordnet werden können. Diese Schritte helfen Nutzern dabei, häufige Probleme zu erkennen und zu beheben, wie inkompatible Assay-Slots, nicht übereinstimmende Spot-Identifikatoren, fehlende Metadaten-Spalten, falsche Koordinatenformate und Diskrepanzen bei Ligand-Rezeptor-Gen-Symbolen.
Ein weiteres Merkmal dieses Workflows ist die Nutzung zweier komplementärer Dekonvolutionsstrategien anstelle der alleinigen Verwendung eines einzelnen Algorithmus. SPOTlight nutzt vorherige scRNA-seq-Referenzen zur referenzgeleiteten Schätzung der Zelltyp-Anteile, während STdeconvolve die referenzfreie Identifizierung latenter transkriptioneller Themen ermöglicht. Im Demonstrationsdatensatz korrelierten die STdeconvolve-Themen mit histologisch definierten Regionen (Abbildung 5B), was die biologische Interpretierbarkeit stützt. Ein direkter quantitativer Vergleich zwischen beiden Methoden wurde in diesem Protokoll nicht durchgeführt; Nutzer, die diese an ihren eigenen Daten vergleichen möchten, können dem in Protokollschritt 7.3.2 bereitgestellten Rahmen folgen. Darüber hinaus unterstützt das Protokoll Benutzerfreundlichkeit und Nachvollziehbarkeit, indem es Skripte für zentrale Funktionen verwendet und gleichzeitig eine grafische Benutzeroberfläche („Select Spatial Spots“) für eine intuitive Abgrenzung von interessierenden Bereichen (ROI) bereitstellt.
Durch die Verknüpfung von Seurat und Giotto kann der Arbeitsablauf die auf Seurat basierende Vorverarbeitung und Integration mit den auf Giotto basierenden räumlichen Statistiken und Netzwerkanalysen kombinieren. Seurat bietet eine etablierte Umgebung für Forscher mit Erfahrung in scRNA-seq und unterstützt die Integration mehrerer Proben, während die Übertragung der harmonisierten Daten in Giotto die Erstellung räumlicher Netzwerke und die Analyse von Ligand-Rezeptor-Interaktionen ermöglicht. Dieses Konzept erlaubt es den Nutzern, die dokumentierten Stärken beider Plattformen zu nutzen, ohne dass diese hier gegen Squidpy oder andere Frameworks evaluiert wurden. Für die Zell-Zell-Kommunikation wurde die auf dem Delaunay-Netzwerk basierende Ligand-Rezeptor-Interpretation von Giotto verwendet, da sie räumliche Nachbarschaftsbeziehungen innerhalb derselben Analyseumgebung berücksichtigt; Frameworks wie CellChat bieten umfangreiche Signalisierungsdatenbanken, werden jedoch in diesem Protokoll nicht bewertet17.
Mehrere Einschränkungen müssen berücksichtigt werden. Der referenzbasierte Dekonvolution-Ansatz hängt entscheidend von der Verfügbarkeit hochwertiger, passender Einzelzell-Referenzen ab. Darüber hinaus basieren die grundlegenden Annahmen hinter der Analyse von Zell-Zell-Kommunikation auf der Transkript-Koexpression als Stellvertreter für physikalische Proteininteraktionen, was eine anschließende experimentelle Validierung erforderlich macht. Schließlich wurde dieser Workflow hauptsächlich für standardmäßige Visium-Datensätze entwickelt. Da sich das Forschungsfeld hin zu Technologien mit nahezu Einzelzell-Auflösung wie Visium HD entwickelt, werden sich auch die analytischen Überlegungen ändern; Daten mit höherer Auflösung könnten andere Vorverarbeitungsparameter erfordern und die absolute Notwendigkeit einer Spot-Dekonvolution verringern. Um diesen Workflow für Visium-HD-Datensätze anzupassen, können die hochauflösenden Bins rechnerisch zu größeren räumlichen Bins zusammengefasst werden oder die Spot-Dekonvolutionsmodule können zugunsten einer bildbasierten Zellsegmentierung umgangen werden18.
Diese Merkmale deuten auf eine mögliche Anwendbarkeit in verschiedenen biologischen Bereichen hin, einschließlich der Entwicklungsbiologie, Neurowissenschaften, Krebsforschung und Immunologie19,20,21,22. Das modulare Design ermöglicht es Forschenden, bestimmte Komponenten an ihre jeweiligen Anforderungen anzupassen, unabhängig davon, ob der Fokus auf der Identifizierung räumlicher Domänen, zellulärer Kommunikation oder regionaler Spezialisierung liegt. Da sich die räumlichen Technologien kontinuierlich weiterentwickeln und die Datensätze wachsen, bietet dieses Protokoll eine Grundlage, die erweitert werden kann, um neue analytische Methoden einzubeziehen und neu auftretende biologische Fragestellungen zu bearbeiten.

