Name: Perlenbasierter Multiplex-Flowzytometrie-Assay zur funktionellen Profilierung von CAR-T-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-10T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Erfahren Sie die perlenbasierte Multiplex-Flowzytometrie zur funktionellen Profilierung von CAR-T-Zellen. Diese Methode ermöglicht die quantitative Multiparameteranalyse aus begrenzten Proben für Forschung und Qualitätskontrolle.

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<ol><li>Biery, D. N., Turicek, D. P., Diorio, C., Schroeder, B. A., Shah, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Need+for+standardization+of+cytokine+profiling+in+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Need for standardization of cytokine profiling in CAR T cell therapy.</a> Mol Ther. 32 (9), 2979-2983 (2024).</li>
<li>Boulch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-talk+between+CAR+T+cell+subsets+and+the+tumor+microenvironment+is+essential+for+sustained+cytotoxic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">A cross-talk between CAR T cell subsets and the tumor microenvironment is essential for sustained cytotoxic activity.</a> Sci Immunol. 6 (57), eabd4344(2021).</li>
<li>Teachey, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+predictive+biomarkers+for+cytokine+release+syndrome+after+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Cancer Discov. 6 (6), 664-679 (2016).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines%3A+From+clinical+significance+to+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytokines: From clinical significance to quantification.</a> Adv Sci. 8 (15), 2004433(2021).</li>
<li>Leng, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+and+multiplex+technologies+for+cytokine+measurement+in+inflammation+and+aging+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (8), 879-884 (2008).</li>
<li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+in+the+multiplex+era%3A+Potentials+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls.</a> Proteomics Clin Appl. 9 (3–4), 406-422 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+targets%3A+a+versatile+cell%E2%80%91free+platform+to+characterize+CAR+T+cell+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Artificial targets: a versatile cell‑free platform to characterize CAR T cell function in vitro.</a> Front Immunol. 15, 1254162(2024).</li>
<li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+co%E2%80%91culture+model+with+CAR%E2%80%91T+cells%2C+antigen%E2%80%91presenting+cells%2C+and+tumor+cells+to+evaluate+CAR%E2%80%91T+cell%E2%80%91induced+cytokine+release+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An in vitro co‑culture model with CAR‑T cells, antigen‑presenting cells, and tumor cells to evaluate CAR‑T cell‑induced cytokine release syndrome.</a> Front Cell Infect Microbiol. 16, 1721114(2026).</li>
<li>Lock, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+scaled%2C+transposon-based+production+of+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Automated, scaled, transposon-based production of CAR T cells.</a> J Immunother Cancer. 10 (9), e005189(2022).</li>
<li>Bethke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+fully+human+FOLR1-targeting+CAR+T+cells+for+the+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of fully human FOLR1-targeting CAR T cells for the treatment of ovarian cancer.</a> Cells. 13 (22), 1880(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-125-800</td><td>Perlenbasierter Multiplex-Zytokin-Assay für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>MACSPlex InspectoR Tool</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>\</td><td>Webbasiertes Tool für automatisiertes Gating und Analyse von MACSPlex-Daten</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10 Durchflusszytometer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td>Durchflusszytometrieinstrument zur Messung von Multiplex-Daten</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 16 Durchflusszytometer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-109-803</td><td>Durchflusszytometrieinstrument zur Messung von Multiplex-Daten</td></tr><tr><td>MACSQuant Express Mode</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>\</td><td>Software für automatisiertes Gating und Analyse</td></tr><tr><td>TexMACS Medium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-196</td><td>Optimiertes serumfreies Zellkulturmedium, entwickelt für die Kultivierung und Expansion von humanen und murinen T-Zellen</td></tr></tbody></table>

perlenbasierter multiplex-flowzytometrie-assay zur funktionellen profilierung von car-t-zellen

Bead-Based Multiplex Flow Cytometry Assay for Functional Profiling of CAR T Cells

Perlenbasierter Multiplex-Flowzytometrie-Assay zur funktionellen Profilierung von CAR-T-Zellen

Profiling CAR T cells presents challenges due to their heterogeneity, complex immune responses, and limited sample availability. Multiplex assays enable ...

