Ein mikrofluidisches System zur Modellierung der endothelialen Dysfunktion unter kombinierter physiologischer pulsatiler Scherspannung und oszillatorischer Hyperglykämie

Diese Studie untersucht, wie synchronisierte oszillatorische Hyperglykämie und die pulsatile Scherspannung zusammen die endotheliale Dysfunktion bei diabetischen Gefäßerkrankungen antreiben. Bestehende Modelle verwenden einen anfangshohen Glukosespiegel oder einen stetigen laminaren Fluss. Wir untersuchen, wie pulsatile Scherspannung oszillatorische Glukoseschäden ausgleicht.

Zu Beginn verwenden Sie computergestützte Designsoftware, um die Mikrofluidik-Chipstruktur zu entwerfen. Stelle die SU-8 Masterform über eine kommerzielle Firma her. In einem sauberen Rührbecher mischen Sie das Polydimethylsiloxan-Härtemittel und das Vorpolymer im Verhältnis 10:1 nach Gewicht und rühren Sie die Mischung fünf Minuten lang kräftig von Hand um.

Dann wird der Behälter mindestens 15 Minuten lang bei einem Druck von 0,08 Megapascal in eine Vakuumkammer gestellt, um beim Mischen eingeschlossene Luftblasen zu entfernen. Gießen Sie das Polydimethylsiloxan auf die in eine Glaspetrischale gelegte Wafer. Degas das Polydimethylsiloxan wird für weitere 15 Minuten in einem Desiccator auf den Wafer gegossen, um während des Gießens entstandene Blasen zu entfernen.

Stellen Sie die Petrischale mit Form und Polymer für zwei Stunden in einen heißen Ofen mit 80 Grad Celsius. Mit einem Skalpell zieht man die verfestigte Polymerplatte vorsichtig aus der Hauptform. Mit einem Kernstanzwerkzeug werden Ein- und Auslassöffnungen an den vorgesehenen Kanalenden der Polymerplatte angelegt.

Reinigen Sie den Glasdeckel und die gemusterte Oberfläche der Polymerplatte mit Klebeband. Als Nächstes behandeln Sie sowohl die Polymerplatte als auch den Glasdeckelrutscher mit einem Plasmareiniger mit 65 Watt unter Raumluft für 60 Sekunden. Richten Sie die Oberfläche des Polymerkanals sofort auf die behandelte Seite des Glasverschlusses aus.

Dann sanft drücken, um einen dauerhaft geschlossenen mikrofluidischen Kanal zu schaffen. Setze den gebundenen mikrofluidischen Chip in eine boronisierte Glasflasche, die mit deionisiertem Wasser gefüllt ist. Sterilisieren Sie durch Autoklavierung bei 121 Grad Celsius und 15 Pfund pro Quadratzoll für 20 Minuten.

Geben Sie den sterilisierten Chip in eine 60-Millimeter-Kulturschale, gefüllt mit einer äquimolaren Mischung aus PBS und niedrigem Glukose-DMEM. Dann gib du mit einer Ein-Milliliter-Spritze 100 Mikrogramm pro Milliliter Fibronectin in den Kanal und inkubiere bei 37 Grad Celsius vier Stunden lang. Als Nächstes fügen Sie 24,5 millimolare Demanitol zum niedrigen Glukose-DMEM hinzu, um den osmotischen Druck zu erhöhen.

Fügen Sie fünf millimolare D-Glukose zu hochglukosehaltigem DMEM hinzu, um eine Endkonzentration von 30 millimolaren Glukose zu erhalten. Bereite ein normales Glukosekulturmedium und ein hochglukosehaltiges Kulturmedium vor, ergänzt mit 20 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin. Dann erwärmte PBS, Trypsin, ein normales Glukosekulturmedium und ein hochglukosehaltiges Kulturmedium in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius.

Entnehmen Sie die menschlichen Nabelvenendothelzellen aus der Kulturschüssel bei 90 % Konfluenz. Trennen Sie die Zellen mit 0,25%-Trypsin-EDTA-Lösung. Nachdem die Zellen bei 37 Grad Celsius für 30 Sekunden inkubiert wurden, zählen Sie die entnommenen Zellen und suspendieren Sie sie separat in normalem Glukose- und hohem Glukosemedium in einer Konzentration von 1 mal 10 pro Milliliter.