Die räumliche Transkriptomik (ST) ist eine bahnbrechende Technologiefamilie, die die genomweite Genexpression misst und dabei die räumlichen Koordinaten von Boten-RNA-(mRNA-)Molekülen in Gewebeschnitten erhält. Zu den ST-Methoden zählen sequenzbasierte Ansätze, die positionskodierte Arrays nutzen, sowie in situ-Abbildungsverfahren, die transkriptionelle Signale in intakten Gewebemikroumgebungen kartieren1,2. Durch die Erhaltung des räumlichen Kontexts ermöglicht die ST die Analyse der Gewebearchitektur, der Organisation zellulärer Nachbarschaften, der Zell-Zell-Kommunikation sowie mikroumgebungsbedingter biologischer Prozesse, die nach einer Gewebedissoziation nicht vollständig aufgeklärt werden können3.
Das schnelle Wachstum öffentlicher ST-Datenrepositorys hat beispiellose Möglichkeiten für sekundäre Analysen und die Entwicklung neuer Methoden eröffnet3. Ressourcen wie die CROST-Datenbank stellen Hunderte räumlich aufgelöster transkriptomischer Datensätze aus mehreren Arten und Technologieplattformen zusammen, während spezialisierte Sammlungen wie STOmicsDB sich auf bestimmte Methoden wie Stereo-seq konzentrieren4,5. Trotz des reichhaltigen Datenangebots bleibt die computergestützte Analyse aufgrund der Komplexität räumlicher Datenstrukturen, der Vielfalt analytischer Werkzeuge und der technischen Hürden bei der Implementierung reproduzierbarer Workflows eine Herausforderung6,7,8,9,10,11.
Um die Einschränkungen der Abhängigkeit von einer einzelnen Softwareumgebung zu überwinden, wird hier ein integrierter rechnergestützter Workflow vorgestellt, der komplementäre Analysewerkzeuge nutzt. Zu den bestehenden umfassenden ST-Analyse-Ökosystemen gehören hauptsächlich Seurat, Giotto und auf Python basierende Frameworks wie Squidpy6,7,12. Obwohl Python-basierte Tools wie Squidpy umfangreiche Funktionen für die Analyse räumlicher Graphen bieten, minimiert die Zusammenfassung der primären rechnergestützten Pipeline in einer einzigen Programmierumgebung technische Hürden zwischen verschiedenen Sprachen. Daher wird die Kern-Pipeline hauptsächlich in R implementiert, um solche sprachübergreifenden technischen Schwierigkeiten zu verringern. In diesem auf R basierenden Workflow wird Seurat für das Dateneinlesen, die Qualitätskontrolle, die Normalisierung, die Dimensionsreduktion, die Visualisierung und die Integration mehrerer Proben verwendet, was dessen verbreitete Anwendung in Einzelzell- und räumlichen Transkriptomik-Analysen widerspiegelt. Anschließend wird Giotto für den Aufbau räumlicher Netzwerke und die Analyse der zell-zu-Zelle-Kommunikation auf Basis von Ligand-Rezeptor-Interaktionen eingesetzt. Dadurch verbindet dieser Workflow die auf Seurat basierende Vorverarbeitung und Integration mit der auf Giotto basierenden räumlichen Analyse, wobei der Datenaustausch zwischen den beiden Werkzeugsets explizit und reproduzierbar bleibt.
Innerhalb dieses Rahmens werden zwei komplementäre Dekonvolutionsstrategien angewendet: SPOTlight, eine referenzgeführte Methode, die scRNA-seq-Daten verwendet, um die Anteile der Zelltypen zu schätzen, und STdeconvolve, eine unüberwachte Topic-Modellierungsmethode, die latente transkriptionelle Muster identifiziert8,11. Die Ergebnisse liefern komplementäre Einblicke in die räumliche zelluläre Heterogenität, werden jedoch nicht als quantitative Kreuzvalidierung betrachtet, es sei denn, der Nutzer führt die optionale in diesem Protokoll beschriebene Konkordanzanalyse durch. Eine benutzerdefinierte Python-Dash-Anwendung, Select Spatial Spots, ist zur interaktiven Annotation von Regionen von Interesse (ROI) integriert und erzeugt standardmäßige, koordinatenbasierte Annotationsdateien, die in nachfolgenden downstream-Analysen verwendet werden können.
Hinsichtlich der praktischen Anwendbarkeit richtet sich dieser Arbeitsablauf hauptsächlich an Standard-Array-basierte ST-Daten (z. B. Visium mit 55 µm Auflösung) und kann nach Bewertung der Parameter auf andere Gewebetypen übertragen werden. Vor der Analyse sind wichtige Einschränkungen zu berücksichtigen. Erstens hängt das referenzgeführte Deconvolution-Modul von einem hochwertigen, gewebematchenden scRNA-seq-Referenzdatensatz ab. Zweitens erfordern subzelluläre oder nahezu einzellbasierte Plattformen möglicherweise eine angepasste Vorverarbeitung, räumliche Bündelung der Bin oder bildbasierte Zellsegmentierung vor der Integration2. Der repräsentative Datensatz der Mauskolon dient als Demonstrationsbeispiel, um zu zeigen, wie der Arbeitsablauf räumliche Domänen und markerdefinierte Gewebestrukturierung bewerten kann, und nicht als Nachweis allgemeiner Plattformkompatibilität.

