Ein optimiertes Protokoll für Candida albicans-Infektion in Schmidtea mediterranea zur Untersuchung der Pilzpathogenese und der Wirtsabwehr

Meine Forschung konzentriert sich auf Candida albicans-Infektionen und darauf, wie Wirtsreaktionen beeinflussen, ob das Ergebnis eine Clearance oder Krankheitsprogression ist. Eine zentrale Herausforderung ist das Fehlen von Modellen für frühe Pilzinfektionen. Dieses Protokoll verwendet Planarian als handhabbare, hochdurchsatzfähige Lösung.

Das planarische System ermöglicht die Untersuchung von Krankheitsinitiation, -fortschreitung, -beseitigung und -tödlichkeit mit hochauflösender Messung angeborener Immunantworten. Zu Beginn wählen Sie Schmidtea mediterranea planaries mit einer Länge von etwa fünf Millimetern unter einem Stereomikroskop aus und stellen Sie sicher, dass die Tiere vor der Messung vollständig ausgestreckt sind. Vermeiden Sie die Verwendung von Planarian, die kleiner als fünf Millimeter sind, da sie möglicherweise Personen mit Blasemas oder unvollständiger Entwicklung einschließen, die zu inkonsistenten Ergebnissen führen können.

Außerdem sollten Planarien größer als fünf Millimeter ausgeschlossen werden, da größere Tiere für fluoreszenzbedingte Immunfärbung weniger geeignet sind. Tiere mit Blastemas, fehlendem Gewebe oder unvollständiger Pigmententwicklung ausschließen. Übertragen Sie gesundes Planarium, das alle Einschlusskriterien erfüllt, in zwei Milliliter frisches Planarianwasser pro Brunnen in einer mit Nicht-Gewebekultur behandelten Polystyrolplatte mit sechs Bohrlöchern.

Weisen Sie Brunnen für negative Kontrollen, bestehend aus uninfizierten oder künstlich behandelten Tieren, sowie positive Kontrollen, die mit Wildtyp-Candida albicans infiziert sind. Entfernen Sie das gesamte Wasser aus jedem Brunnen und ersetzen Sie es durch zwei Milliliter frisches Planariumwasser, um die Gleichmäßigkeit über die Brunnen zu gewährleisten. Lassen Sie die Tiere einen Tag lang in der neuen Umgebung im Gleichgewicht bleiben, bevor sie sich anstecken.

Neigen Sie die Sechs-Brunnen-Platte und entfernen Sie vorsichtig das gesamte Wasser jeweils aus einem Brunnen mit aseptischer Technik. Fügen Sie sofort das berechnete Volumen des planarischen Wassers und der Candida albicans-Kultur dem Brunnen hinzu, bevor Sie zum nächsten Brunnen weitergehen. Notieren Sie das Datum und die Uhrzeit der Impfung.

Platzieren Sie die inokulierte Sechs-Well-Platte an einen dunklen, statischen Ort bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie den Planarian mit Candida albicans bis zu 72 Stunden, abhängig vom gewünschten Endpunkt. Beim ersten Mal, 24 Stunden nach der Infektion, kippen Sie die Platte leicht.

Anschließend wird mit einer sterilen Transferpipette die Flüssigkeit mit der Candida albicans-Kultur aspiriert und vorsichtig in einen tierfreien Bereich des Brunnens gegeben, um die abgesetzte Pilzschicht zu mischen. Wiederholen Sie diesen Schritt fünf- bis zehnmal pro Brunnen, um die abgesetzte Pilzschicht aufzulösen und direkten Kontakt mit den Planarianen zu vermeiden. Beobachten Sie die Ablagerung von Pilzen vor und nach dem Wiederschweben vor und nach den Wiederschwenkstufen für die beste Sichtbarkeit.

Nicht infizierte Kontrollbrunnen unter identischen Bedingungen wieder suspendieren. Wiederholen Sie dieses Verfahren 48 Stunden nach der Infektion. 72 Stunden nach der Infektion werden Planarians mit zwei Millilitern sauberem Wasser in Frischbrunnen überführt, wodurch die Pilzübertragung durch minimale Flüssigkeit minimiert wird.

Sobald die Tiere versetzt sind, entfernen Sie das gesamte Wasser und ersetzen Sie es durch frisches planarisches Wasser. Beginnen Sie mit der Bewertung der Wirtsergebnisse einen Tag nach der Infektion und setzen Sie täglich fort, bis zum gewünschten experimentellen Endpunkt. Quantifizieren Sie den Wirtsschaden mit dem standardisierten Null-zu-Drei-Bewertungssystem.

Drei Tage nach der Infektion werden Sie vorsichtig auf eine neue Sechs-Well-Platte mit jeweils zwei Millilitern frischem Planarianwasser pro Bohrloch übertragen, wobei die Übertragung der Restpilzkultur vermieden wird. Beobachten Sie Tiere mit Lichtmikroskopie und einem mindestens 10-fachen Ziel. Erfassen Sie die Ergebnisse des Hosts mit dem standardisierten Bewertungsblatt.

Zusätzlich kann eine Anti-Candida-Immunfärbung durchgeführt werden, um die Pilzbesiedlung des Wirtsepithels während der Infektion und Beseitigung zu beobachten. Die epitheheliale Besiedlung des Pilzes war um vier Tage nach der Infektion deutlich reduziert, und sieben Tage nach der Infektion waren fast alle oberflächenassoziierten Pilze unter ID50-Bedingungen beseitigt. Nicht infizierte Kontrollgruppen blieben völlig asymptomatisch.

Bei etwa 7,0 mal 10 pro Potenz von sieben Candida albicans-Zellen pro Milliliter waren etwa 30 % asymptomatisch, 50 % symptomatisch und 20 % tot. Mit etwa 8,0 mal 10 x sieben Candida-albicans-Zellen pro Milliliter waren etwa 30 % asymptomatisch, 20 % symptomatisch und 50 % tot. Die mediane Überlebensrate sank von etwa 90 % bei 7,0 mal 10 auf die Potenz von sieben Candida albicans-Zellen pro Milliliter, auf etwa 50 % bei 8,0 mal 10 auf die Potenz von sieben Zellen pro Milliliter und auf weniger als 25 % bei 8,5 mal 10 auf die Potenz von sieben Zellen pro Milliliter.

Das Gesamtüberleben lag bei Planarien, die mit Wildtyp-Candida albicans infiziert waren, etwa 50 % bei etwa 8,0 mal 10 pro Potenz von sieben Zellen pro Milliliter, verglichen mit 100 % Überleben bei uninfizierten Kontrollen. Dieses Protokoll ermöglicht die In-vivo-Untersuchung der Dynamik von Wirt und Erreger, indem bildgebende und molekulare Ansätze in einem genetisch beherrschbaren Wirt integriert werden. Zukünftige Anwendungen umfassen Hochdurchsatz-Mutanten-Screening, vergleichende Studien über mikrobielle Arten sowie Anpassungen für Toxikologie und Wirksamkeitstests von Medikamenten.