Single Cell Elektroporation in vivo innerhalb der intakten sich entwickelnde Gehirn

Die Einzelzell-Elektroporation ist eine spezialisierte Technik, die die gezielte Einführung von DNA oder anderen Makromolekülen in einzelne Zellen innerhalb eines intakten Gewebes ermöglicht, einschließlich in vivo-Präparationen, wenn sie mit fortschrittlichen in vivo-Bildgebungstechniken kombiniert wird. Die Einzelzell-Elektroporation fluoreszierender Marker erlaubt die direkte Visualisierung der zellulären Morphologie, des Zellwachstums und interzellulärer Vorgänge über Zeitskalen von Sekunden bis hin zu Tagen. In diesem Video beschreiben wir das Verfahren zur Einzelzell-Elektroporation eines fluoreszierenden Farbstoffs oder plasmidischer DNA in Neuronen innerhalb des intakten Gehirns des XUS-Kaulquapps und zeigen Beispiele der Live-Bildgebung fluoreszenzmarkierter Neuronen.

Oh, hallo. Mein Name ist Eth Haa und ich arbeite im Labor von Dr. Kurt Haass am Brain Research Center der University of British Columbia. Heute werde ich demonstrieren, wie man eine gezielte Einzelzell-Elektroporation von Neuronen im intakten Gehirn des albinotischen XUS Lavis-Kaulquappen durchführt.

Der besondere Vorteil dieser Technik besteht darin, dass experimentelle Manipulationen an einzelnen Zellen durchgeführt werden können, während das umgebende Gewebe unverändert bleibt, wodurch zellautonome Effekte von solchen unterschieden werden können, die auf globalen Behandlungen beruhen. Der erste Schritt besteht darin, Mikropipetten mit geeignetem Nadeldurchmesser und Abschrägungswinkel herzustellen, gefolgt vom Befüllen des Übertragungsmaterials in die Mikropipette. Anschließend müssen die TA-Pools anästhesiert und in die Messkammer überführt werden, woraufhin die Mikropipette in das Gehirn eingeführt und eine Serie von Spannungsimpulsen appliziert wird.

Schließlich werden die markierten Neuronen mittels Zweiphotonen-Mikroskopie abgebildet. Diese Technik wird Ihnen an Froschlaich gezeigt. Die Einzelzellmarkierung kann auch in anderen Modellsystemen sowie in ex vivo-Präparationen angewendet werden.

Bedenkt man dies, können wir beginnen. Die Einzelzell-Elektroporation zielt mithilfe einer gezogenen Glas-Mikropipetten-Elektrode auf eine einzelne Zelle ab, wodurch das elektrische Feld auf eine einzelne Zelle beschränkt wird, die mit der Pipettenspitze in Kontakt steht. Die physikalische Geometrie der Pipettenspitze ist eine entscheidende Eigenschaft, die den Erfolg der Technik direkt beeinflusst.

Ein Solder-Modell-P-97-Ziehgerät wird verwendet, um Mikropipetten aus Borosilikatglas mit einem Außendurchmesser von 1,5 Millimetern und einem Innendurchmesser von 0,75 Millimetern herzustellen, das einen internen Filament enthält, um das Befüllen der Spitze ohne Luftblasen zu erleichtern. Pipettenspitzen, die sich als am effektivsten für die Einzelzell-Elektroporation erwiesen haben, weisen einen Spitzeninnendurchmesser von 0,5 bis 1 Mikrometer und Taper-Winkel von mehr als 10 Grad auf. Nach dem Ziehen einer Glas-Mikropipette kann das in Lösung vorliegende Transfermaterial durch Rückbefüllung oder mittels einer Ladespritze in die Pipette geladen werden.

Für diese Demonstration werden wir einzelne Neuronen mit einem hier gezeigten fluoreszierenden Farbstoff oder mit einem Plasmid, das für GFP kodiert, fluoreszenzmarkieren. GFP-Lösungen (grünes fluoreszierendes Protein) sollten kurzzeitig mit hoher Geschwindigkeit zentrifugiert werden, um die Menge an partikulärem Schmutz zu verringern, der in die Pipette gelangt. Da dies bei neuen Anwendern die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass die Pipettenspitze verstopft, ist es ratsam, zunächst mit fluoreszierenden Farbstoffen zu beginnen, da diese unter Epifluoreszenz leicht sichtbar sind.