<table><tbody><tr><td>ggplot2</td><td>Posit Software, PBC</td><td>v4.0.0(CRAN)</td><td>Erweiterte Datenvisualisierung</td></tr><tr><td>Giotto</td><td>Dries Lab</td><td>v4.2.2 (GitHub)</td><td>Analysen räumlicher Netzwerke und zellulärer Kommunikation</td></tr><tr><td>patchwork&amp;nbsp;</td><td>Thomas Lin Pedersen</td><td>v1.3.2 (CRAN)</td><td>Erstellung und Anordnung von Diagrammen</td></tr><tr><td>R software&amp;nbsp;</td><td>R Foundation for Statistical Computing</td><td>v4.4.3</td><td>Kern-Ausführungsumgebung (macOS aarch64)</td></tr><tr><td>scater</td><td>Davis McCarthy et al.</td><td>v1.34.1 (Bioconductor)</td><td>Qualitätskontrolle und Visualisierung von Einzelzell-Daten</td></tr><tr><td>scran</td><td>Aaron Lun et al.</td><td>v1.34.0 (Bioconductor)</td><td>Modellierung der Einzelzell-Varianz und Markererkennung</td></tr><tr><td>Select Spatial Spots (Benutzerdefiniertes Python-Tool)</td><td>LeafLight</td><td>v1.0.0 (GitHub)</td><td>Interaktive Auswahl räumlicher Regionen von Interesse (ROI) (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots)</td></tr><tr><td>Seurat&amp;nbsp;</td><td>Satija Lab</td><td>v5.3.0 (CRAN)</td><td>Vorverarbeitung, Integration und Clustering räumlicher Daten</td></tr><tr><td>SeuratObject&amp;nbsp;</td><td>Satija Lab</td><td>v5.2.0 (CRAN)</td><td>Datenstrukturen für Einzelzell- und räumliche Daten</td></tr><tr><td>SingleCellExperiment</td><td>Bioconductor Core Team</td><td>v1.28.1 (Bioconductor)</td><td>Standardisierter Datencontainer für scRNA-seq</td></tr><tr><td>SPOTlight</td><td>Marc Elosua-Bayes et al.</td><td>v1.10.0 (Bioconductor)</td><td>Referenzgeführte räumliche Dekonvolution</td></tr><tr><td>Stdeconvolve</td><td>Jean Fan Lab</td><td>v1.3.2 (Bioconductor)</td><td>Unüberwachtes latentes Thema-Modellieren</td></tr><tr><td>tidyverse</td><td>Posit Software, PBC</td><td>v2.0.0 (CRAN)</td><td>Grundlegende Werkzeuge zur Datenmanipulation und -formatierung</td></tr></tbody></table>

ein praktischer workflow zur analyse von räumlichen transkriptomik-daten: von der datenerfassung bis zu fortgeschrittenen analysen

A Practical Workflow for Spatial Transcriptomics Data Analysis: From Data Acquisition to Advanced Analyses

Die räumliche Transkriptomik (ST) erfasst den genomweiten Genexpressionsstatus unter Erhaltung des zweidimensionalen räumlichen Kontexts von mRNA-Molekülen in Gewebeschnitten und ermöglicht somit Untersuchungen zur Gewebearchitektur und der biologischen Mikroumgebung. Die Analyse von ST-Daten bleibt jedoch herausfordernd, da der Dateneinlesen, die Qualitätskontrolle, Integration, Deconvolution, räumliche Statistik und Visualisierung oft mehrere Softwareumgebungen sowie reproduzierbare Parameterentscheidungen erfordern. Dieses Protokoll stellt einen praktischen rechnergestützten Arbeitsablauf für öffentliche ST-Datensätze in R vor, beginnend mit der Datenerfassung und Software-Installation und fortlaufend über das datenbasierte Laden mittels Seurat, Qualitätskontrolle, Normalisierung, Integration mehrerer Proben, Clusterung und Analyse räumlich variabler Gene. Anschließend werden ergänzende Deconvolution-Strategien angewandt, einschließlich der referenzgeführten SPOTlight-Analyse und des unüberwachten Topic-Modeling mittels STdeconvolve, gefolgt von der Analyse räumlicher Zell-Zell-Kommunikation basierend auf Giotto sowie der interaktiven Auswahl von Interessenbereichen (ROI) mithilfe einer benutzerdefinierten Python-Dash-Anwendung. Durch Betonung der skriptbasierten Ausführung, expliziter Begründungen der Parameter, erwarteter Ergebnisse und Fehlersuche-Punkte bietet das Protokoll einen anpassbaren Rahmen für Standard-Array-basierte ST-Datensätze und verwandte Plattformen nach Evaluierung datensatz- und plattformspezifischer Parameter.