Mit einer Ein-Milliliter-Spritze wird 100 Mikroliter der Zellsuspension in den Einlassport des Mikrofluidikchips injiziert, mit normalem Glukosemedium für die Kontrollgruppe und hohem Glukosemedium für die Versuchsgruppe. Platzieren Sie die Mikrofluidchips in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für 48 Stunden. Berechnen Sie die Flussrate, die erforderlich ist, um die angestrebte pulsatile Scherspannung mit der dargestellten Gleichung zu erreichen.

Verbinde die Druckquelle mit dem Druckregler. Dann wird der Druckregler mit dem Ventilregler verbunden, der mit dem Computer verbunden ist, um die Druckwellenformen automatisiert zu steuern. Füllen Sie zwei 100-Milliliter-Reservoirs, eines mit normalem Glukosekulturmedium und das andere mit hohem Glukosekulturmedium.

Verbinden Sie die Reservoirs mit den entsprechenden Kanälen des Druckreglers. Dann werden die Reservoirs und das zweistufige, dreifache Magnetventil mit Silikonrohren verbunden. Stellen Sie die physiologische pulsierende Scherspannung des Ziels entsprechend einer Durchflussrate von etwa 200 Mikrolitern pro Minute ein.

Programmieren Sie die programmierbare Luftpumpe so, dass sie eine Sinuswellenfunktion erzeugt, um die pulsatile Scherspannung aufrechtzuerhalten. Als Nächstes programmieren Sie den Ventilregler so, dass er alle fünf Minuten den Kanal wechselt, um während der dynamischen Stimulation eine Rechteckwellen-Glukoseoszillation zu erzeugen. Verbinden das zweistufige, dreifache Magnetventil und den Mikrofluidikchip mit Silikonrohren.

Dann startet das programmierbare Pumpensystem, um das Rohr zu starten. Anschließend befestigt man mit den 1,3 Millimeter großen, 90-Grad-Winkel-Edelstahlverbindern die Ein- und Auslassöffnungen des Mikrofluidikchips am Rohr. Schließen Sie den Mikrofluidik-Chip-Auslass an das Abwasserreservoir an und starten Sie die Pumpe erneut, um eine kombinierte oszillierende Glukose- und pulsierende Scherspannung für insgesamt 30 Minuten zu liefern.

Nach Durchführung der Flussfeldverifikation bereiten Sie die Calcein AM und Propidiumiodid Arbeitslösung gemäß den Anweisungen des Herstellers am experimentellen Endpunkt vor. Nachdem der Kanal einmal mit PBS abgespült wurde, gib die Calcein AM und die Propidiumiodid-Arbeitslösung in den Kanal ein und inkubiere bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für 30 Minuten im Dunkeln. Sofort werden fluoreszierende Bilder der gefärbten Zellen mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit einer 10-fachen Objektivlinse aufgenommen.

Sofort werden fluoreszierende Bilder der gefärbten Zellen mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit einer 10-fachen Objektivlinse aufgenommen. Verwenden Sie den Fluorescein-Isothiocyanat-Grünfilter für Calcein AM und den Tetramethylrhodamin- oder Rhodamin-Rotfilter für Propidiumiodid. Nach dreimaliger Spülung des Kanals mit PBS wird die Blenden-Lösung der Aktivenz-Zell-Oxidative-Stress-Fluoresziersonde in den Kanal eingeführt und wie zuvor gezeigt inkubiert.

Spülen Sie den Kanal dreimal mit PBS, um die ungebundene Sonde zu entfernen. Nehmen Sie sofort fluoreszierende Bilder mit dem Fernrotfilter auf, der über ein 20-faches Objektiv eingestellt ist, wobei die Belichtungsparameter in allen Gruppen identisch bleiben. Öffnen Sie die aufgenommenen Calcein-AM-grünen und Propidiumiodid-roten Bilder in ImageJ.

Stellen Sie den Schwellenwert für jeden Kanal manuell an, um fluoreszierende Signale vom Hintergrund zu unterscheiden. Verwenden Sie den Zellzähler, um fluoreszierende Zellen zu quantifizieren und die minimale Zellgröße anhand von Beobachtungen anzupassen, um die Anzahl lebender und toter Zellen über mehrere Sichtfelder hinweg zu bestimmen. Berechnen Sie den Prozentsatz der lebenden Zellen mit Tabellenkalkulationssoftware für jede experimentelle Bedingung.