Dies ermöglicht die Visualisierung der Pipettenspitze innerhalb der Probe und liefert direktes Feedback darüber, ob die Ausrüstung korrekt eingerichtet wurde und ob die Pipettenspitze geeignet ist. Gute Arbeit. Nachdem wir die Mikropipette vorbereitet haben, können wir nun mit der Durchführung des Verfahrens für die Einzelzell-Elektroporation fortfahren.

Die für diese Technik erforderliche elektrische Ausrüstung umfasst einen Stimulator, ein Oszilloskop und einen Pipettenhalter, der mit einem Silberdraht ausgestattet ist, der in die Pipette eingeführt wird. Hier verwenden wir ein Axon Instruments Ax-Separator-800A, jedoch können auch gängige Stimulatoren wie der Grass SD9 verwendet werden. Der Ax-Separator ist mit der Headstage verbunden, die als Schnittstelle zwischen dem Ax-Separator und der Silberelektrode dient.

Der äußere Massekontakt des Kaulquappen ist einfach ein Silberdraht, der elektrischen Kontakt mit der Kaulquappe hält. Während der Elektroporation werden die Kopfphase, die Masseleitung und der äußere Massekontakt der Kaulquappe beide mit dem Oszilloskop-Eingang verbunden. Sobald die elektrische Ausrüstung eingerichtet ist, kann die Pipette in den Pipettenhalter eingesetzt werden.

Der Pipettenhalter sollte an einem dreidimensionalen Mikromanipulator befestigt werden, der feine Bewegungen ermöglicht. Für die Einzelzell-Elektroporation ist ein Mikroskop mit großem Arbeitsabstand erforderlich. Dieser bietet mehr Platz für die Handhabung und ermöglicht es, die Pipette in einem Winkel von etwa 30 bis 45 Grad anzubringen.

Nachdem die Ausrüstung ordnungsgemäß angeschlossen wurde, kann mit dem Einzelzell-Elektroporationsverfahren begonnen werden. Zunächst werden Kaulquappen durch Eintauchen in 0,02 % MS 222 anästhesiert, wodurch die Kaulquappen in der Regel vollständig betäubt werden. Nach etwa fünf Minuten wird eine einzelne Kaulquappe in die Elektroporationskammer überführt.

Mithilfe einer Plastik-Transferpipette kann die Kammer problemlos im Haus hergestellt werden, indem man in einen kleinen Silikonblock eine keulenförmige Vertiefung formt und einen silbernen Masse-Draht so einfügt, dass er im Betrieb mit der Haut des Kaulquapps in Kontakt steht. Anschließend sorgt der Einsatz eines Pinsels zur Positionierung dafür, dass der Kaulquapp mit der dorsalen Seite nach oben liegt. Danach wird die Mikropipette so weit abgesenkt, bis sie mit der Haut direkt benachbart zur interessierenden Region in Kontakt steht.

Ein weiteres Absenken der Pipette wird zunächst eine Delle in der Haut erzeugen und dann in das darunterliegende Gewebe eindringen. Hier zielen ich auf den optischen Tuberculus des Tägerhirns. Genau genommen richte ich mich auf den Bereich der Zellkörperlage.

Wenn Sie ein xi verwenden, kann man den Widerstand der Pipette im Gewebe überwachen. Im Allgemeinen liegt der Widerstand zwischen 10 und etwa 40 Megaohm, was gut funktioniert.

Der Widerstand der Pipette ist ein guter Indikator dafür, ob der Tip-Durchmesser zu klein ist oder ob der Tip verstopft ist, in welchem Fall der Widerstand hoch sein wird. Wenn hingegen der Tip-Durchmesser zu groß ist oder der Tip beschädigt ist, wird der Pipettenwiderstand niedrig sein. Obwohl der absolute Widerstand vorliegt, kann die Pipette nicht gemessen werden, wenn ein herkömmlicher Stimulator verwendet wird.