Unsere Forschung konzentriert sich auf die funktionelle Charakterisierung von CAR-T-Zellen und hat einen mit der Durchflusszytometrie kompatiblen Multiplex-Assay zur Profilierung der Sekretion von Effektormolekülen entwickelt. Dieses Verfahren kann in der CAR-T-Zell-Forschung zur funktionalen Charakterisierung, mechanistischen Untersuchungen, QC-Tests und Potenzbewertung angewendet werden.Bereiten Sie zunächst Zellkulturen aus gentechnisch veränderten humanen T-Zellen mit chimärem Antigenrezeptor (CAR-T-Zellen) zusammen mit Zielzellen, die entweder das passende Antigen exprimieren oder nicht, im Effektor-zu-Zielzell-Verhältnis von 2,5 zu 1 vor. Legen Sie einen oder mehrere Zeitpunkte für die Sammlung des Überstandes fest, um sezernierte Zytokine zu analysieren oder die Zytokinkinetik über einen definierten Zeitraum zu überwachen.Rekonstituieren Sie den Analytenstandard, indem Sie 200 Mikroliter Puffer oder Zellkulturmedium zum Pellet hinzufügen und vorsichtig mischen. Bereiten Sie sechs Reagenzienröhrchen vor und führen Sie eine Verdünnungsreihe des rekonstituierten Standards im Verhältnis 1:5 bis hinunter auf 3,2 Pikogramm pro Milliliter oder 0,6 Pikogramm pro Milliliter durch. Bereiten Sie eine Blindprobe vor. Zentrifugieren Sie die Ko-Kultur zu definierten Zeitpunkten nach der Ko-Kultur bei 300 ×g für fünf Minuten bei 21 °C. Verwenden Sie die Überstände direkt oder verdünnen Sie sie, um den Bereich der Standardkurve abzudecken.Benetzen Sie eine MACSPlex-Filterplatte vorab mit 200&nbsp;Mikrolitern MACSPlex-Puffer pro Bohrung und saugen Sie mithilfe eines Vakuummanifolds oder einer Zentrifuge ab, bis die Bohrungen entleert sind. Vortexen Sie die Capture-Beads-Mischung, um die Beads vollständig aufzuschwemmen. Geben Sie 50&nbsp;Mikroliter der Standardlösung oder Probe sowie 20&nbsp;Mikroliter vorgegebundener Beads in die Bohrungen einer 96-Loch-Filterplatte. Inkubieren Sie die Platte zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Schütteln mit 450&nbsp;U/min im Dunkeln. Waschen Sie die Bohrungen zweimal mit jeweils 200&nbsp;Mikrolitern Puffer unter Verwendung eines Vakuummanifolds. Fügen Sie 100&nbsp;Mikroliter der 1:50 vorgegebenen Detektionsreagenzien 1 zu den Bohrungen hinzu. Inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln mit 450&nbsp;U/min im Dunkeln. Waschen Sie die Bohrungen erneut zweimal. Geben Sie 100&nbsp;Mikroliter der 1:50 vorgegebenen Detektionsreagenzien 2 in die Bohrungen. Inkubieren Sie 30&nbsp;Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln mit 450&nbsp;U/min im Dunkeln. Waschen Sie die Bohrungen einmal und resuspendieren Sie die Proben in 200&nbsp;Mikrolitern Puffer.Verwenden Sie den 2D-Barcode auf dem Fläschchen mit den Capture-Beads, um die Erfassungseinstellungen in den MACSQuant-Durchflusszytometer zu laden. Nachdem Sie sich am Softwareprogramm angemeldet haben, wählen Sie die MACSPlex-Filterplatte als Probenhalter. Klicken Sie auf die Barcode-Schaltfläche in der Symbolleiste, um den 2D-Code-Leser zu aktivieren. Halten Sie das Fläschchen mit dem Barcode in einem Abstand von 0,5 bis 2,5 Zentimetern vor den Leser, wobei der Barcode zur blinkenden Lichtquelle zeigt. Weisen Sie im Reiter „Autolabel“ den Capture-Beads die Bezeichnung MPx human cytotoxic T, and natural killer cell zu und wählen Sie Nolabel. Definieren Sie die Positionen für die seriellen Verdünnungen des cytotoxic T und natural killer cell Standards. Im Reiter „Einstellungen“ wählen Sie Express-Modus. Stellen