Dann berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung über mehrere Sichtfelder hinweg mit statistischer Analysesoftware, um Gruppen zu vergleichen. Ziehe das gewählte Bild in ImageJ. Wählen Sie Analysieren und wählen Sie Set Scale, um die Pixelgröße mit den Metadaten des Mikroskops zu kalibrieren.

Dann entfernen Sie das unspezifische einheitliche Hintergrundsignal aus dem gesamten Bild mit der Hintergrundsubtraktionsfunktion, indem Sie Prozesse auswählen und Hintergrund subtrahieren. Anschließend wählen Sie Bild und Anpassen, gefolgt von Schwellenwert, um den Schwellenregler manuell anzupassen und das intrazelluläre Signal der reaktiven Sauerstoffspezies zu definieren. Setzen Sie die Messungen, indem Sie Analysieren auswählen und Messungen setzen, um Flächen- und Mittelgrauwert einzubeziehen.

Wählen Sie Analysieren und Analysieren von Partikeln, um die minimale Zellgröße basierend auf den beobachteten Zelldimensionen zu bestimmen und die mittlere Intensität des segmentierten Signals innerhalb des ROI der Zellmonoschicht zu messen. Geben Sie den reaktiven Sauerstoff-Spezies-Wert für jede experimentelle Bedingung als Mittelwert der gemessenen Werte an, die aus mindestens drei zufällig ausgewählten Sichtfeldern pro Chip abgeleitet sind. Geben Sie die quantitativen Ergebnisse in Datenanalyse- und Grafiksoftware ein.

Bestimmen Sie die statistische Signifikans, indem Sie experimentelle Gruppen mit der Kontrollgruppe mittels einer zweiseitigen Varianzanalyse vergleichen, gefolgt von einem Tukey-Post-hoc-Test mit einem Signifikanzniveau von 0,05. Verwenden Sie die Software zur Analyse und erstellen Sie Diagramme mit Fehlerbalken, die die Standardabweichung darstellen. Repräsentative Fluoreszenzbilder zeigten einen hohen Anteil an lebensfähigen Zellen in allen Gruppen mit vernachlässigbarem Zelltod, der in normaler Glukose und normaler Glukose mit pulsatiler Scherstressgruppen beobachtet wurde, während die oszillatorische Glukose und oszillatorische Glukose mit pulsatilen Scherstressgruppen einen sichtbaren Anstieg toter Zellen zeigten.

Quantitative Analysen zeigten, dass die oszillierende Glukoseexposition zu einer signifikanten Verringerung der Zelllebensfähigkeit im Vergleich zur Kontrollgruppe führte und die Anwendung von pulsierendem Scherstress unter oszillatorischen Glukosebedingungen die Lebensfähigkeit im Vergleich zur oszillierenden Glukose allein signifikant erhöhte. Unter normalen Glukosebedingungen waren die intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies niedrig und wurden nach Anwendung von Scherspannung weiter reduziert. Während oszillatorische Glukosebedingungen eine deutliche Zunahme der Intensität der roten Fluoreszenzintensität verursachten, was auf erhöhte reaktive Sauerstoffspezies hinweist.

Der oszillatorische Glukose-induzierte Anstieg der intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies wurde nach Anwendung von Scherspannung reduziert. Quantitative Analysen zeigten, dass Scherstress unter normalen Glukosebedingungen die Konzentrationen reaktiver Sauerstoffspezies signifikant reduzierte. Im Gegensatz dazu führten oszillatorische Glukosebedingungen zu einem signifikanten Anstieg der reaktiven Sauerstoffspezies im Vergleich zu normaler Glukose.

Darüber hinaus senkte der Scherstress die Werte der reaktiven Sauerstoffspezies erheblich, selbst unter oszillatorischen Glukosebedingungen. Dieses Protokoll ermöglicht die Quantifizierung von ROS-Werten und der Zellverfügbarkeit, um die endotheliale Dysfunktion unter oszillatorischer Hyperglykämie und pulsatiler Scherspannung zu untersuchen. Nach diesem Verfahren kann molekulare Analysen wie der NRF2-Weg oder iNOS-Signalgebung durchgeführt werden, um endotheliale Schutzmechanismen zu enukleieren.

Zukünftige Studien könnten dieses System nutzen, um mechanobiologische Signalwege zu erforschen, die Strömungsgeometrien zu stören oder glatte Muskelzellen zu kokultivieren.