Implementierung des Arbeitsablaufs und Datenintegration veranschaulichen wichtige Gewebemerkmale
Der rechnergestützte Arbeitsablauf wurde an räumlichen Transkriptomikdaten der Mauskolon angewandt, um die erwarteten Ergebnisse in den einzelnen analytischen Phasen zu veranschaulichen. Wie im schematischen Arbeitsablauf dargestellt (Abbildung 1) begann die Analysepipeline mit der Datenerfassung und Qualitätskontrolle, wobei räumliche Merkmalsdarstellungen die Gewebegrenzen abgrenzten (Abbildung 2A,B). Anschließend wurde der auf Anker basierende Integrationsablauf von Seurat verwendet, um technische Batch-Effekte zu reduzieren, gleichzeitig aber biologisch interpretierbare Variationen beizubehalten. UMAP-Darstellungen zeigten die Ausrichtung der Proben und räumliche Clustermuster nach der Integration (Abbildung 2C,D). Die quantitative, dynamische Auswahl der Hauptkomponenten (PCs) basierend auf der kumulativen Varianz wurde implementiert, um die Dimensionsreduktion und die nachfolgende Clusterung zu steuern (siehe ergänzende Abbildung 1). Die Analyse der Marker-Gen-Heatmap zeigte unterschiedliche transkriptionelle Profile, die den räumlichen Clustern zugrunde liegen (Abbildung 2E).
Um zu beurteilen, ob die rechnergestützten Cluster mit der bekannten anatomischen Architektur der Kolonhistologie übereinstimmten, wurden die Expressionsprofile kanonischer, schichtspezifischer Marker gene analysiert. Die Mukosa-Epithelschicht zeigte Expression von Epithelzellmarkern wie Epcam und Krt8 sowie des Becherzellmarkers Muc2. Mesenchymale und stromale Marker wie Col1a1 und Vim kennzeichneten die Lamina propria und submuköse Regionen, während die äußere Muscularis propria-Schicht durch strukturelle Gene der glatten Muskulatur wie Acta2 und Tagln angezeigt wurde. Die räumliche Beschränkung dieser linienassoziierten Marker stützt die Interpretation, dass der Integrations- und Clusterungsworkflow die wesentlichen histologischen Schichtungen des kolorektalen Gewebes entlang der Mukosa-zur-Muskularis-Achse erhalten hat (siehe Supplementary Figure 2).
Nach der Cluster-Validierung wurde eine nachgeschaltete differentielle Expressionsanalyse durchgeführt, um differentiell exprimierte Gene (DEGs) zwischen experimentellen Bedingungen zu identifizieren (Abbildung 2F,G). Darüber hinaus wurden räumlich variable Gene mithilfe der Moran's-I-Statistik identifiziert, wodurch Gene mit einer signifikanten, nicht zufälligen räumlichen Verteilung im Gewebe hervorgehoben wurden (Abbildung 2H).
Zelluläre Entmischung und räumliche Interaktionsnetzwerke offenbaren die mikroskopische Gewebestruktur
Die Verarbeitung der Single-Cell-RNA-seq-Referenzdaten ergab Annotationen, die durch QC-Filterung (Abbildung 3A), unüberwachtes Clustering (Abbildung 3B), Validierung mittels Marker-Genen (Abbildung 3C) und Übereinstimmung mit unabhängigen Annotationen (Abbildung 3D) gestützt wurden. Die zelluläre Zusammensetzung (Abbildung 3E) diente als Grundlage für die Strategie der Downsampling zur Deconvolution. SPOTlight schätzte die referenzgeleiteten Anteile der Zelltypen über die räumlichen Spots hinweg (Abbildung 4A,B), während STdeconvolve eine unüberwachte, auf Topic-Modelling basierende Darstellung räumlicher zellulärer Muster lieferte (Abbildung 5B). Das benutzerdefinierte Werkzeug „Select Spatial Spots“ bot histologischen Kontext für diese Muster (Abbildung 5A). Schließlich identifizierte die Analyse räumlicher Kommunikation mittels der deconvolutierten Zelltyp-Zuweisungen Ligand-Rezeptor-Interaktionen zwischen räumlich benachbarten Gruppen von Zelltypen (Abbildung 6A,B).
Problembehandlungshinweise aus der Protokolloptimierung
Während der Protokolloptimierung wurden mehrere Probleme identifiziert, die praktische Kontrollpunkte ergaben. Suboptimale Entfaltungsergebnisse traten auf, wenn Einzelzell-Referenzen nicht gut zum Gewebekontext passten, was die Notwendigkeit unterstreicht, wenn verfügbar, gewebe- und artenspezifische scRNA-seq-Daten zu verwenden. Erste Clustering-Versuche mit Standardparametern lösten nicht immer die erwarteten biologischen Strukturen auf; die Überprüfung der PC-Auswahl, der Clustering-Auflösung und der Kohärenz von Markergenen half dabei, räumlich interpretierbare Domänen zu identifizieren, die mit der Gewebemorphologie übereinstimmten. Diese Beobachtungen liefern praktische Beispiele dafür, wie Anwender häufige analytische Probleme während der Durchführung des Workflows diagnostizieren können.
<img alt="Diagramm des scRNA-seq-Datenanalyseworkflows. Prozesse: Normalisierung, Integration, Clusterung." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Abbildung 1"> 
Abbildung 1: Workflow für die integrierte räumliche Transkriptomik-Analyse. Schematische Darstellung der analytischen Pipeline, von der Datenerfassung und Vorverarbeitung bis hin zu fortgeschrittenen räumlichen Analysen. Zu den wichtigsten Schritten gehören: (1) Dateneinlesen, Qualitätskontrolle und Integration mehrerer Proben mithilfe von Seurat; (2) Räumliche Clusterung und Identifizierung räumlich variabler Gene; (3) Zelltyp-Entmischung via referenzbasierte (SPOTlight) und unüberwachte (STdeconvolve) Methoden; (4) Analyse der räumlichen Zell-Zell-Kommunikation mit Giotto und interaktive Auswahl von Interessenbereichen (Regionen) mithilfe eines benutzerdefinierten Tools, Select Spatial Spots. Die Ergebnisse aller Module werden zusammengeführt, um biologische Erkenntnisse über die Gewebearchitektur und das zelluläre Mikroumfeld zu gewinnen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Analyse der räumlichen Transkriptomik mit Violin-Plots, t-SNE-Clustering, Volcano-Plot und Heatmap-Daten." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Abbildung 2"> 