Sie den Typ auf Analyse und den Modus auf MACSPlex_Standard. Schalten Sie anschließend sanftes Mischen ein. Weisen Sie die unbekannten Proben entsprechend zu und definieren Sie deren Positionen. Optional können Sie die Proben gruppieren und Probenbezeichnungen sowie Beschreibungen eingeben. Wählen Sie im Reiter „Einstellungen“ erneut den Express-Modus. Stellen Sie den Typ auf Analyse und den Modus auf MACSPlex_Sample. Überprüfen Sie in der Experimenttabelle, ob die Halterdefinitionen korrekt sind. Stellen Sie sicher, dass sich ausreichend Flüssigkeit in den Vertiefungen der Filterplatte befindet, und starten Sie die Messung. Erfassen Sie die Daten mittels der phycoerythrin oder PE, fluorescein isothiocyanate oder FITC und allophycocyanin oder APC Kanäle auf einem Durchflusszytometer, das mit blauen und roten Lasern ausgestattet ist. Bestätigen Sie, dass die Express-Modus-Vorlagen für die automatisierte Gating- und Datenanalyse im MACSQuant-Durchflusszytometer verwendet werden. Alternativ laden Sie FSC- oder MQD-Datendateien auf das webbasierte InspectoR-Tool hoch, um automatisierte quantitative Zytokinmessungen durchzuführen und sofort nutzbare Ergebnisse zu erhalten. Überprüfen Sie die korrekte Trennung der 12 verschiedenen Capture-Bead-Populationen im FITC gegenüber PE-Kanal. Wenden Sie die Standardkurve an, um die Zytokinkonzentrationen zu berechnen. Exportieren und visualisieren Sie abschließend die Ergebnisse.Mithilfe der Multiplex-Bead-Kodierung wurden im biaxialen Plot deutlich getrennte Bead-Cluster, die einzelne Analyten repräsentieren, klar aufgelöst. Nach der Ko-Kultur mit Tumorzellen als Zielzellen sekretierten die CAR-T-Zellen hohe Konzentrationen von Granzym B, Interferon Gamma oder INF-Gamma, Tumornekrosefaktor Alpha oder TNF-Alpha sowie granulozytär-makrophagalem koloniestimulierendem Faktor oder GM-CSF, was auf eine starke Aktivierung und zytotoxische Effektorfunktion hinweist. Die Konzentrationen von Interleukin-2 oder IL-2 lagen über der oberen Nachweisgrenze, was mit einer starken proliferativen Signalgebung übereinstimmt. Zytokine, die mit regulatorischen oder alternativen Helfer-T-Zell-Antworten assoziiert sind, einschließlich IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21 und monozellulärem Chemoattraktionsprotein 1 oder MCP-1, waren in geringen oder nahezu nicht nachweisbaren Konzentrationen vorhanden. Die CAR-T-Zellen zeigten eine schnelle und starke Freisetzung von Zytokinen nach Erkennung antigenpositiver Zielstrukturen mit starker Hochregulation von Granzym B, IFN-Gamma, TNF-Alpha, GM-CSF und IL-2 innerhalb von 8 bis 24 Stunden und erreichten maximale Werte nach 48 Stunden. Mäßige Anstiege von IL-6, IL-17A, IL-21 und Perforin wurden ebenfalls beobachtet. IL-4, IL-10 und MCP-1 blieben niedrig oder leicht erhöht. Ko-Kulturen mit antigen-negativen Zielstrukturen zeigten eine minimale Induktion von Zytokinen über alle Analyten hinweg.Dieses Protokoll ermöglicht die Quantifizierung von Zytokinen, Chemokinen und zytotoxischen Mediatoren, die die Aktivierung und Effektorfunktion von CAR-T-Zellen widerspiegeln. Die wichtigsten Aspekte bei diesem Protokoll sind die Dauer der Ko-Kultur, das Effektor-zu-Target-Verhältnis, die Probenverdünnung und die Aufrechterhaltung quantifizierbarer Analytkonzentrationen. Nach Durchführung dieses Verfahrens kann die Profilierung des Überstandes mit Durchflusszytometrie, der Phänotypisierung von CAR-T-Zellen oder Zytotoxizitätsassays kombiniert werden.