Die Oszilloskopablesung ist eine indirekte Messung des Pipettenwiderstands für fluoreszierende Dextranfarbstoffe. Der Reiz besteht aus einer 10 Millisekunden dauernden Serie positiver Rechteckimpulse, die mit einer Frequenz von 300 Hertz appliziert werden. Einzelne Impulse haben eine Dauer von 300 Mikrosekunden und werden bei einer Spannung von 50 Volt ausgegeben.

Mit diesen Einstellungen wird der fluoreszierende Farbstoff aus der Spitze ausgestoßen, wie man nach Anlegen eines Stimulus nach der Elektroprobenahme sehen kann. An einer Stelle wird die Pipette zurückgezogen und der Vorgang an verschiedenen Stellen im Gewebe wiederholt, um die Ausbeute zu verbessern. Während eine Spannungspulsfolge abgegeben wird, sollte man die Amplitude der resultierenden Pulse auf dem Oszilloskop überwachen und die Amplitude gegebenenfalls auf zwischen ein und 1,5 Mikroampere einstellen.

Wenn die Pulsamplitude nach einer erheblichen Erhöhung der Spannung weiterhin niedrig bleibt oder im Verlauf des Verfahrens abfällt, deutet dies stark darauf hin, dass die Spitze verstopft ist oder dass der Spitzen­durchmesser zu klein ist. Dies kann ziemlich frustrierend sein, wenn es auftritt. Wenn hingegen die Amplitude nach einer erheblichen Verringerung der angelegten Spannung weiterhin hoch bleibt oder im Verlauf des Verfahrens ansteigt, weist dies stark darauf hin, dass die Spitze entweder zu weit ist oder beschädigt beziehungsweise abgebrochen ist.

Ich werde oft sehr emotional und traurig. Wie bereits erwähnt, besteht der Vorteil der Verwendung fluoreszierender Farbstoffe darin, dass man sofort überprüfen kann, ob Einzelzellen mit den gegebenen Stimulusparametern elektroporiert wurden. Wenn die Zellen sehr schwach erscheinen oder keine Zellen markiert sind, würde man damit beginnen, jeden Stimulusparameter unabhängig voneinander schrittweise zu erhöhen, bis die markierten Zellen hell markiert erscheinen, wie hier gezeigt. Schöne, klar markierte Zellen machen für mich den Tag aus.

Andererseits verringert man die Reizparameter schrittweise, wenn zahlreiche Zellen markiert erscheinen, bis hin zu dem Punkt, an dem eine einzelne Zelle so hell markiert ist wie diese hier. Hell markierte Zellen zu sehen, ist äußerst befriedigend. Im Fall von Plasmid-DNA werden negative Pulse verwendet, die eine Millisekunde lang sind und mit 300 Hertz übermittelt werden, wobei die Zugdauer 500 Millisekunden beträgt.

Nach der Elektroporation werden die TA-Polen in frische Aufzuchtlösung gegeben, wo sie sich schnell von der Anästhesie erholen. Typischerweise können wir nach der Elektroporation von 50 bis 100 TA-Polen mit der Untersuchung fortfahren, was ich Ihnen als Nächstes zeigen werde. Vor Beginn der Abbildungsexperimente ist es sinnvoll, die elektroporierten Kaulquappen mithilfe eines aufrechten Epi-Fluoreszenzmikroskops schnell zu überprüfen.

Um festzustellen, welche Kaulquappen Neuronen enthalten, die sich für die Bildgebung eignen, werden die Kaulquappen anästhesiert und anschließend in eine Zigarrenkammer gegeben. Einzelne Kaulquappen-Gehirne werden dann mit einem Deckglas abgedeckt und rasch unter epifluoreszierendem Licht untersucht, um zu überprüfen, ob einzelne fluoreszenzmarkierte Neuronen vorhanden sind. Beachten Sie, dass eine übermäßige Belichtung gegenüber dem epifluoreszierenden Licht zu Phototoxizität führen kann, wodurch die markierte Zelle abgetötet werden könnte. Daher sollte die Belichtungszeit der Zellen gegenüber dem fluoreszierenden Licht so kurz wie möglich gehalten werden.

