Etablierung von zonenangereicherten Primärkulturen aus dem Nebennierenkortex der Maus

Meine Forschung untersuchte die Regulation der Nebennierenmikroumgebung mit Schwerpunkt auf der Signalübertragung von ACM und Wnt in der Differenzierung von Zona glomerulosa und zona fasciculata sowie der Tumorentwicklung. Bestehende Methoden können die Nebennierenzonen nicht klar unterscheiden. Dieses Protokoll bereichert ZG und ZF und ermöglicht die Untersuchung verschiedener Zelltypen.

Dieses Protokoll kann zur Untersuchung der Adrenophysiologie bei ZG und ZF angewendet werden, einschließlich Zonation und Zelldifferenzierung. Um die Nebenniere für eine zonenangereicherte Primärkultur zu isolieren, werden 10 bis 15 junge erwachsene männliche Mäuse verwendet, etwa sechs bis sieben Wochen alt. Nach dem Einschläfern der Maus werden sie in eine dorsale Dekubitus-Position auf eine sterile flache Oberfläche gelegt und das Tierfell mit 70 % Alkohol desinfiziert.

Machen Sie mit einer Schere einen ersten Schnitt im Leistenbereich des Bauches. Den Schnitt seitlich zum Thorax auf beiden Seiten verlängern, um das Peritoneum freizulegen. Ziehe die Haut vorsichtig zurück.

Dann zieht man die Bauchmuskeln vorsichtig zurück, um die Höhle freizulegen, wodurch Blutgefäßschäden vermieden werden, um eine klare Sicht auf die Nebennieren zu erhalten. Wechseln Sie chirurgische Instrumente, um eine mikrobielle Kontamination zu minimieren. Identifizieren Sie die linke Nebenniere, die sich medial und oberhalb der linken Niere im Retroperitoneum befindet, mit ovaler Form und rosa Färbung, umgeben von weißem Fettgewebe.

Mit stumpfer Pinzette werden die benachbarten Organe vorsichtig verdrängt, um die sichtbare Nebenniere zu verbessern. Mit einer Schere wird der Großteil des umliegenden Fettgewebes mit kurzen, kontrollierten Schnitten entfernt, um die Nebenniere zu isolieren. Vermeiden Sie es, die Nebenniere direkt zu greifen, um Schäden an der Kapsel zu vermeiden.

Geben Sie die isolierte Nebenniere sofort in eine P60-Kulturschale mit 10 Millilitern vorgewärmtem DMEM F-12-Medium, bis alle Proben gesammelt sind. Identifizieren Sie anschließend die rechte Nebenniere, die sich lateral und oberhalb der rechten Niere im Retroperitoneum befindet, wobei Sie darauf achten, dass deren Nähe zur Leber, zum aufsteigenden Dickdarm und zu den nahegelegenen Blutgefäßen die Visualisierung erschweren kann. Behandeln Sie die Nierenvenen und Nierenarterien vorsichtig, um versehentliche Schnitte und Blutungen zu vermeiden.

Nachdem Sie die rechte Nebenniere isoliert haben, werden beide Drüsen nach demselben Verfahren wie die linke Nebenniere gemeinsam in derselben Schale gelegt. Wischen Sie die Kulturschale mit 70 % Alkohol sauber, bevor Sie die Drüsen in die laminare Flusshaube legen. Waschen Sie dann die Nebennieren dreimal, indem Sie sie nacheinander durch Schalen mit PBS bei 25 Grad Celsius übertragen.

Nach dem letzten Waschen sammeln und bewahren Sie die getrennten Gewebe in einer vierten Schale mit vorgewärmtem DMEM, um die Lebensfähigkeit während der Vorbereitung mehrerer Drüsen zu erhalten. Übertragen Sie die Nebennieren auf ein Filterpapier zur Dissektion. Als Nächstes greifen Sie mit feiner Pinzette die Nebenniere am anhaftenden Fettgewebe.

Sezieren Sie das Fett auf dem Filterpapier sorgfältig mit kontrollierten Bewegungen, um die Kapsel nicht zu beschädigen. Stellen Sie sicher, dass die Drüse glatt und unversehrt ist und frei von überschüssigem Fett und Bindegewebe. Übertragen Sie die Nebennieren vorsichtig auf frisches Filterpapier, um eine präzise Mikrodissektion zu ermöglichen.

Mit einer feinen Pinzette kneifen Sie vorsichtig die Kapsel der Nebenniere. Machen Sie mit einer Skalpellklinge einen radialen Schnitt in der Drüse, ohne das Gewebe vollständig zu durchschneiden. Üben Sie leichten mechanischen Druck aus, um den inneren Inhalt der Kortex durch den Schnitt nach außen zu stoßen.

Legen Sie das innere Drüsenmaterial frei, während die Kapsel und die Zona glomerulosa mit der Spitze der Pinzette verbunden bleiben. Identifizieren Sie das ausgestoßene innere Drüsenmaterial als Zona fasciculata und Medulla. Beginnen Sie die enzymatische Verdauung erst, nachdem alle Drüsen verarbeitet wurden, um eine ordnungsgemäße mechanische Trennung der äußeren und inneren Zone sicherzustellen.

Nach der Zentrifugation werden die gesammelten Zellen in einem Kulturmedium wieder suspendiert. Nach der Etablierung der Nebennierenkultur wird eine molekulare Charakterisierung kultivierter Zellen mittels Genexpressionsanalyse und Immunfärbung durchgeführt. Primäre Nebennierenkulturen wurden erfolgreich aus der äußeren Fraktion, die für Zonaglomerulosezellen angereichert wurde, und der inneren Fraktion, die für Zona fasciculata-Zellen angereichert wurde, hergestellt.

Das Lineage-Tracing-Mausmodell ermöglichte die Visualisierung der zona-glomerulosa-spezifischen mGFP-Expression, gesteuert vom Cyp11b2-Promotor. die mGFP-Expression wurde überwiegend in zonaglomerulosa-angereicherten Kulturen beobachtet, während zona-fasciculata-angereicherte Kulturen hauptsächlich mTomato exprimierten. Höhere relative Expressionsniveaus von Cyp11b2, Dab2 und Sonic Hedgehog wurden in äußeren Fraktionskulturen beobachtet im Vergleich zu inneren Fraktionskulturen.

Innere Fraktionskulturen zeigten eine höhere relative Expression von Cyp11b1 und Akr1b7 im Vergleich zu äußeren Fraktionskulturen. Die Aldosteronsekretion war in zonaglomerulosa-angereicherten Kulturen höher als in zona-fasciculata-angereicherten Kulturen. In äußeren Fraktionskulturen stieg die Aldosteronsekretion weiter an, wenn sie mit Angiotensin II, Kalium und Adrenokortikotropem Hormon stimuliert wurde.

Die Sekretion von Kortikosteron war in mit Zona Fasciculata angereicherten Kulturen höher als in Zona Glomerulosa-angereicherten Kulturen. Zona-Fasciculata-angereicherte Kulturen zeigten eine erhöhte Corticosteronsekretion als Reaktion auf Adrenokortikotrope Hormon- und Forskolinstimulation. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung zonenspezifischer Physiologie und Differenzierung, einschließlich Hormonproduktion, Signalweg und extrazellulärer Matrix.

Zukünftige Studien können die Nebennierenzonation und Differenzierungsmechanismen erforschen und diese Zellen nutzen, um ein 3D-Modell zu erstellen und ECM-Interaktionen zu untersuchen.