Single Cell Elektroporation in vivo innerhalb der intakten sich entwickelnde Gehirn

Die Einzelzell-Elektroporation ist eine spezialisierte Technik, die die Verabreichung von DNA oder anderen Makromolekülen in einzelne Zellen mit intaktem Gewebe ermöglicht, einschließlich In-vivo-Präparaten, wenn sie mit fortschrittlichen In-vivo-Bildgebungsverfahren kombiniert werden. Die Einzelzell-Elektroporation von fluoreszierenden Markern ermöglicht die direkte Visualisierung der zellulären Morphologie, des Zellwachstums und der interzellulären Ereignisse über Zeitskalen von Sekunden bis Tagen. In diesem Video beschreiben wir das Verfahren zur Einzelzell-Elektroporation eines Fluoreszenzfarbstoffs oder einer Plasma-DNA in Neuronen im intakten Gehirn der XUS-Kaulquappe und zeigen Beispiele für die Live-Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Neuronen.

Oh, hallo. Mein Name ist Eth Haa und ich arbeite im Labor von Dr.Kurt Haass am Brain Research Center der University of British Columbia. Heute werde ich zeigen, wie man eine gezielte Einzelzell-Elektroporation von Neuronen im intakten Gehirn der Albino-XUS-Lavis-Kaulquappe durchführen kann.

Der entscheidende Vorteil dieser Technik besteht darin, dass experimentelle Manipulationen an einzelnen Zellen durchgeführt werden können, während das umgebende Gewebe unverändert bleibt, wodurch zellautonome Effekte von denen unterschieden werden, die sich aus globalen Behandlungen ergeben. Der erste Schritt besteht in der Herstellung von Mikropipetten mit entsprechendem Spitzendurchmesser und Kegelwinkel, gefolgt von der Beladung der Mikropipette mit Transfermaterial. Dann müssen TA-Pools anästhesiert und in die Ationskammer übertragen werden, gefolgt von der Einführung der Mikropipette in das Gehirn und dem Anlegen einer Reihe von Spannungsimpulsen.

Schließlich werden atierte Neuronen mit Hilfe der Zwei-Photonen-Mikroskopie abgebildet. Sie werden Ihnen diese Technik an Kaulquappen zeigen. Die Einzelzellierung kann sowohl in anderen Modellsystemen als auch in ex vivo-Präparaten verwendet werden.

diesem Sinne, fangen wir an. Die Einzelzell-Elektroporation zielt auf eine einzelne Zelle ab, indem eine gezogene Mikropipettenelektrode aus Glas verwendet wird, die das elektrische Feld auf eine einzelne Zelle in Kontakt mit der Pipettenspitze beschränkt. Die physikalische Geometrie der Pipettenspitze ist ein kritisches Merkmal, das sich direkt auf den Erfolg der Technik auswirkt.

Mit einem Lötabzieher des Modells P 97 werden Mikropipetten aus Bo-Silikatglas mit einem Außendurchmesser von 1,5 Millimetern und einem Innendurchmesser von 0,75 Millimetern erzeugt, die ein internes Filament enthalten, um das Befüllen der Spitze ohne Luftblasen zu erleichtern. Pipettenspitzen, die sich für die Elektroporation von Einzelzellen als am effektivsten erwiesen haben, sind solche mit einem Spitzendurchmesser von 0,5 bis einem Mikrometer und einem Verjüngungswinkel von mehr als 10 Grad. Nach dem Ziehen einer Mikropipette aus Glas kann das Transfermaterial in Lösung durch Hinterfüllen oder unter Verwendung einer Ladespritze in die Pipette geladen werden.

Für diese Demonstration werden wir einzelne Neuronen mit einem hier gezeigten Fluoreszenzfarbstoff oder mit einer Plasmidkodierung fluoreszieren. Grün fluoreszierende GFP-Proteinlösungen sollten kurz bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert werden, um die Menge an Partikeln zu reduzieren, die in die Pipette gelangen. Da dies die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass die Spitze für neue Benutzer verstopft, ist es ratsam, mit Fluoreszenzfarbstoffen zu beginnen, da diese unter Epi-Fluoreszenz leicht zu erkennen sind.

