Eine effiziente und schnelle HPLC-QQQ-MS-Methode zur Quantifizierung von Tropanalkaloiden in Heilpflanzen

Wir entwickelten eine HPLC-QQQ-MS-Methode, um drei Haupttropanalkaloide in Anisodus tanguticus schnell zu quantifizieren. Konventionelles HPLC weist keine Empfindlichkeit für Tropanalkaloide auf. Diese Methode verwendet hochempfindliche Massenspektrometrie, um dieses Problem zu lösen.

Zu Beginn sollten Sie 10,0 Milligramm Hyoscyamin, Anisominhydrobromid und Scopolaminhydrobromid-Referenzstandards genau wiegen. Geben Sie sie in einen separaten 10-Milliliter-Volumenkolben. Fügen Sie chromatographisches Methanol der markierten Linie in jedem volumetrischen Kolben hinzu.

Lösen Sie die Standards gründlich mit Ultraschallbehandlung auf, um Einzelstandardlösungen mit einer Konzentration von 1,0 Milligramm pro Milliliter herzustellen. Dann werden die Lagerlösungen in braune Reagenzflaschen übertragen und bei vier Grad Celsius im Dunkeln gelagert. Um eine gemischte Standard-Zwischenlösung von 10 Mikrogramm pro Milliliter herzustellen, pipettieren Sie 100 Mikroliter jeder zuvor vorbereiteten Lagerlösung in eine 10-Milliliter-Volumetrische Flasche.

Anschließend wird chromatographisches Methanol zur markierten Linie hinzugefügt, um die Lösung zu verdünnen. Als Nächstes wird frisches Material von Sophora Flavescens gefriertrocknet. Anschließend wird das getrocknete Material mit einer Hochgeschwindigkeitsmühle zu einem homogenen Pulver zerkleinert.

Siebe das Pulver durch ein 0,25-Millimeter-Standardtestsieb. Genau 20 Milligramm des Siebpulvers wiegen. Geben Sie es in eine 100-Milliliter-Mengflasche und fügen Sie chromatographisches Methanol knapp unterhalb der markierten Linie hinzu.

Als Nächstes führen Sie eine Ultraschallextraktion bei Raumtemperatur für 30 Minuten durch. Dann entferne den Volumenkolben und lasse ihn bei Raumtemperatur auf 25 Grad Celsius abkühlen. Fügen Sie chromatographisches Methanol zur 100-Milliliter-markierten Linie hinzu und Wirbel, um zwei Minuten lang zu mischen.

Dann pipettiert man einen Milliliter des vorbereiteten Extrakts in eine 100-Milliliter-Mengflasche. Füge Methanol zur markierten Linie hinzu. Schütteln Sie gut, um gründlich zu mischen, und erhalten Sie die Mutterlösung für die HPLC-Injektion.

Für die Probenfiltration bereiten Sie eine ein Milliliter einwegnadelfreie Spritze und eine 0,22 Mikrometer große organisch-phasenmikroporöse Membran vor. Aspirieren Sie 1,2 Milliliter der Mutterlösung zur Injektion in die Spritze und filtern Sie die Lösung langsam durch die Membran. Sammeln Sie das Filtrat in ein Zwei-Milliliter-Probefläschchen mit einem Inneneinsatz und schließen Sie das Fläschchen fest mit einem Deckel.

Bereiten Sie mobile Phase A vor, indem Sie 1000 Milliliter ultrareines Wasser messen. Gib 1,0 Milliliter chromatographische Ameisensäure hinzu und vermische 10 Minuten lang gleichmäßig mit einem magnetischen Rührer. Als Nächstes bereiten Sie mobile Phase B direkt mit chromatographischem Methanol ohne zusätzliche Behandlung vor.

Degas mobile Phasen A und B bei 40 Kilohertz für 15 Minuten mit separaten Ultraschallentgasungseinheiten. Verbinden Sie die entgasten mobilen Phasen in separaten Lösungsmittelflaschen mit den entsprechenden A- und B-Leitungen des HPLC-Systems. Verwenden Sie eine C18-Säule für die chromatographische Trennung.