Abbildung 2: Datenintegration, Clustering und differentielle Expressionsanalyse. (A,B) Qualitätskontrollmetriken für die räumlichen Proben A1 und B1, die die Verteilungen der Genanzahlen, UMI-Anzahlen und Anteile an mitochondrialen Genen zeigen. (C) UMAP-Darstellung integrierter räumlicher Transkriptomikdaten, eingefärbt nach Probenursprung (links) und Clustering-Identität (rechts). (D) Räumliche Projektion der Cluster-Identitäten auf Gewebeschnitte. (E) Heatmap der wichtigsten Markergene für jeden räumlichen Cluster. (F) Volcano-Plot, der die differentiell exprimierten Gene zwischen den Bedingungen A1_colon_d0 und B1_colon_d14 anzeigt. (G) Räumliche Expressionsmuster repräsentativer differentiell exprimierter Gene über die Gewebeschnitte hinweg. (H) Räumliche Expressionskarten der wichtigsten räumlich variablen Gene, identifiziert via Moran's I-Statistik, wobei die beiden linken Felder Gene aus der Probe A1_colon_d0 und die beiden rechten Felder Gene aus der Probe B1_colon_d14 zeigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="scRNA-seq-Analyse: Violin-Plots, UMAP-Cluster, Zelltyp-Scores und Balkendiagramm-Verteilung." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
Abbildung 3: Verarbeitung und Annotation von Einzelzell-Referenzdaten. (A) Qualitätskontrollkennzahlen für scRNA-seq-Referenzdaten vor und nach Filterung. (B) UMAP-Visualisierung der scRNA-seq-Daten, gefärbt nach unüberwachten Clustern. (C) Punktdiagramm, das die Expressionswerte kanonischer Marker-Gene für Zelltypen über die Cluster hinweg zeigt. (D) Annotierte UMAP-Visualisierung der scRNA-seq-Daten mit Bezeichnung der Hauptzelltypen. (E) Zelluläre Zusammensetzung des scRNA-seq-Referenzdatensatzes. Die gestrichelte rote Linie zeigt den Downsampling-Schwellenwert (n = 50 Zellen pro Typ), der während der SPOTlight-Dekonvolution angewendet wurde, um Recheneffizienz und Repräsentanz der Zelltypen auszugleichen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Verteilung der Zelltypen, Mikroskopiebilder; Analyse von B-Zellen, endothelialen Zellen und Fibroblasten in Geweben." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 4"> 
Abbildung 4: Räumliche Dekonvolution der zellulären Heterogenität. (A,B) Räumliche Streudiagramme aus der SPOTlight-Dekonvolution, die die anteilsmäßige Zusammensetzung der wichtigsten Zelltypen an jeder Position für die Proben A1 (A) und B1 (B) zeigen. (C) Repräsentative räumliche Verteilung von B-Zellen in den Proben A1 (links) und B1 (rechts), die die räumlich aufgelösten Lokalisierungsmuster einer spezifischen Immunzellpopulation darstellt, die durch Dekonvolution identifiziert wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Analyse der räumlichen Genexpression, Diagramm mit Zelltypen und Pixelgruppen im Gewebeschnitt." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Abbildung 5"> 
Abbildung 5: Interaktive Analyse von Interessenbereichen und Vergleich der unsupervidierten Dekonvolution. (A) Benutzeroberfläche des benutzerdefinierten Werkzeugs „Select Spatial Spots“, das die interaktive Auswahl von Bereichen zeigt, die dem proximalen Kolon, distalen Kolon und anderen Gewebebereichen entsprechen. (B) Räumliche Scatterpie-Darstellung der Ergebnisse der unsupervidierten Dekonvolution (STdeconvolve) für Probe A1, wobei die Spots entsprechend den manuell annotierten Bereichen aus (A) eingefärbt sind, was die Übereinstimmung zwischen histologiebasierten Annotationen und rechnerisch abgeleiteten Verteilungen der Zellthemen veranschaulicht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Zell-Zell-Kommunikationsdiagramm mit Ligand-Rezeptor-Interaktionen und log2FC-Werten; Blasendiagramm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70188/70188fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Abbildung 6"> 
Abbildung 6: Räumlich informierte Zell-Zell-Kommunikationsnetzwerke. (A,B) Ligand-Rezeptor-Interaktionsnetzwerke, abgeleitet mittels Giotto für die Proben A1 (A) und B1 (B). Die Knoten repräsentieren Zelltypen, die Kanten signifikante Ligand-Rezeptor-Paare (FDR &lt; 0,05), und die Dicke der Kanten entspricht der Interaktionsstärke. Um Vergleichbarkeit und Klarheit der Visualisierung sicherzustellen, wurde für alle Proben eine einheitliche Signifikanzschwelle (FDR &lt; 0,05) angewandt, und jeweils die 20 stärksten Interaktionen, sortiert nach log2FC, für jede Bedingung dargestellt. Die Netzwerke verdeutlichen zelltypspezifische Kommunikationsmuster im räumlichen Kontext von Kolon-Gewebe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/70188fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
Abbildung S1: Quantitative Bewertung der Parameteroptimierung für die Dimensionsreduktion. Der Ellenbogenplot veranschaulicht den programmatischen Ansatz des Workflows zur dynamischen Auswahl der optimalen Anzahl an Hauptkomponenten (PCs). Die Auswahl wird basierend auf kumulativer Standardabweichung und Schwellenwerten für die marginale Varianz getroffen, die durch die rote vertikale Linie dargestellt sind, um biologische Varianz zu erfassen und gleichzeitig technisches Rauschen vor der nachgeschalteten Clusterung zu reduzieren.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/FigureS1.tif" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Abbildung S2: Validierung der räumlichen Clusterung mittels kanonischer, schichtspezifischer Marker des Colon. (A) Punktdiagramm, das die angereicherte Expression von epithelialen, stromalen und glattmuskulären Markern über die rechnerisch identifizierten Cluster zeigt. (B) Räumliche Darstellungen ausgewählter Marker (Epcam, Col1a1, Acta2) in Bezug auf die Gewebekoordinaten.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70188/FigureS2.tif" target="_blank">Klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Dieses Protokoll stellt einen reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Analyse von räumlichen Transkriptomik-Daten vor und führt die Nutzer von der öffentlichen Datenerfassung und der Seurat-basierten Qualitätskontrolle über Integration, Detektion räumlicher Merkmale, Dekonvolution von Zelltypen, Annotation von Regionen von Interesse bis hin zur Analyse der Zell-Zell-Kommunikation, mit praktischen Kontrollpunkten, die eine transparente Durchführung unterstützen.