Dies ermöglicht die Visualisierung der Spitze innerhalb der Probe und gibt eine direkte Rückmeldung, ob das Gerät richtig eingerichtet wurde und ob die Pipettenspitze geeignet ist. Gut Gemacht. Nachdem wir die Mikropipette vorbereitet haben, können wir mit der Durchführung des Verfahrens für die Einzelzell-Elektroporation fortfahren.

Die für diese Technik erforderliche elektrische Ausrüstung besteht aus einem Stimulator und einem Oszilloskop sowie einem Pipettenhalter, der mit einem Silberdraht versehen ist, der in die Pipette eingeführt wird. Hier verwenden wir den Axtseparator 800 A eines Axoninstruments, aber auch gängige Stimulatoren wie ein Gras SD nine können verwendet werden. Der Axtseparator ist mit dem Kopftisch verbunden, der zwischen dem Axtseparator und der Silberdrahtelektrode liegt.

Die äußere Erdung der Kaulquappe ist einfach ein silberner Draht, der ein elektronischer Kontakt mit der Kaulquappe bleibt. Bei der Elektroporation werden sowohl der Kopftisch, das Erdkabel als auch die externe Masse der Kaulquappe mit dem Oszilloskopeingang verbunden. Sobald die elektrische Ausrüstung eingerichtet ist, kann die Pipette in den Pipettenhalter eingelegt werden.

Der Pipettenhalter sollte auf einem dreiachsigen Mikromanipulator montiert werden, der eine feine Bewegung ermöglicht. Die Einzelzell-Elektroporation erfordert ein Mikroskop mit einem guten Arbeitsabstand. Denn dies gibt mehr Spielraum und ermöglicht es, die Pipette in einem Winkel von etwa 30 bis 45 Grad einzubringen.

Sobald das Gerät ordnungsgemäß angeschlossen ist, können wir mit einem Einzelzellen-Elektroporationsverfahren beginnen. Zuerst werden Kaulquappen durch Eintauchen in 0,02%MS 2, 2 2 betäubt, die Kaulquappen werden in der Regel vollständig betäubt. Nach etwa fünf Minuten wird eine einzelne Kaulquappe in die Elektroporationskammer überführt.

Mit einer Kunststoff-Transferpipette kann die Kammer einfach im eigenen Haus hergestellt werden, indem ein kaulquappenförmiger Hohlraum in einen kleinen Silikonblock geschnitzt und ein silbernes Erdungskabel so eingeführt wird, dass es in der Kammer mit der Kaulquappenhaut in Kontakt kommt. Als nächstes kannst du die Kaulquappe mit einem Pinsel positionieren, um sicherzustellen, dass sie mit der Rückenseite nach oben zeigt. Die Mikropipette wird dann abgesenkt, bis sie mit der Haut in Kontakt kommt, die direkt an den interessierenden Bereich angrenzt.

Durch fortgesetztes Absenken der Pipette bildet sich zunächst die Haut und gelangt dann in das darunter liegende Gewebe. Hier ziele ich auf den optischen Stum des Gezeitenpolgehirns. Ich ziele speziell auf die Region der Zellkörperschicht ab.

Wenn Sie ein xi verwenden, kann man den Widerstand der Pipette im Gewebe überwachen. Im Allgemeinen liegt der Widerstand zwischen 10 und etwa 40. Megaohm funktionieren gut.

Der Widerstand der Pipette ist ein guter Indikator dafür, ob der Spitzendurchmesser zu klein ist oder ob die Spitze verstopft ist, in diesem Fall ist der Widerstand hoch. Wenn der Spitzendurchmesser jedoch zu groß ist oder die Spitze gebrochen ist, ist der Pipettenwiderstand gering. Trotz des absoluten Widerstands kann die Pipette bei Verwendung eines herkömmlichen Stimulators nicht gemessen werden.