Gleichgewicht der Säule mit Methanol und Wasser im Verhältnis von 80 zu 20 für 30 Minuten bei einer Durchflussrate von 0,3 Millilitern pro Minute aus. Stelle die Kolonnenofentemperatur auf 30 Grad Celsius ein und erhitze sie 10 Minuten im Voraus. Dann stellen Sie die Durchflussrate auf 0,60 Milliliter pro Minute, das Einspritzvolumen auf zwei Mikroliter und die Detektionswellenlänge auf 210 Nanometer ein.

Danach setze das Gradienten-Elution-Programm mit den angegebenen Bedingungen. Durchführung von Massenspektrometrie-Detektion mit einem dreifachen Quadrupol-Massenspektrometer, das mit einer Elektrosprüh-Ionisationsquelle im positiven Ionisationsmodus arbeitet. Stellen Sie den Verneblerdruck auf 15 Pfund pro Quadratzoll, die Kapillarspannung auf 4.000 Volt, die Gastemperatur auf 300 Grad Celsius und den Gasfluss auf 11 Liter pro Minute ein.

Dann werden die Parameter für mehrere Ionenpaare zur Überwachung der Reaktion festgelegt. Um Vorläuferionen zu identifizieren, werden einzelne Standardlösungen direkt im MS2-Scan-Modus infundiert. Nach der Methodenvalidierung wird die Datenerfassung im Mehrfachreaktionsüberwachungsmodus durchgeführt.

Verwenden Sie die optimierten Parameter, einschließlich Vorläuferion, Produktionenübergänge, Fragmentorspannung und Kollisionsenergie für jeden Analyten, wie hier dargestellt. Starten Sie die qualitative Analyse-Software. Wählen Sie eine Datei und wählen Sie Daten importieren, um alle gesammelten Dateien zu importieren.

Überprüfen Sie die Peak-Symmetrie und die Konsistenz der Retentionszeiten der Ziel-Peaks in jedem extrahierten Ionenchromatogramm. Im Quantitationsmodul wählen Sie MRM-Übergang. Geben Sie für jede Komponente die Vorläuferionen- und Produktionenpaare ein und extrahieren Sie die entsprechenden extrahierten Ionenchromatogramme.

Berechnen Sie die Spitzenfläche für die quantitative Analyse. Alle drei Ziel-Tropanalkaloide wurden unter den optimierten HPLC-Bedingungen innerhalb von 20 Minuten erfolgreich getrennt. Die Auflösung zwischen Skopolamin und Anisodam betrug 8,67.

Während der Wert zwischen Anisodamin und Hyoscyamin 11,58 erreichte, überstiegen alle Auflösungswerte deutlich das Basistrennungskriterium von 1,5. Alle Analyten zeigten eine gute Linearität über einen Konzentrationsbereich von 0,014 bis 0,320 Mikrogramm pro Milliliter mit Korrelationskoeffizienten über 0,99. Die durchschnittlichen Erholungen betrugen 101,44 % für Scopolamin, 100,25 % für Anisodamin und 99,56 % für Hyoscyamin, mit relativen Standardabweichungen von 1,85 %, 2,35 % bzw. 1,9 %.

Die Quantifizierung von drei Tropanalkaloiden in 10 Proben von Anisodus tanguticus zeigte, dass der Scopolamingehalt in Probe sechs von 0,3667 Milligramm pro Gramm bis 1,0356 Milligramm pro Gramm in Probe sieben lag. Der Anisodamingehalt reichte von 0,0269 Milligramm pro Gramm in Probe sechs bis 0,3590 Milligramm pro Gramm in Probe 10. Der Hyoscyamingehalt reichte von 0,2930 Milligramm pro Gramm in Probe zwei bis zu 1,4989 Milligramm pro Gramm in Probe 10, wobei höhere Werte in Proben vier, sieben, neun und zehn beobachtet wurden.

Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle, genaue Quantifizierung von drei Haupttropanalkaloiden. Die größte Herausforderung besteht darin, das Instrumentenverfahren und eine standardisierte Probenvorbereitung für eine genaue Messung sicherzustellen. Diese Methode kann erweitert werden, um andere Metaboliten in Anisodus tanguticus zu erforschen und zu quantifizieren.