Im Fall von Dextran-Farbstoffen kann die Bildaufnahme bereits 30 Minuten nach der Elektroporation erfolgen. Wir stellen jedoch fest, dass längere Intervalle mit niedrigeren Hintergrundfluoreszenzniveaus verbunden sind. Bei Plasmid-DNA erfolgt die Bildaufnahme typischerweise erst mindestens 12 Stunden nach der Elektroporation.

Wir verwenden routinemäßig die Einzelzell-Elektroporation, um Neuronen im Optischen Tectum von Kaulquappen mit Fluoreszenzfarbstoffen zu markieren. Unser Zwei-Photonen-Mikroskop ist speziell angefertigt und aus einem konfokalen Olympus FV 300-Mikroskop sowie einer Chameleon XP-Laserlichtquelle aufgebaut. Zum Abbilden der grünen Fluoreszenz verwenden wir typischerweise eine Wellenlänge von 910 Nanometern.

Nachdem wir einen Kaulquappe mit einem einzigen markierten AL-Neuron gefunden und auf unserer Zwei-Photonen-Anordnung positioniert haben, führen wir zeitraffende Photonenbilder von taktilen Neuronen in verschiedenen Zeitintervallen durch. Dies ermöglicht es uns, die dynamischen Wachstumsmuster der dendritischen Bäume von AL-Zellen zu beobachten. Hier sehen wir ein Beispiel eines GFP-exprimierenden Neurons, das mittels Einzelzell-Elektroporation markiert wurde.

Dieses Bild wurde mithilfe der in-vivo-Zwei-Photonen-Mikroskopie aufgenommen, um das neuronale Wachstum zu quantifizieren. Üblicherweise werden skelettierte dreidimensionale Rekonstruktionen jedes neuronalen Bildes erstellt. Zeitrafferaufnahmen mit verlängerten Intervallen liefern Einblicke in die Langzeitfolgen einer experimentellen Manipulation.

Hier sehen wir ein unreifes, GFP-exprimierendes Neuron, das über einen Zeitraum von vier Tagen täglich abgebildet wurde, während sich sein dendritischer Baum ausbildete. Diese Aufnahmen wurden mittels Zweiphotonen-Mikroskopie angefertigt und als Z-Projektionen dargestellt. Mithilfe schneller zeitrafferartiger Bildgebung können wir die dynamischen Prozesse des neuronalen Wachstums beobachten, einschließlich der Bildung und des Rückzugs dendritischer Filopodien.

Dieses Video zeigt ein relativ ausgereiftes, GFP-exprimierendes Neuron, das über eine Stunde lang alle zwei Minuten in drei Dimensionen abgebildet wurde. Dies ist ein Beispiel für ein unreifes, GFP-exprimierendes Neuron, das über einen Zeitraum von einer Stunde alle fünf Minuten abgebildet wurde. Jüngere Neuronen sind stark dynamisch und zeigen umfangreiches Verzweigungswachstum sowie Verzweigungsretraktion.

Die vergrößerte Ansicht dieses GFP-exprimierenden Neurons zeigt die ständige Bildung und Rückbildung dendritischer Filopodien, die für sich entwickelnde Neurone in diesem System typisch ist. Die Transparenz des albino-Tüpfeltieres und die Zugänglichkeit seines Gehirns machen dieses Modellsystem ideal dafür, neuronales Wachstum und intrazelluläre Vorgänge in einem lebenden Organismus zu visualisieren. Die Einzelzell-Elektroporation ermöglicht es uns, das Wachstum eines einzelnen Neurons zu beobachten und zellautonome Eingriffe innerhalb eines ansonsten unveränderten Gehirns durchzuführen.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man eine Einzelzell-Elektroporation in Zap-Lavis-Tat-Polen durchführt, obwohl wir uns hier auf die Elektroporation in TA-Polen konzentrieren. Diese Technik wurde bereits bei anderen Organismen angewandt und auch in hippocampalen Schnitten sowie in dissoziierten Zellkulturen verwendet. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sicherzustellen, dass Sie Ihre Pipettenspitzen und Stimulationsparameter kontinuierlich anpassen, um eine hohe Ausbeute zu gewährleisten.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.