Der Oszilloskop-Messwert ist ein indirektes Maß für den Pipettenwiderstand von fluoreszierenden Dextran-Matrizen. Der Stimulus besteht aus einer 10-Millisekunden-Folge positiver Rechteckimpulse, die mit einer Frequenz von 300 Hertz angelegt werden. Die einzelnen Impulse haben eine Dauer von 300 Mikrosekunden und werden mit einer Spannung von 50 Volt abgegeben.

Mit diesen Einstellungen wird der Fluoreszenzfarbstoff aus der Spitze ausgestoßen, wie bei der Anwendung eines Stimulus nach der Elektrosondierung zu sehen ist. An einer Stelle wird die Pipette zurückgezogen und der Vorgang an verschiedenen Stellen im Gewebe wiederholt, um die Ausbeute zu verbessern. Während eine Spannungsimpulsfolge abgegeben wird, sollte man die Amplitude der resultierenden Impulse am Oszilloskop überwachen und die Amplitude bei Bedarf auf ein bis 1,5 Mikroampere einstellen.

Wenn die Pulsamplitude nach erheblicher Erhöhung der Spannung niedrig bleibt oder im Laufe des Eingriffs abfällt, deutet dies stark darauf hin, dass die Spitze verstopft ist oder dass der Spitzendurchmesser zu klein ist. Das kann ziemlich frustrierend sein, wenn es passiert. Wenn die Amplitude jedoch nach erheblicher Reduzierung der angelegten Spannung immer noch hoch ist oder im Laufe des Eingriffs ansteigt, deutet dies stark darauf hin, dass die Spitze entweder zu breit ist oder dass sie gebrochen ist oder die Spitzen brechen.

Ich werde oft sehr emotional und traurig. Wie bereits erwähnt, besteht der Vorteil der Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen darin, dass man anhand der gegebenen Reizparameter sofort überprüfen kann, ob einzelne Zellen elektroporiert wurden. Wenn Zellen sehr dunkel erscheinen oder keine Zellen beschriftet sind, würde man damit beginnen, jeden Stimulusparameter unabhängig voneinander allmählich zu erhöhen, bis die markierten Zellen so hell beschriftet erscheinen.

Auf der anderen Seite, wenn mehrere Zellen markiert zu sein schienen, verringerte man allmählich die Stimulusparameter, bis es den Anschein hatte, dass eine einzelne Zelle hell markiert war, wie diese. Hell markierte Zellen zu sehen, ist wirklich befriedigend. Im Fall der Plasmid-DNA sind die verwendeten Impulsfolgen negative Impulse, die eine Millisekunde dauern und mit 300 Hertz abgegeben werden, und die Zugdauer beträgt 500 Millisekunden.

Nach der Elektroporation werden die TA-Pole in eine frische Aufzuchtlösung gelegt, wo sie sich schnell von der Narkose erholen. In der Regel können wir nach dem Elektro 50 bis hundert TA-Pole mit dem Screening fortfahren, das ich Ihnen als nächstes zeigen werde. Bevor mit bildgebenden Experimenten begonnen wird, ist es sinnvoll, Elektrokaulquappen schnell mit einem aufrechten Epi-Fluoreszenzmikroskop zu untersuchen.

Um zu bestimmen, welche Kaulquappen Neuronen enthalten, die für die Bildgebung geeignet sind, werden Kaulquappen anästhesiert und dann in eine Zigarrenkammer gelegt und auf den Deckel gelegt. Einzelne Kaulquappen-Gehirne werden dann schnell unter epi-fluoreszierendem Licht betrachtet, um festzustellen, ob einzelne fluoreszierend markierte Neuronen vorhanden sind. Beachten Sie, dass eine übermäßige Exposition gegenüber dem Epi-Fluoreszenzlicht zu einer Phototoxizität führt, die die markierte Zelle töten kann. Versuchen Sie daher, die Zeit, in der die Zellen dem Leuchtstofflicht ausgesetzt sind, so gering wie möglich zu halten.