Ein praktischer Workflow zur Analyse von räumlichen Transkriptomik-Daten: Von der Datenerfassung bis zu fortgeschrittenen Analysen

Die räumliche Transkriptomik (Spatial Transcriptomics, ST) profiliert die genomweite Genexpression unter Beibehaltung des zweidimensionalen räumlichen Kontextes von mRNA-Molekülen innerhalb eines Gewebes ...

Hallo zusammen. In diesem Video führen wir eine praktische Analyse-Pipeline für räumliche Transkriptomik-Daten von der Datenerfassung und dem Laden bis zur grundlegenden Erkundung und schließlich zur fortgeschrittenen Analyse durch. Insgesamt besteht der Workflow aus drei Hauptschritten.Zunächst müssen die Daten heruntergeladen, dann der Analysecode bezogen und schließlich die Analyse-Pipeline zur Erzeugung der Ergebnisse durchlaufen werden. Schritt eins: Datenerfassung und Vorbereitung der Verzeichnisstruktur. Beziehen Sie zunächst öffentliche räumliche transkriptomische Datensätze.Laden Sie das Archiv mit den Rohdaten herunter und entpacken Sie es. Ordnen Sie die Dateien in einer standardisierten Verzeichnisstruktur an.Erstellen Sie zunächst ein Hauptdatenverzeichnis und anschließend ein dediziertes Unterordner für jede Probe. Übertragen Sie die folgenden wesentlichen Dateien für jede Probe in das jeweilige Unterordner. Erstellen Sie danach einen räumlichen Unterordner innerhalb jedes Probenverzeichnisses.Platzieren Sie die folgenden Dateien im räumlichen Unterordner. Platzieren Sie die gefilterte Feature-PC-Metrik-S1-Datei im Hauptunterverzeichnis der Probe. Entpacken Sie die Gzip-Dateien im räumlichen Ordner.Stellen Sie sicher, dass die ursprünglichen Dateinamen exakt so bleiben, wie sie von der Funktion „load 10X spatial“ gefordert werden. Schritt zwei: Einrichtung der Softwareumgebung. Hier überspringen wir die Installation der R-Sprache und beginnen mit dem Abrufen des Analyseskripts aus dem GitHub-Repository.Installieren Sie die erforderlichen R-Pakete von Graham in der Datei conductor, indem Sie das Setup-Skript R ausführen. Installieren Sie das Auto-Suit, indem Sie die Installationsbefehle aus dem offiziellen Dokumentblatt ausführen. Navigieren Sie zur offiziellen Installations-URL, um die Setup-Skripte abzurufen. Initialisieren Sie die erforderliche Python-Umgebung und die Systemabhängigkeiten gemäß den Anweisungen auf der Setup-Seite.Beziehen Sie das benutzerdefinierte Tool, indem Sie zum GitHub-Repository navigieren und den Quellcode herunterladen. Navigieren Sie in das TOS-Verzeichnis und installieren Sie die Python-Abhängigkeiten. Schritt drei: Laden der räumlichen Daten und die Qualitätskontrolle.Laden Sie die räumlichen Daten in ein Seurat-Objekt ein. Verwenden Sie „read 10X image“, um das hochauflösende Gewebild manuell zu laden. Geben Sie dabei das Bild und den Bildnamen an.Verwenden Sie den Parameter „load 10X spatial“ mit dem Bild, das im vorherigen Schritt erstellt wurde, und erzeugen Sie das Seurat-Objekt. Berechnen Sie die Qualitätskontrollmetriken. Ermitteln Sie den Prozentsatz der mitochondrialen Reads mithilfe der Funktion „percentage feature set“ mit dem Muster mt.Visualisieren und interpretieren Sie die Daten basierend auf QC-Metriken. Erstellen Sie Violin-Plots von nCount_Spatial, nFeature_Spatial und percent.mt mithilfe der Violin-Plot-Funktion.Erstellen Sie räumliche Merkmalsdarstellungen dieser Metriken mithilfe räumlicher Merkmalsplots und identifizieren Sie Spots außerhalb des Gewebebereichs. Optional können Filter angewendet werden, um Spots von geringer Qualität zu entfernen.Nachdem Sie das Skript ausgeführt haben, können Sie diese Ergebnisse erhalten, einschließlich QC-Metriken und der räumlichen Darstellung der Merkmale. Schritt vier: Daten-Vorverarbeitung, Integration und Clusterung. Normalisieren Sie zur Vorverarbeitung einzelner Proben.Einzelne Anwendung der SC-Transform-Normalisierung auf jede Probe mit dem Assay Spatial. Integration mehrerer Proben. Vorbereitung der Liste der SCTransform-normalisierten Objekte für die Integration.Stellen Sie sicher, dass jedes Objekt einen RNA-Assay aufweist, indem Sie den räumlichen Assay kopieren. Verwenden Sie die Funktion zur Auswahl integrierter Merkmale in der PREP SCT-Integration, um gemeinsame variable Merkmale zu identifizieren. Finden Sie die Integrationsanker mithilfe von „Find Integration Anchors“ mit der Normalisierungsmethode SCT.Integrieren Sie die Daten mithilfe von IntegrateData. Führen Sie eine Dimensionsreduktion bei der Clusteranalyse auf dem integrierten Assay durch. Führen Sie PCA auf den integrierten Daten mit runPCA aus.Bestimmen Sie die optimale Anzahl der