bead-based-multiplex-flow-cytometry-assay-for-functional-profiling

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Die IP-FCM-Methode vorgestellt, die eine sensible, robust, biochemische Beurteilung der nativen Protein-Protein-Interaktionen ermöglicht, ohne dass Gentechnik oder große Stichproben.

IP-FCM: Immunpräzipitation mittels Durchflusszytometrie Detected

Dieses Video zeigt einen Multiplex-Bead-basierten Immunoassay zur Quantifizierung mehrerer Zytokinziele in einer Probe. Eine Mischung aus unterschiedlichen Mikrosphären, die an zytokinspezifische Antikörper konjugiert sind, wird verwendet, um die in der Probe vorhandenen Zytokine zu binden. Streptavidin-markierte Reporter werden mit biotinylierten Nachweisantikörpern an den gebundenen Zytokinen immobilisiert. Die Durchflusszytometrie identifiziert die gebundenen Zytokine anhand der...

Ein Multiplex-Bead-basierter Immunoassay zur Quantifizierung mehrerer Zytokinziele

Dieses Protokoll beschreibt einen sensitiven, zellbasierten Zytotoxizitätstest. Durch die Aufzählung der Abnahme der Häufigkeit von lebenden CD4+ T-Zielzellen in Gegenwart einer zunehmenden Anzahl von Effektor-CD8+ T-Zellen ermöglicht dieser Assay die direkte Beurteilung der zytolytischen Aktivität von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen.

Zellbasierter Durchflusszytometrie-Assay zur Messung der zytotoxischen Aktivität

Analyse der Tränenfilm hilft Zytokine in verschiedene augenfällige Krankheiten zu studieren. Wulst basierte Multiplex-Assays sind einfach und empfindlich und ermöglichen das Testen von mehreren Zielen in Proben mit kleinen Volumina. Hier beschreiben wir ein Protokoll für Tear Film Zytokin Profilierung eines mit Wulst basierte Multiplex-Assays.

Wulst basierte Multiplex-Assays für die Analyse der Träne Cytokine Profile

Dieses Protokoll beschreibt die Quantifizierung der mehrere Zytokin Ziele gleichzeitig in Gewebekultur Überstände von stimulierten Maus Splenocyten Multiplex-Perle-basierte Immunoassay-Plattform mit einem Durchflusszytometer gesammelt.

Multiplex-Zytokin Profilierung der stimulierten Maus Splenocyten mit Hilfe einer durchflusszytometrischen Bead-basierte Immunoassay-Plattform

Die Isolierung von Zellen aus präparierten Implantaten und deren Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie kann wesentlich zum Verständnis des Musters der Immunantwort gegen Implantate beitragen. In dieser Arbeit wird eine präzise Methode zur Isolierung von Zellen aus präparierten Implantaten und deren Färbung für die durchflusszytometrische Analyse beschrieben.

Hochdimensionale Durchflusszytometrie zur Immunfunktionsanalyse von präpariertem Implantatgewebe

Dieser Bericht beschreibt ein automatisiertes Protokoll für Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays (mIF) auf einem automatisierten Objektträgerfärbegerät. Es demonstriert die hohe Reproduzierbarkeit der räumlichen Proteomik auf Standard-Hochdurchsatz-Gewebe-Autostainern und Ganzobjektträger-Fluoreszenz-Imagern, was ideal für kundenspezifische mIF-Assays über eine große Anzahl von Gewebeobjektträgern in der translationalen Forschung ist.

Automatisierte Hochdurchsatz-Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays für die translationale Forschung

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung von Doppelemulsionströpfchen, die eine T-Zelle und eine Krebszielzelle verkapseln, um die Zellabtötung auf Einzelzellebene zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die duale Quantifizierung sowohl zytotoxischer Moleküle als auch der Apoptose der Zielzellen innerhalb einer großen Population von T-Zellen.

Tröpfchenbasierter Zytotoxizitätsassay zur Beurteilung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen auf Einzelzellebene

Tregs sind potente Suppressoren des Immunsystems. Es besteht ein Mangel an einzigartigen Oberflächenmarker um sie zu definieren, damit sind die Definitionen der Tregs in erster Linie funktional. Hier beschreiben wir eine...

Mensch In Vitro Suppression als Screening-Tool für die Anerkennung von Early State of Immune Imbalance

Durchflusszytometrie kann genutzt werden, um den Zustand des Chromatins innerhalb der T-Zellen zu beurteilen. Dieses Protokoll ermöglicht es Wissenschaftlern, Nachweis Chromatindekondensation während der T-Zellaktivierung durch einen Anstieg in der mittleren Fluoreszenz-Intensität (MFI) von fluoreszierenden Histone H3 Antikörper nachgewiesen interpretieren...

Die Verwendung von Durchflusszytometrie, um den Zustand von Chromatin in T-Zellen bewerten

Erfahren Sie die perlenbasierte Multiplex-Flowzytometrie zur funktionellen Profilierung von CAR-T-Zellen. Diese Methode ermöglicht die quantitative Multiparameteranalyse aus begrenzten Proben für Forschung und Qualitätskontrolle.

Perlenbasierter Multiplex-Flowzytometrie-Assay zur funktionellen Profilierung von CAR-T-Zellen

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