Bei Dextran-Farbstoffen kann das Screening bereits 30 Minuten nach der Elektroporation erfolgen. Wir stellen jedoch fest, dass längere Intervalle mit niedrigeren Hintergrundfluoreszenzwerten verbunden sind. Im Falle von Plasmiden wird das DNA-Screening in der Regel mindestens 12 Stunden nach der Elektroporation durchgeführt.

Wir verwenden routinemäßig Einzelzell-Elektroporation, um Neuronen innerhalb des optischen Tectums der Kaulquappe fluoreszierend zu markieren. Unser Zwei-Photonen-Mikroskop ist eine Sonderanfertigung, die aus einem konfokalen Olympus FV 300 Mikroskop und einer Chameleon XP Laserlichtquelle besteht. In der Regel verwenden wir eine Wellenlänge von 910 Nanometern, um die Kraft des grünen Bodens abzubilden.

Sobald wir eine Kaulquappe mit einem einzigen markierten AL-Neuron gefunden und sie auf unserem Zwei-Photonen-Rig positioniert haben, führen wir einen Zeitraffer zur Photonenbildgebung von taktilen Neuronen über verschiedene Zeitintervalle durch. Dies ermöglicht es uns, die dynamischen Wachstumsmuster der dendritischen Dorne von AL-Zellen zu beobachten. Hier sehen wir ein Beispiel für ein GFP-exprimierendes Neuron, das mittels Einzelzell-Elektroporation markiert wurde.

Dieses Bild wurde mit in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie aufgenommen, um das neuronale Wachstum zu quantifizieren. Typischerweise werden skelettierte dreidimensionale Rekonstruktionen jedes neuronalen Bildes erzeugt. Die Zeitraffer-Bildgebung mit langwierigen Intervallen gibt Aufschluss über die Langzeitfolgen einer experimentellen Manipulation.

Hier sehen wir ein unreifes GFP-exprimierendes Neuron, das über einen Zeitraum von vier Tagen täglich abgebildet wurde, wobei es sich über die Entwicklung seines dendritischen Dorns erstreckt. Diese Bilder wurden mit Hilfe von zwei Photonenmikroskopien aufgenommen und sind als Z-Projektionen dargestellt. Die schnelle Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht es uns, die Natur dynamischerer Prozesse des neuronalen Wachstums zu beobachten, einschließlich der Bildung und des Rückzugs von dendritischen Filopodien.

Dieses Video zeigt ein relativ ausgereiftes GFP-exprimierendes Neuron, das eine Stunde lang alle zwei Minuten in drei Dimensionen abgebildet wurde. Dies ist ein Beispiel für ein unreifes GFP-exprimierendes Neuron, das im Laufe einer Stunde alle fünf Minuten abgebildet wurde. Jüngere Neuronen sind hochdynamisch und zeigen ein ausgedehntes Astwachstum und Astretraktion.

Eine Zoomansicht dieses GFP-exprimierenden Neurons zeigt das ständige Hinzufügen und Zurückziehen von dendritischen Filopodien, das typisch für die Entwicklung von Neuronen in diesem System ist. Die Transparenz der Albino-Kaulquappe und die Zugänglichkeit ihres Gehirns machen dieses Modellsystem ideal geeignet, um das neuronale Wachstum und intrazelluläre Ereignisse innerhalb eines lebenden Organismus sichtbar zu machen. Die Einzelzell-Elektroporation ermöglicht es uns, das Wachstum eines einzelnen Neurons zu visualisieren und zellautonome Manipulationen in einem ansonsten unveränderten Gehirn durchzuführen.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die Elektroporation von Einzelzellen in Zap Lavas Tat-Polen durchführen können, obwohl wir uns hier auf die Elektroporation in TA-Polen konzentrieren. Diese Technik wurde bereits bei anderen Organismen und auch in Hippocampus-Schnitten und dissoziierten Zellkulturen eingesetzt. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, dass Sie Ihre Pipettenspitzen und Stimulationsparameter ständig ändern, um eine hohe Ausbeute zu erzielen.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.