Hauptkomponenten für die nachgeschaltete Analyse, indem Sie die kumulative erklärte Varianz berechnen. Identifizieren Sie den Ellenbogenpunkt programmgesteuert. Führen Sie UMap mit der ermittelten Anzahl an Hauptkomponenten durch.Gruppieren Sie die Zellen mithilfe von FindNeighbors und FindClusters. Geben Sie die bestimmten PC in der Auflösung 0,5 an. Führen Sie eine differentielle Expressionsanalyse zwischen Zielgruppen mit der Funktion FindWorkers durch.Identifizieren Sie räumlich variable Gene. Führen Sie für jede ursprüngliche Probe die Funktion „räumlich variable Merkmale finden“ mithilfe der Moran's-I-Methode auf dem SCT-Assay aus, um die räumliche Autokorrektur zu berechnen. Nach Ausführung dieses Skripts erhalten Sie die Ellbogenplot, die UMap-Plot, die Clusterplot, die Heatmap der Clustermarker, die Vulkanplot, die räumlich differenziell exprimierten Gene, die räumlich zuverlässigen Gene sowie die Marker der Darmwandlagen.Und das Punktdiagramm der Kolonschichtmarker zusammen mit den Markern in der räumlichen Merkmalsdarstellung. Schritt fünf: Vorverarbeitung der Einzelzell-Referenzdaten. Lesen Sie die Einzelzell-RNA-seq-Zählmatrix mithilfe von read 10X ein und erstellen Sie ein Seurat-Objekt.Standard-QC-Normalisierung und Entbündelung durchführen. Den Prozentsatz der mitochondrialen Reads in den gefilterten Zellen berechnen. Die Daten mithilfe der SC-Transformation normalisieren.Legen Sie eine vara.to.-Regression für den Prozentsatz der mt-DNA fest. Führen Sie anschließend eine PCA und UMap-Darstellung durch und gruppieren Sie die Zellen mithilfe der dynamischen PC-Auswahlmethode, die in den vorherigen Schritten beschrieben wurde. Annotieren Sie danach die Zelltypen.Berechnen Sie Modul-Scores für kanonische Marker-Gene von Zelltypen mithilfe von AddModuleScore. Annotieren Sie die Cluster basierend auf den Modul-Scores und dem bekannten biologischen Hintergrund. Alternativ importieren Sie vorab berechnete Annotationen aus den Metadaten.Nachdem Sie dieses Skript gelernt haben, können Sie die QC-Metriken erhalten. Sie haben die UMap nach Cluster, die UMap nach Probe und die Zelltyp-Scores hochgeladen. Schritt sechs: Referenzgeleitete Dekonvolution mit SPOTlight.Bereiten Sie zunächst die Daten für SPOTlight vor. Konvertieren Sie das annotierte Einzelzell-Seurat-Objekt und das räumliche Seurat-Objekt in ein Einzelzell-Experiment-Objekt. Normalisieren Sie die Einzelzelldaten mittels LogMoreCounts logarithmisch.Führen Sie dann die SPOTlight-Dekonvolution durch. Identifizieren Sie zunächst hochvariabile Gene in den Einzelzell-Daten mithilfe von ModelGeneVar. Berechnen Sie Zelltyp-Marker mithilfe von Score-Markern und filtern Sie nach hochwertigen Markern.Reduzieren Sie den Einzelzell-Referenzdatensatz für jeden Zelltyp auf eine überschaubare Anzahl, um die Rechenzeit zu verkürzen. Führen Sie die Dekonvolution mithilfe der SPOTlight-Funktion durch, wobei Sie den Einzelzell-Referenzdatensatz, die räumlichen Daten, die Markerliste und die hochvariablen Gene (HVGs) angeben, und visualisieren und exportieren Sie anschließend die Ergebnisse. Das Ergebnis der Dekonvolution können Sie wie folgt erhalten, dargestellt als Scatter-Pipe-Routing.Schritt sieben, unbeaufsichtigte Dekonvolution mit Stdeconvolve. Bereiten Sie zunächst die räumlichen Daten vor. Extrahieren Sie die Zeilenzählmesswerte aus dem räumlichen Seurat-Objekt mithilfe von GetAssayData mit dem Slot counts.Entfernen Sie niedrigqualitative Stellen und Gene mithilfe bereinigter Zählungen aus STdeconvolve. Identifizieren Sie die latenten Zelltypen für die Filter, bei denen vier Gene in einem minimalen Anteil der Stellen exprimiert werden, unter Verwendung einer restriktiven strengen LDA, indem Sie dieses Zuweisungsmodell über einen Bereich möglicher Themenanzahlen mittels fitLDA anpassen. Wählen Sie das optimale Modell basierend auf minimaler Komplexität unter Verwendung des optimalen Modells mit opt min aus.Analysieren und visualisieren Sie die Ergebnisse. Extrahieren Sie den Serotyp-Anteil, Theta, und die Genprofile Beta für das optimale Modell mithilfe von getBetaTheta. Um die biologische Interpretation der Korrosionsthemen einzubeziehen, importieren Sie die durch das Werkzeug „select spatial spot“ erstellten Anmerkungen zu interessierenden Regionen.Verwenden Sie diese Anmerkungen als Parametergruppe in der Funktion „with all topics“. Weisen Sie die entfalteten Anteile der Zelltypen in Ihrem Projekt zurück auf die räumlichen Koordinaten zu und codieren Sie die Spotpositionen farblich entsprechend ihrer ROI. Nach Ausführung des Skripts erhalten Sie ein Ergebnis wie dieses, eine Skalierungspipettenbelastung, wie sie von SPOTlight erzeugt wird.Schritt acht, räumliche Zell-Zell-Kommunikation mithilfe von Giotto. Zunächst das Seurat-Objekt in ein Giotto-Objekt umwandeln. Verwenden Sie die Funktion createGiottoObject und geben Sie dabei die Metriken mit geringer Anzahl an Reads sowie die räumlichen Koordinaten an.Verarbeiten Sie das Giotto-Objekt vor und fügen Sie das Entmischungsergebnis hinzu. Normalisieren Sie die Daten mithilfe der normalisierten Giotto-Methode und fügen Sie sie als Serotyp-Anmerkungen hinzu. Wählen Sie die Zell-Metadaten mit addCellmetadata aus.Erstellen Sie ein räumliches Netzwerk mithilfe von createSpatialNetwork. Laden Sie eine Ligand-Rezeptor-Datenbank in unsere Umgebung. Führen Sie explore CellCellcom aus, um signifikante Ligand-Rezeptor-Interaktionen zwischen Zelltypen, die sich räumlich nahe befinden, zu identifizieren.Sie können das Punkt-Diagramm zur Zell-Zell-Kommunikation wie folgt erstellen. Schritt neun ist optional. Interaktive Spot-Auswahl mit SelectSpatialSpot.Bereiten Sie die Daten für das interaktive Tool mithilfe des Skripts six vor. Extrahieren Sie die räumlichen Koordinaten aus dem Seurat-Objekt mithilfe von GetTissueCoordinates. Formatieren und exportieren Sie die Daten.Exportieren Sie den formative data frame in eine CSV-Datei. Führen Sie anschließend die Region-of-Interest-Analyse durch. Starten Sie die benutzerdefinierte Anwendung.Wählen Sie die räumlichen Spots-Dash-Anwendungen aus und laden Sie die CSV-Datei. Wählen Sie interaktiv die Spots basierend auf dem räumlichen Standort aus. Exportieren Sie anschließend die Liste der ausgewählten Spots und ihrer zugeordneten Gruppe, gekennzeichnet als neue CSV-Datei.Wir überprüfen einfach, was wir erhalten, nachdem wir das Skript nacheinander ausgeführt haben. Alle Ergebnisse werden im Ergebnis-Ordner fünfmal gespeichert. Wie Sie sehen können, erhalten wir die QC-Metriken und führen die Aufteilung durch.Sie können hier die räumliche Merkmalsdarstellung überprüfen. Außerdem wurde der Dekonvolutionsprozess sowohl auf überwachte als auch auf unüberwachte Weise durchgeführt. Die SPOTlight-Ergebnisse finden sich hier.Wie Sie sehen können, enthalten alle Spots die Anteilsinformationen. Die unüberwachten Entmischungsergebnisse mittels STdeconvolve werden hier ebenfalls erstellt. Und dies ist das Seurat-Cluster-Ergebnis des Spots in den räumlichen Daten.Sie können sie auch in der räumlichen Team-Plot-Darstellung visualisieren, wie hier gezeigt. Darüber hinaus können Sie mithilfe von Giotto auch das Spot-Spot-Kommunikationsergebnis erhalten. Dieser gesamte Workflow ist zu 100 % Open Source.Spotting-Analyse von den Expressionsmetriken bis hin zu fortgeschrittenen räumlichen Modellen. Alle Schritte laufen auf einer Maschine mit 16 GB RAM. Die Codebasis ist modular, mit einem Skript für jede Aufgabe.Beachten Sie, dass dieser Workflow die upstream-Verarbeitung ab dem FASTQ-Preis nicht abdeckt. Der Fokus liegt auf den 2D-räumlichen Daten und umfasst derzeit nur die Downloader von Visium. Das ist alles, vielen Dank fürs Zuschauen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

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räumlich aufgelöste, integrierte einzelzellige multiomische Profilierung des Transkriptoms und epigenomischen Zielen in gefrorenen Gewebeschnitten

Tandem-Spleißereignisse treten an Stellen auf, die weniger als 12 Nukleotide voneinander entfernt sind. Die Quantifizierung der Verhältnisse solcher Spleißvarianten ist mit einem absolut quantitativen PCR-Ansatz möglich. Dieses Manuskript beschreibt, wie Spleißvarianten des Gens STAT3 quantifiziert werden können, bei denen zwei Spleißereignisse zu Serin-701-Einschluss/-Ausschluss und α/β C-Termini führen.

Merging Absolute und relative quantitative PCR-Daten zu Quantifizieren STAT3 Spleißvariante Transcripts

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The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University.  This protocol presents a reproducible workflow for analyzing spatial transcriptomics data, guiding users from public data acquisition and Seurat-based quality control through integration, spatial feature detection, cell-type deconvolution, region-of-interest annotation, and cell–cell communication analysis, with practical checkpoints that support transparent execution.

Ein praktischer Workflow zur Analyse von räumlichen Transkriptomik-Daten: Von der Datenerfassung bis zu fortgeschrittenen Analysen

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